Summary

Robuste Differenzierung von humanen iPS-Zellen in eine reine Population von Adipozyten zur Untersuchung von Adipozyten-assoziierten Erkrankungen

Published: February 09, 2022
doi:

Summary

Das Protokoll ermöglicht die Erzeugung einer reinen Adipozytenpopulation aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs). Retinsäure wird verwendet, um iPS-Zellen in mesenchymale Stammzellen (MSCs) zu differenzieren, die für die Produktion von Adipozyten verwendet werden. Anschließend wird ein Sortieransatz auf Basis der Nilrotfärbung verwendet, um reine Adipozyten zu erhalten.

Abstract

Jüngste Fortschritte in der Technologie der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) haben die Erzeugung verschiedener Zelltypen, einschließlich Adipozyten, ermöglicht. Die derzeitigen Differenzierungsmethoden haben jedoch eine geringe Effizienz und erzeugen keine homogene Population von Adipozyten. Hier umgehen wir dieses Problem, indem wir eine all-trans-retinische Methode verwenden, um mesenchymale Stammzellen (MSCs) in hoher Ausbeute herzustellen. Durch die Regulierung von Signalwegen, die die Zellproliferation, das Überleben und die Adhäsion steuern, ermöglicht unsere Differenzierungsstrategie die effiziente Erzeugung von embryonalen Körperchen (EBs), die sich zu einer reinen Population multipotenter MSCs differenzieren. Die hohe Anzahl von MSCs, die durch diese Methode erzeugt werden, bietet eine ideale Quelle für die Bildung von Adipozyten. Die Heterogenität der Proben, die sich aus der Differenzierung von Adipozyten ergibt, bleibt jedoch eine Herausforderung. Daher haben wir eine Nilrot-basierte Methode zur Reinigung lipidhaltiger reifer Adipozyten mit FACS verwendet. Diese Sortierstrategie ermöglichte es uns, eine zuverlässige Methode zur Modellierung von Adipozyten-assoziierten Stoffwechselstörungen unter Verwendung eines Pools von Adipozyten mit reduzierter Probenheterogenität und verbesserter Zellfunktionalität zu etablieren.

Introduction

Mesenchymale Stammzellen (MSCs) fungieren als effektive transitorische Ressource für die Produktion von Zellen mesodermalen Ursprungs wie Adipozyten, Osteozyten und Chondrozyten, die für die Modellierung ihrer jeweiligen genetischen Erkrankungen verwendet werden könnten. Bisherige Ansätze beruhten jedoch auf der Gewinnung dieser MSCs aus adulten Geweben 1, was die Herausforderung mit sich brachte, sie in großer Zahl von den Spendern zu erhalten, und die Einschränkung der funktionellen Lebensfähigkeit unter suboptimalen In-vitro-Kulturbedingungen mit sich brachte 1,2. Diese Hindernisse haben zu einem großen Bedarf an einem Protokoll für die Herstellung von MSCs in vitro geführt. Humane induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) können als wertvolle Quelle für MSCs verwendet werden, die MSC-Eigenschaften aufweisen 3,4,5. Aus iPS-Zellen gewonnene MSCs können als therapeutische Option bei verschiedenen Krankheiten eingesetzt werden. Auch die Fähigkeit von aus iPS-Zellen gewonnenen MSCs, Adipozyten zu erzeugen, macht sie zu einem wertvollen In-vitro-Humanmodell zur Untersuchung von menschlicher Adipogenese, Fettleibigkeit und Adipozyten-assoziierten Erkrankungen.

Die derzeitigen Differenzierungsprotokolle von Adipozyten können in zwei Gruppen eingeteilt werden, wobei die eine die Differenzierung der Adipozyten unter Verwendung chemischer oder proteinbasierter Cocktails beinhaltet, die eine resultierende Ausbeute von 30%-60%6,7,8,9 ergeben, während die andere genetische Manipulation zur robusten Induktion von Schlüsseltranskriptionsfaktoren, die die Entwicklung von Adipozyten steuern, beinhaltet, um eine Ausbeute von 80%-90% zu erzielen10. 11. Sonstiges Die genetische Manipulation rekapituliert jedoch nicht den natürlichen Prozess der Adipozytendifferenzierung und verschleiert oft die subtilen Paradigmen, die während der Adipogenese auftreten, was sie für die Modellierung von Krankheiten unwirksam macht12,13. Daher stellen wir eine Möglichkeit vor, chemisch gewonnene reife Adipozyten von unreifen zu sortieren, indem lipidtragende Adipozyten fluoreszenzartig mit Nilrot markiert werden.

In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll vor, das die transiente Inkubation von iPS-abgeleiteten Embryoidkörpern (EBs) mit all-trans-Retinsäure beinhaltet, um eine große Anzahl schnell proliferierender MSCs zu produzieren, die zur Erzeugung von Adipozyten verwendet werden könnten14. Wir stellen auch eine Möglichkeit vor, chemisch gewonnene reife Adipozyten aus dem heterogenen Differenzierungspool zu sortieren, indem ihre Lipidtröpfchen mit einem lipophilen Farbstoff fluoreszenzmarkiert werden. Nilrot. Dies würde es ermöglichen, eine reine Population reifer Adipozyten mit verbesserter Funktionalität zu erzeugen, um Adipozyten-assoziierte Stoffwechselstörungen genau zu modellieren.

Protocol

Die Studie wurde von der zuständigen institutionellen Forschungsethikkommission genehmigt und nach den ethischen Standards durchgeführt, wie sie in der Deklaration von Helsinki von 1964 und ihren späteren Änderungen oder vergleichbaren ethischen Standards festgelegt sind. Das Protokoll wurde vom Institutional Review Board (IRB) der HMC (Nr. 16260/16) und QBRI (Nr. 2016-003) genehmigt. Diese Arbeit ist auch für hES-Zellen wie H1 und H9 optimiert. Die Blutproben wurden von gesunden Personen mit vollständiger Einverst…

Representative Results

Schematische Darstellung und Morphologie von Zellen während der mesenchymalen Differenzierung: Die Differenzierung von iPS-Zellen in MSCs umfasst verschiedene Entwicklungsstadien, die sich über EB-Bildung, MSC-Differenzierung und MSC-Expansion erstrecken (Abbildung 1). Während dieser Entwicklungsstadien erhalten die Zellen aufgrund der verschiedenen stimulierenden Chemikalien, denen sie ausgesetzt sind, eine unterschiedliche Morphologie. Nach Beginn der Differenzierung werden die Zellen i…

Discussion

Dieses Protokoll ist von größter Bedeutung, da es in der Lage ist, MSCs mit hoher Ausbeute und Effizienz zu liefern. Diese Massenproduktion von MSCs wurde durch die transiente Inkubation von iPSCs-abgeleiteten EBs mit 10 μM RA14,15 ermöglicht. Die transiente Behandlung mit 10 μM RA erhöhte die MSC-Ausbeute um das 11,2- bis 1542-fache14,15, wobei dieses Protokoll sowohl auf iPS-Zellen als auch auf hP…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss des Qatar National Research Fund (QNRF) finanziert (Fördernummer NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi wurde durch ein GSRA-Stipendium des Qatar National Research Fund (QNRF) unterstützt.

Materials

Adiponectin Abcam ab22554 Adipocyte maturation marker
anti-CD105 BD Pharmingen 560839 MSC differentiation marker
anti-CD14 BD Pharmingen 561712 MSC differentiation marker
anti-CD19 BD Pharmingen 555415 MSC differentiation marker
anti-CD34 BD Pharmingen 555824 MSC differentiation marker
anti-CD44 abcam ab93758 MSC differentiation marker
anti-CD45 BD Pharmingen
560975
MSC differentiation marker
anti-CD73 BD Pharmingen 550256 MSC differentiation marker
anti-CD90 BD Pharmingen 555596 MSC differentiation marker
bFGF R&D 233-FP MSC culture media supplement
C/EBPA Abcam ab40761 Adipocyte maturation marker
Dexamethasone Torics 1126 Adipocyte differentiation media supplement
FABP4 Abcam ab93945 Adipocyte maturation marker
Fetal bovine serum ThermoFisher 10082147 MSC culture media supplement
Glutamax ThermoFisher 35050-061 MSC culture media supplement
IBMX Sigma Aldrich I5879 Adipocyte differentiation media supplement
Indomethacin Sigma Aldrich I7378 Adipocyte differentiation media supplement
Insulin Sigma Aldrich 91077C Adipocyte differentiation media supplement
Knockout DMEM ThermoFisher 12660012 Basal media for preparing matrigel
Low glucose DMEM ThermoFisher 11885084 MSC culturing media
Matrigel Corning 354230 Coating matrix
MEM-alpha ThermoFisher 12561056 Adipocyte differentiation media
Nilered Sigma Aldrich 19123 Sorting marker for adipocyte
Penicillin ThermoFisher 15140122 MSC/Adipocyte media supplement
Phosphate-buffered saline ThermoFisher 14190144 wash buffer
Pierce™ 20X TBS Buffer Thermo Fisher 28358 wash buffer
PPARG Cell Signaling Technology 2443 Adipocyte maturation marker
ReLeSR Stem Cell Technologies 5872 Dissociation reagent
Retinoic acid Sigma Aldrich R2625 MSC differentiation media supplement
Rock inhibitor Tocris 1254/10 hPSC culture media supplement
Roziglitazone Sigma Aldrich R2408 Adipocyte differentiation media supplement
StemFlex ThermoFisher A334901 hPSC culture media
Triton Thermo Fisher 28314 Permebealization reagent
Trypsin ThermoFisher 25200072 Dissociation reagent
Tween 20 Sigma Aldrich P7942 Wash buffer

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Citar este artigo
Aghadi, M., Karam, M., Abdelalim, E. M. Robust Differentiation of Human iPSCs into a Pure Population of Adipocytes to Study Adipocyte-Associated Disorders. J. Vis. Exp. (180), e63311, doi:10.3791/63311 (2022).

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