Создание электрофизиологической платформы для моделирования БАС с регионально-специфическими человеческими плюрипотентными астроцитами и нейронами, полученными из стволовых клеток
Summary
Описан метод дифференциации индуцированных человеком плюрипотентных астроцитов и нейронов спинного мозга и их кокультуры для электрофизиологической записи.
Abstract
Человеческие плюрипотентные астроциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-A) и нейроны (hiPSC-N), обеспечивают мощный инструмент для моделирования патофизиологии бокового амиотрофического склероза (БАС) in vitro. Записи многоэлектродной решетки (MEA) являются средством регистрации потенциалов электрического поля от больших популяций нейронов и анализа сетевой активности с течением времени. Ранее было продемонстрировано, что наличие hiPSC-A, которые дифференцируются с использованием методов продвижения фенотипа астроцитов спинного мозга, улучшает созревание и электрофизиологическую активность регионально специфических hiPSC-моторных нейронов спинного мозга (MN) по сравнению с теми, которые культивируются без hiPSC-A или в присутствии астроцитов грызунов. Здесь описан метод совместного культивирования спинного мозга hiPSC-A с hiPSC-MN и регистрации электрофизиологической активности с использованием записей MEA. В то время как протоколы дифференцировки, описанные здесь, характерны для астроцитов и нейронов, которые регионально специфичны для спинного мозга, платформа кокультурирования может быть применена к астроцитам и нейронам, дифференцированным с помощью методов, специфичных для других судеб, включая корковый hiPSC-A и hiPSC-N. Эти протоколы направлены на предоставление электрофизиологического анализа для информирования о взаимодействиях глиа-нейронов и обеспечения платформы для тестирования лекарств с терапевтическим потенциалом при БАС.
Introduction
Человеческие плюрипотентные астроциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-A) и нейроны (hiPSC-N), являются мощными инструментами для моделирования патофизиологии бокового амиотрофического склероза (БАС) in vitro и обеспечивают трансляционную парадигму для стратегий открытия лекарств1. Исследователи продемонстрировали, что кокультура hiPSC-A с hiPSC-N усиливает морфологическое, молекулярное, электрофизиологическое и фармакологическое созревание обоих типов клеток, генерируя сложные нейронные сети и взаимодействия астроцитов и нейронов, которые напоминают их аналоги in vivo 2,3. Подобные эксперименты с кокультурой могут повторить признаки патобиологии БАС, такие как астроцитарно-опосредованная нейротоксичность 4,5 и нейрональная гипервозбудимость6. Кроме того, благодаря достижениям в протоколах дифференцировки, индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (hiPSC) могут быть дифференцированы в регионально-специфические нервные подтипы, включая кортикальный и спинной мозг hiPSC-A и hiPSC-N 7,8. Эти стратегии обеспечивают потенциал для моделирования патологии кортикальных и спинальных двигательных нейронов при БАС, а также астроцитарного влияния на оба. Однако для этого требуется воспроизводимый функциональный анализ для определения этих эффектов.
Недавно было показано, что запись многоэлектродной решетки (МЭА) особенно подходит для электрофизиологической характеристики нейрон-астроцитарных кокультур2. В отличие от одноклеточных электрофизиологических анализов, эти электродные массивы высокой плотности пассивно регистрируют потенциалы внеклеточного поля от больших популяций нейронов, не нарушая условия культивирования и сохраняя целостность клеточных мембран. Эти платформы особенно полезны для записи клеточной и сетевой активности культур с течением времени и в ответ на фармакологические манипуляции. Наконец, когда присутствие астроцитов является переменной культуры, записи MEA могут обеспечить функциональное понимание двунаправленных взаимодействий астроцитов и нейронов 2,9.
Здесь представлен оптимизированный протокол для дифференциации hiPSC в hiPSC-A спинного мозга и hiPSC-моторные нейроны (MN), который был ранее проверен2. Протокол дифференцировки hiPSC-A спинного мозга последовательно приводит к культурам астроцитов, которые являются положительными для S100 кальций-связывающего белка B (S100β), глиального фибриллярного кислого белка (GFAP) и гомеобокса B4 (HOXB4) в 80%, 50% и 90% клеток соответственно, что указывает на созревание глиального и спинного мозга 2,10 . Протокол дифференцировки hiPSC-MN генерирует нейроны, которые >90% положительны для холина ацетилтрансферазы (ChAT), что наводит на мысль о зрелой идентичности альфа-моторных нейронов2. Кроме того, протокол описывает методы генерации кокультур hiPSC-A/MN, которые, как было ранее продемонстрировано, приводят к появлению нейронов с повышенной морфологической сложностью с помощью анализа Шолля и иммунофлуоресцентной микроскопии по сравнению с нейронными культурами без астроцитов или с астроцитами грызунов2. Хотя эти описания специфичны для спинного мозга hiPSC-A и hiPSC-N, уникальное преимущество заключается в том, что первоначальная независимая культура астроцитов и нейронов, за которой следуют шаги по совместной культивированию в более поздние моменты времени, может быть переведена для изучения эффектов взаимодействия нейронов-астроцитов из других конкретных областей, а также специфических для заболевания клеток 7,8 . Наконец, протокол описывает, как выращивать эти культуры на пластинах MEA, чтобы функциональная активность как фактор состава кокультуры могла быть изучена с течением времени с возможностью манипулировать клеточным составом, а также условиями культуры.
Целью этих протоколов является предоставление функционального анализа для исследования взаимодействий астроцитов и нейронов, изучения специфических для заболевания изменений и тестирования лекарств с терапевтическим потенциалом в области БАС. Видеоинструкции приведены для наиболее сложных шагов этого протокола.
Protocol
Representative Results
Discussion
На сегодняшний день методы электрофизиологических записей кокультур астроцитарных нейронов на основе hiPSC и MEA нашли ограниченное применение в области ALS6 и до сих пор не полностью человеческие платформы, в отличие от их более широкого использования для моделирования эпи…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта рукопись была поддержана следующим: 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH/NINDS (CWH), 2020 Премия за развитие карьеры клинического ученого Благотворительного фонда Дорис Дьюк (CWH). 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). Мы благодарим д-ра Раху Дастгейба и д-ра Нормана Хоги за предоставление платформы MEA и программного обеспечения для анализа данных, которое мы использовали для проверки описанной электрофизиологической платформы. Мы хотели бы поблагодарить Халила Руста за помощь в демонстрации протокола и съемках.
Materials
| 10 cm sterile culture plates | Falcon | 353003 | |
| 25 cm2 sterile culture flasks | Falcon | 353136 | |
| 2-Mercaptoethanol (β-ME) | Thermofisher | 21985023 | Working concentration 110 µM |
| 500 mL 0.2 µm CA Filter System | Corning | 430769 | |
| 5 mL pipette | Falcon | 357543 | |
| 6 well sterile culture plates | Falcon | 3046 | |
| Amphotericine B | Gibco | 15290018 | Working concentration 2.0 μg/mL |
| Anionic detergent with protease enzyme – Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Working concentration 1% m/v |
| Ascorbic acid (ASAC) | Sigma | A4403 | Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL). |
| Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W) | Axion | OPT-24 | |
| Axion Edge MEA platform | Axion | Maestro Edge | |
| Basement Membrane matrix – Matrigel | Corning | 354277 | Details in the protocol |
| Benchtop microscope (sterile under cell culture hood) | Zeiss | 415510-1100-000 | Primo Vert |
| Bicuculline | Sigma Aldrich | 14340 | Working concentration10 μM |
| Ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| CO2 tanks and regulator for Axion Edge | AirGas/Harris | 9296NC | |
| Compound E | Abcam | ab142164 | Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM). |
| Cyanquixaline (CNQX) | Sigma Aldrich | C239 | Working concentration 50 μM |
| Dihydrokainic acid (DHK) | Tocris | 111 | Working concentration 50 μM and 300 μM |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 113300 | Working concentration 1x |
| Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement | Thermofisher | A1517001 | Combine 10 mL of Essential 8 (10x) supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermofisher | 16140071 | Working concentration 1x |
| Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF) | Peprotech | 450-10 | Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Hemocytometer | Election Microscopy Sciences | 63510-20 | |
| Heparin | Millipore-sigma | H3149-100KU | Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL). |
| Humidity controlled Cell culture incubator | ThermoFisher | 370 | set to 37 ºC, 5 % CO2 |
| Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) | R&D systems | 291-G1-200 | Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Kainc acid | Abcam | ab144490 | Working concentration 5 μM |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Thermofisher | 10828 | Working concentration 1x |
| Laminin | Thermofisher | 23017-015 | Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media) |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution |
| L-Glutamine | Thermofisher | 25030 | Working concentration 100x |
| MEA glass plates | MultiChannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti-gr | |
| Multichannel Pipet P200 | Gilson | PJ22224 | |
| Neurobasal | Thermofisher | 21103049 | Working concentration 1x |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermofisher | 11140050 | Working concentration 100x |
| Pencillin/Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | Working concentration 100x |
| Polyornithine (PLO) | Sigma-Aldrich | P3655 | Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL) |
| Potassium chloride (KCl) | NA | NA | Working concentration100 mM |
| Purmorphamine (PMN) | Millipore-Sigma | 540223 | Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM). |
| Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM). |
| ROCK-I nhibitor | Peprotech | 1293823 | Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM). |
| SB431542 | Sigma | S4317 | Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM) |
| Sterile cell culture hoods | Baker Company | SG-600 | |
| Supplement B – B27 Supplement | Thermofisher | 21985023 | Working concentration 50x |
| Supplement N – N2 Supplement | Thermofisher | 17502048 | Working concentration 100x |
| Table top cell culture centrifuge | ThermoFisher | 75004261 | Sorvall Legend X1R |
| Thermoplastic film – Parafilm | PARAFILM | P7793 | |
| Tissue dissociation protease – Dispase | StemCell Technologies | 7923 | Working concentration 1x |
| Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL). |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher | 2530054 | Working concentration 1x |
| Waterbath | ThermoFisher | 2332 | Isotemp |
Referências
- Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets. Neuroscience Letters. 755, 135911 (2021).
- Taga, A., et al. Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system. Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).
- Klapper, S. D., et al. Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks. Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).
- Zhao, C., et al. Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology. Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).
- Almad, A. A., et al. Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).
- Wainger, B. J., et al. Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons. Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).
- Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders. Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).
- Imaizumi, K., et al. Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).
- Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system. Scientific Reports. 8 (1), 10416 (2018).
- Haidet-Phillips, A. M., et al. Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment. Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).
- Roybon, L., et al. Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes. Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).
- Shimojo, D., et al. simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
- Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).
- Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
- Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
- Liu, H., Zhang, S. C. Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).
- Borghese, L., et al. Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo. Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).
- Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).
