지역별 인간 만능줄기세포 유래 성상세포 및 뉴런을 이용한 ALS 모델링을 위한 전기생리학적 플랫폼 구축
Summary
우리는 척수 인간 유도 만능 유래 성상 세포와 뉴런을 구별하는 방법과 전기 생리 학적 기록을위한 이들의 공동 배양을 설명합니다.
Abstract
인간 만능 줄기세포 유래 성상세포(hiPSC-A) 및 뉴런(hiPSC-N)은 시험관 내에서 근위축성 측삭 경화증(ALS) 병태생리학을 모델링하기 위한 강력한 도구를 제공합니다. 다중 전극 어레이(MEA) 기록은 대규모 뉴런 집단의 전기장 전위를 기록하고 시간 경과에 따른 네트워크 활동을 분석하는 수단입니다. 척수 성상 세포 표현형을 촉진하는 기술을 사용하여 분화되는 hiPSC-A의 존재가 hiPSC-A없이 배양되거나 설치류 성상 세포가있는 상태에서 배양 된 것과 비교할 때 국소 특이 적 척수 hiPSC- 운동 뉴런 (MN)의 성숙 및 전기 생리 학적 활성을 향상 시킨다는 것이 이전에 입증되었습니다. 여기에 설명된 것은 척수 hiPSC-A를 hiPSC-MN과 공동 배양하고 MEA 기록을 사용하여 전기생리학적 활성을 기록하는 방법입니다. 여기에 설명된 분화 프로토콜은 척수에 지역적으로 특이적인 성상세포 및 뉴런에 특화된 반면, 공동 배양 플랫폼은 피질 hiPSC-A 및 hiPSC-N을 포함한 다른 운명에 특정한 기술로 분화된 성상세포 및 뉴런에 적용될 수 있습니다. 이 프로토콜은 신경교-뉴런 상호 작용에 대해 알리고 ALS에서 치료 가능성이 있는 약물을 테스트하기 위한 플랫폼을 제공하기 위한 전기생리학적 분석을 제공하는 것을 목표로 합니다.
Introduction
인간 만능줄기세포 유래 성상교세포(hiPSC-A) 및 뉴런(hiPSC-N)은 시험관 내에서 근위축성 측삭 경화증(ALS) 병태생리학을 모델링하기 위한 강력한 도구이며 약물발견 전략을 위한 번역 패러다임을 제공합니다1. 연구자들은 hiPSC-A와 hiPSC-N의 공동 배양이 두 세포 유형의 형태학적, 분자적, 전기생리학적 및 약리학적 성숙을 향상시켜 복잡한 뉴런 네트워크와 생체 내 대응물과 유사한 성상세포-뉴런 상호작용을 생성한다는 것을 입증했습니다2,3. 유사한 공동 배양 실험은 성상 세포 매개 신경 독성 4,5 및 신경 과흥분성6과 같은 ALS 병리학의 특징을 요약할 수 있습니다. 또한 분화 프로토콜의 발전으로 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC)는 피질 및 척수 hiPSC-A 및 hiPSC-N 7,8을 포함한 지역 별 신경 아형으로 분화 될 수 있습니다. 이러한 전략은 ALS에서 피질 및 척추 운동 뉴런 병리를 모델링 할 수있는 잠재력을 제공 할뿐만 아니라 성상 세포 영향 모두에 대한 성상 세포 영향을 제공합니다. 그러나 이를 위해서는 이러한 효과를 결정하기 위한 재현 가능한 기능 분석이 필요합니다.
최근에는 다중 전극 어레이 (MEA) 기록이 뉴런-성상 세포 공동 배양의 전기 생리 학적 특성화에 특히 적합하다는 것이 밝혀졌습니다2. 단일 세포 전기생리학적 분석과 달리 이러한 고밀도 전극 어레이는 배양 조건을 방해하고 세포막의 무결성을 보존하지 않고 대규모 뉴런 집단의 세포외 전위를 수동적으로 기록합니다. 이러한 플랫폼은 시간이 지남에 따라 그리고 약리학적 조작에 대한 반응으로 배양물의 세포 및 네트워크 활동을 기록하는 데 특히 유용합니다. 마지막으로, 성상 세포의 존재가 배양 변수 인 경우 MEA 기록은 성상 세포-뉴런 양방향 상호 작용에 대한 기능적 통찰력을 제공 할 수 있습니다 2,9.
여기에 제시된 것은 hiPSC를 척수 hiPSC-A 및 hiPSC- 운동 뉴런 (MN)으로 분화하기위한 최적화 된 프로토콜입니다 이전에 검증 된2. 척수 hiPSC-A 분화 프로토콜은 각각 세포의 최대 80%, 50% 및 90%에서 S100 칼슘 결합 단백질 B(S100β), 신경교섬유소 산성 단백질(GFAP) 및 호메오박스 B4(HOXB4)에 대해 양성인 성상세포 배양을 일관되게 초래하여 성숙 신경교 및 척수 사양 2,10을 나타냅니다. . hiPSC-MN 분화 프로토콜은 콜린 아세틸 트랜스퍼 라제 (ChAT)에 대해 >90 % 양성인 뉴런을 생성하며, 이는 성숙한 알파 운동 뉴런 정체성2을 암시합니다. 또한, 이 프로토콜은 성상세포가 없거나 설치류 성상세포2가 있는 뉴런 배양과 비교할 때 Scholl 분석 및 면역형광 현미경에 의해 향상된 형태학적 복잡성을 갖는 뉴런을 생성하는 것으로 이전에 입증된 hiPSC-A/MN 공동 배양의 생성 기술을설명합니다. 이러한 설명은 척수 hiPSC-A 및 hiPSC-N에 특이적이지만, 독특한 이점은 성상 세포와 뉴런의 초기 독립 배양에 이어 이후 시점에서 공동 배양하는 단계가 다른 특정 영역뿐만 아니라 질병 특이 적 세포로부터의 뉴런-성상 세포 상호 작용의 효과를 연구하도록 번역 될 수 있다는 것입니다 7,8 . 마지막으로, 프로토콜은 MEA 플레이트에서 이러한 배양을 성장시키는 방법을 설명하여 공동 배양 조성물의 인자로서의 기능적 활성이 세포 조성 및 배양 조건을 조작하는 능력으로 시간이 지남에 따라 연구될 수 있도록 합니다.
이러한 프로토콜의 목표는 성상 세포-뉴런 상호 작용을 조사하고, 질병 특이적 변화를 조사하고, ALS 분야에서 치료 가능성이 있는 약물을 테스트하기 위한 기능 분석을 제공하는 것입니다. 이 프로토콜의 가장 어려운 단계에 대한 비디오 지침이 제공됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재까지, 성상 세포-뉴런 공동 배양의 전기생리학적 기록을 위한 hiPSC- 및 MEA-기반 방법은 간질9의 시험관 내 모델링에 대한 보다 광범위한 사용과 대조적으로, ALS6 분야에서 제한적인 적용을 발견하였으며, 여전히 완전한 인간 플랫폼에서는 그렇지 않다. 그러나 이 플랫폼은 신경 과흥분성의 메커니즘, 신경독성에 대한 성상세포의 기여 또는 질병 진행?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 원고는 2019 MSCRFF 5119 (AT)에 의해 지원되었습니다. K08NS102526 NIH / NINDS (CWH), 2020 도리스 듀크 자선 재단 임상 과학자 경력 개발 상 (CWH). 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). 설명된 전기생리학적 플랫폼을 검증하는 데 활용한 MEA 플랫폼 및 데이터 분석 소프트웨어를 제공한 Raha Dastgheyb 박사와 Norman Haughey 박사에게 감사드립니다. 프로토콜 시연 및 촬영에 도움을 주신 Khalil Rust에게 감사드립니다.
Materials
| 10 cm sterile culture plates | Falcon | 353003 | |
| 25 cm2 sterile culture flasks | Falcon | 353136 | |
| 2-Mercaptoethanol (β-ME) | Thermofisher | 21985023 | Working concentration 110 µM |
| 500 mL 0.2 µm CA Filter System | Corning | 430769 | |
| 5 mL pipette | Falcon | 357543 | |
| 6 well sterile culture plates | Falcon | 3046 | |
| Amphotericine B | Gibco | 15290018 | Working concentration 2.0 μg/mL |
| Anionic detergent with protease enzyme – Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Working concentration 1% m/v |
| Ascorbic acid (ASAC) | Sigma | A4403 | Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL). |
| Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W) | Axion | OPT-24 | |
| Axion Edge MEA platform | Axion | Maestro Edge | |
| Basement Membrane matrix – Matrigel | Corning | 354277 | Details in the protocol |
| Benchtop microscope (sterile under cell culture hood) | Zeiss | 415510-1100-000 | Primo Vert |
| Bicuculline | Sigma Aldrich | 14340 | Working concentration10 μM |
| Ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| CO2 tanks and regulator for Axion Edge | AirGas/Harris | 9296NC | |
| Compound E | Abcam | ab142164 | Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM). |
| Cyanquixaline (CNQX) | Sigma Aldrich | C239 | Working concentration 50 μM |
| Dihydrokainic acid (DHK) | Tocris | 111 | Working concentration 50 μM and 300 μM |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 113300 | Working concentration 1x |
| Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement | Thermofisher | A1517001 | Combine 10 mL of Essential 8 (10x) supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermofisher | 16140071 | Working concentration 1x |
| Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF) | Peprotech | 450-10 | Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Hemocytometer | Election Microscopy Sciences | 63510-20 | |
| Heparin | Millipore-sigma | H3149-100KU | Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL). |
| Humidity controlled Cell culture incubator | ThermoFisher | 370 | set to 37 ºC, 5 % CO2 |
| Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) | R&D systems | 291-G1-200 | Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Kainc acid | Abcam | ab144490 | Working concentration 5 μM |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Thermofisher | 10828 | Working concentration 1x |
| Laminin | Thermofisher | 23017-015 | Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media) |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution |
| L-Glutamine | Thermofisher | 25030 | Working concentration 100x |
| MEA glass plates | MultiChannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti-gr | |
| Multichannel Pipet P200 | Gilson | PJ22224 | |
| Neurobasal | Thermofisher | 21103049 | Working concentration 1x |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermofisher | 11140050 | Working concentration 100x |
| Pencillin/Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | Working concentration 100x |
| Polyornithine (PLO) | Sigma-Aldrich | P3655 | Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL) |
| Potassium chloride (KCl) | NA | NA | Working concentration100 mM |
| Purmorphamine (PMN) | Millipore-Sigma | 540223 | Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM). |
| Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM). |
| ROCK-I nhibitor | Peprotech | 1293823 | Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM). |
| SB431542 | Sigma | S4317 | Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM) |
| Sterile cell culture hoods | Baker Company | SG-600 | |
| Supplement B – B27 Supplement | Thermofisher | 21985023 | Working concentration 50x |
| Supplement N – N2 Supplement | Thermofisher | 17502048 | Working concentration 100x |
| Table top cell culture centrifuge | ThermoFisher | 75004261 | Sorvall Legend X1R |
| Thermoplastic film – Parafilm | PARAFILM | P7793 | |
| Tissue dissociation protease – Dispase | StemCell Technologies | 7923 | Working concentration 1x |
| Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL). |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher | 2530054 | Working concentration 1x |
| Waterbath | ThermoFisher | 2332 | Isotemp |
Referências
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