הקמת פלטפורמה אלקטרופיזיולוגית למידול ALS עם אסטרוציטים ונוירונים פלוריפוטנטיים פלוריפוטנטיים אנושיים ספציפיים לאזור
Summary
אנו מתארים שיטה להבדיל בין אסטרוציטים ונוירונים שמקורם בחוט השדרה לבין אסטרוציטים ותאי עצב שמקורם בחוט השדרה, ואת התרבות המשותפת שלהם לצורך רישום אלקטרופיזיולוגי.
Abstract
אסטרוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hiPSC-A) ונוירונים (hiPSC-N) מספקים כלי רב עוצמה למידול פתופיזיולוגיה של טרשת אמיוטרופית צידית (ALS) במבחנה. רישומי מערך מרובה אלקטרודות (MEA) הם אמצעי להקליט פוטנציאלים של שדות חשמליים מאוכלוסיות גדולות של תאי עצב ולנתח את פעילות הרשת לאורך זמן. בעבר הוכח כי נוכחותם של hiPSC-A המובחנים באמצעות טכניקות לקידום פנוטיפ אסטרוציטים של חוט השדרה שיפרה את ההבשלה ואת הפעילות האלקטרופיזיולוגית של נוירונים מוטוריים hiPSC-motor (MN) ספציפיים לחוט השדרה בהשוואה לאלה שגודלו בתרבית ללא hiPSC-A או בנוכחות אסטרוציטים מכרסמים. מתוארת כאן שיטה לתרבית משותפת של חוט השדרה hiPSC-A עם hiPSC-MN ולהקליט פעילות אלקטרופיזיולוגית באמצעות רישומי MEA. בעוד שפרוטוקולי ההתמיינות המתוארים כאן הם ייחודיים לאסטרוציטים ונוירונים ספציפיים לאזור חוט השדרה, פלטפורמת הרבייה המשותפת יכולה להיות מיושמת על אסטרוציטים ונוירונים המובחנים בטכניקות ספציפיות לגורלות אחרים, כולל hiPSC-A קליפת המוח ו- hiPSC-N. פרוטוקולים אלה נועדו לספק בדיקה אלקטרופיזיולוגית כדי ליידע על אינטראקציות גליה-נוירון ולספק פלטפורמה לבדיקת תרופות עם פוטנציאל טיפולי ב- ALS.
Introduction
אסטרוציטים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hiPSC-A) ונוירונים (hiPSC-N) הם כלים רבי עוצמה למידול פתופיזיולוגיה של טרשת אמיוטרופית צידית (ALS) במבחנה ומספקים פרדיגמה תרגומית לאסטרטגיות גילוי תרופות1. חוקרים הוכיחו כי התרבית המשותפת של hiPSC-A עם hiPSC-N משפרת את ההבשלה המורפולוגית, המולקולרית, האלקטרופיזיולוגית והפרמקולוגית של שני סוגי התאים, ויוצרת רשתות עצביות מורכבות ואינטראקציות אסטרוציטים-נוירונים הדומות לעמיתיהם in vivo 2,3. ניסויים דומים בתרבית משותפת יכולים לשחזר סימני היכר של פתולוגיה של ALS כגון רעילות עצבית בתיווך אסטרוציטים 4,5 ורגישות יתר עצבית6. בנוסף, עם התקדמות בפרוטוקולי התמיינות, ניתן להתמיין לתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (hiPSC) לתת-סוגים עצביים ספציפיים לאזור, כולל hiPSC-A בקליפת המוח ובחוט השדרה ו-hiPSC-N 7,8. אסטרטגיות אלה מספקות את הפוטנציאל למידול פתולוגיה של נוירונים מוטוריים בקליפת המוח ובעמוד השדרה ב- ALS, כמו גם את ההשפעה האסטרוציטית על שניהם. עם זאת, זה דורש כי יש בדיקה פונקציונלית לשחזור כדי לקבוע השפעות אלה.
לאחרונה הוכח כי רישום מערך רב-אלקטרודות (MEA) מתאים במיוחד לאפיון אלקטרופיזיולוגי של תרביות משותפות נוירון-אסטרוציטים2. בניגוד לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים חד-תאיים, מערכי אלקטרודות בצפיפות גבוהה אלה רושמים באופן פסיבי פוטנציאלים של שדות חוץ-תאיים מאוכלוסיות גדולות של תאי עצב מבלי להפריע לתנאי התרבית ולשמור על שלמות קרום התא. פלטפורמות אלה שימושיות במיוחד לתיעוד הפעילות הסלולרית והרשתית של תרביות לאורך זמן ובתגובה למניפולציה פרמקולוגית. לבסוף, כאשר נוכחות אסטרוציטים היא משתנה תרבית, רישומי MEA יכולים לספק תובנות תפקודיות לגבי אינטראקציות דו-כיווניות בין אסטרוציטיםלנוירונים 2,9.
מוצג כאן פרוטוקול אופטימלי להבחנה של hiPSC לחוט השדרה hiPSC-A ונוירונים מוטוריים hiPSC (MN) שאומת בעבר2. פרוטוקול התמיינות hiPSC-A של חוט השדרה מביא באופן עקבי לתרביות אסטרוציטים, שהן חיוביות עבור חלבון קושר סידן S100 B (S100β), חלבון חומצי גליה פיברילרי (GFAP) והומיאובוקס B4 (HOXB4) בעד 80%, 50% ו-90% מהתאים, בהתאמה, מה שמצביע על מפרט גליה וחוט שדרה מבשיל 2,10 . פרוטוקול התמיינות hiPSC-MN מייצר נוירונים חיוביים >90% עבור אצטילטרנספראז כולין (ChAT), המרמז על זהות נוירון אלפא-מוטורי בוגר2. בנוסף, הפרוטוקול מתאר טכניקות ליצירת תרביות משותפות של hiPSC-A/MN שהוכחו בעבר כגורמות לנוירונים בעלי מורכבות מורפולוגית משופרת על ידי ניתוח שול ומיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי בהשוואה לתרביות עצביות ללא אסטרוציטים או עם אסטרוציטים מכרסמים2. בעוד תיאורים אלה ספציפיים לחוט השדרה hiPSC-A ו- hiPSC-N, יתרון ייחודי הוא שניתן לתרגם את התרבית העצמאית הראשונית של אסטרוציטים ונוירונים ואחריה צעדים לתרבות משותפת בנקודות זמן מאוחרות יותר כדי לחקור את ההשפעות של אינטראקציות נוירון-אסטרוציטים מאזורים ספציפיים אחרים, כמו גם תאים ספציפיים למחלה 7,8 . לבסוף, הפרוטוקול מתאר כיצד לגדל תרביות אלה על לוחות MEA כך שניתן יהיה לחקור את הפעילות הפונקציונלית כגורם של הרכב תרבית משותפת לאורך זמן עם היכולת להשפיע על הרכב התא כמו גם על תנאי התרבית.
מטרת פרוטוקולים אלה היא לספק בדיקה פונקציונלית לחקר אינטראקציות אסטרוציטים-נוירונים, לבחון שינויים ספציפיים למחלה ולבחון תרופות בעלות פוטנציאל טיפולי בתחום ה-ALS. הוראות וידאו מסופקות עבור השלבים המאתגרים ביותר של פרוטוקול זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
עד כה, שיטות מבוססות hiPSC ו-MEA לרישומים אלקטרופיזיולוגיים של תרביות משותפות של אסטרוציטים-נוירונים מצאו יישום מוגבל בתחום ALS6 ועדיין לא בפלטפורמות אנושיות לחלוטין, בניגוד לשימוש הנפוץ יותר שלהן למידול חוץ גופי של אפילפסיה9. עם זאת, לפלטפורמה זו יש פוטנציאל לענ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
כתב יד זה נתמך על-ידי הגורמים הבאים: MSCRFF 5119 (AT) 2019. K08NS102526 NIH/NINDS (CWH), 2020 פרס פיתוח הקריירה של Doris Duke Charitable Foundation Clinical Scientist Career Development Award (CWH). 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). אנו מודים לד”ר ראהא דסטגייב ולד”ר נורמן הוהי על אספקת פלטפורמת MEA ותוכנת ניתוח הנתונים בה השתמשנו כדי לאמת את הפלטפורמה האלקטרופיזיולוגית המתוארת. ברצוננו להודות לחליל רוסט על עזרתם בהדגמת פרוטוקול ובצילומים.
Materials
| 10 cm sterile culture plates | Falcon | 353003 | |
| 25 cm2 sterile culture flasks | Falcon | 353136 | |
| 2-Mercaptoethanol (β-ME) | Thermofisher | 21985023 | Working concentration 110 µM |
| 500 mL 0.2 µm CA Filter System | Corning | 430769 | |
| 5 mL pipette | Falcon | 357543 | |
| 6 well sterile culture plates | Falcon | 3046 | |
| Amphotericine B | Gibco | 15290018 | Working concentration 2.0 μg/mL |
| Anionic detergent with protease enzyme – Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Working concentration 1% m/v |
| Ascorbic acid (ASAC) | Sigma | A4403 | Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL). |
| Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W) | Axion | OPT-24 | |
| Axion Edge MEA platform | Axion | Maestro Edge | |
| Basement Membrane matrix – Matrigel | Corning | 354277 | Details in the protocol |
| Benchtop microscope (sterile under cell culture hood) | Zeiss | 415510-1100-000 | Primo Vert |
| Bicuculline | Sigma Aldrich | 14340 | Working concentration10 μM |
| Ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| CO2 tanks and regulator for Axion Edge | AirGas/Harris | 9296NC | |
| Compound E | Abcam | ab142164 | Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM). |
| Cyanquixaline (CNQX) | Sigma Aldrich | C239 | Working concentration 50 μM |
| Dihydrokainic acid (DHK) | Tocris | 111 | Working concentration 50 μM and 300 μM |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 113300 | Working concentration 1x |
| Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement | Thermofisher | A1517001 | Combine 10 mL of Essential 8 (10x) supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermofisher | 16140071 | Working concentration 1x |
| Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF) | Peprotech | 450-10 | Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Hemocytometer | Election Microscopy Sciences | 63510-20 | |
| Heparin | Millipore-sigma | H3149-100KU | Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL). |
| Humidity controlled Cell culture incubator | ThermoFisher | 370 | set to 37 ºC, 5 % CO2 |
| Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) | R&D systems | 291-G1-200 | Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Kainc acid | Abcam | ab144490 | Working concentration 5 μM |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Thermofisher | 10828 | Working concentration 1x |
| Laminin | Thermofisher | 23017-015 | Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media) |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution |
| L-Glutamine | Thermofisher | 25030 | Working concentration 100x |
| MEA glass plates | MultiChannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti-gr | |
| Multichannel Pipet P200 | Gilson | PJ22224 | |
| Neurobasal | Thermofisher | 21103049 | Working concentration 1x |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermofisher | 11140050 | Working concentration 100x |
| Pencillin/Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | Working concentration 100x |
| Polyornithine (PLO) | Sigma-Aldrich | P3655 | Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL) |
| Potassium chloride (KCl) | NA | NA | Working concentration100 mM |
| Purmorphamine (PMN) | Millipore-Sigma | 540223 | Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM). |
| Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM). |
| ROCK-I nhibitor | Peprotech | 1293823 | Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM). |
| SB431542 | Sigma | S4317 | Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM) |
| Sterile cell culture hoods | Baker Company | SG-600 | |
| Supplement B – B27 Supplement | Thermofisher | 21985023 | Working concentration 50x |
| Supplement N – N2 Supplement | Thermofisher | 17502048 | Working concentration 100x |
| Table top cell culture centrifuge | ThermoFisher | 75004261 | Sorvall Legend X1R |
| Thermoplastic film – Parafilm | PARAFILM | P7793 | |
| Tissue dissociation protease – Dispase | StemCell Technologies | 7923 | Working concentration 1x |
| Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL). |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher | 2530054 | Working concentration 1x |
| Waterbath | ThermoFisher | 2332 | Isotemp |
Referências
- Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets. Neuroscience Letters. 755, 135911 (2021).
- Taga, A., et al. Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system. Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).
- Klapper, S. D., et al. Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks. Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).
- Zhao, C., et al. Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology. Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).
- Almad, A. A., et al. Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).
- Wainger, B. J., et al. Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons. Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).
- Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders. Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).
- Imaizumi, K., et al. Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).
- Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system. Scientific Reports. 8 (1), 10416 (2018).
- Haidet-Phillips, A. M., et al. Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment. Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).
- Roybon, L., et al. Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes. Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).
- Shimojo, D., et al. simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
- Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).
- Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
- Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
- Liu, H., Zhang, S. C. Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).
- Borghese, L., et al. Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo. Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).
- Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).
