領域特異的ヒト多能性幹細胞由来アストロサイトおよびニューロンを用いたALSモデリングのための電気生理学的基盤の確立
Summary
ヒト誘導多能性由来のアストロサイトとニューロンおよびそれらの共培養を電気生理学的記録のために脊髄に分化させる方法を記載する。
Abstract
ヒト多能性幹細胞由来のアストロサイト(hiPSC-A)およびニューロン(hiPSC-N)は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)の病態生理学 をin vitroでモデル化するための強力なツールを提供します。多電極アレイ(MEA)記録は、ニューロンの大規模な集団からの電界ポテンシャルを記録し、時間の経過に伴うネットワーク活動を分析するための手段です。脊髄星状細胞の表現型を促進する技術を用いて分化したhiPSC-Aの存在は、hiPSC-Aなしまたはげっ歯類の星状細胞の存在下で培養されたものと比較して、領域特異的な脊髄hiPSC-運動ニューロン(MN)の成熟および電気生理学的活性を改善することが以前に実証されました。ここで説明するのは、脊髄hiPSC-AをhiPSC-MNと共培養し、MEA記録を用いて電気生理学的活性を記録する方法である。ここで説明する分化プロトコルは、脊髄に地域特異的な星状細胞およびニューロンに特異的であるが、共培養プラットフォームは、皮質hiPSC-AおよびhiPSC-Nを含む他の運命に特異的な技術で分化した星状細胞およびニューロンに適用することができる。これらのプロトコルは、グリアとニューロンの相互作用について知らせるための電気生理学的アッセイを提供し、ALSの治療の可能性を秘めた薬物をテストするためのプラットフォームを提供することを目的としています。
Introduction
ヒト多能性幹細胞由来アストロサイト(hiPSC-A)およびニューロン(hiPSC-N)は、筋萎縮性側索硬化症(ALS)の病態生理学をin vitroでモデル化するための強力なツールであり、創薬戦略のトランスレーショナルパラダイムを提供します1。研究者らは、hiPSC-AとhiPSC-Nの共培養が、両方の細胞タイプの形態学的、分子的、電気生理学的、および薬理学的成熟を促進し、複雑なニューロンネットワークと、in vivo対応物に似た星状細胞-ニューロン相互作用を生成することを実証しました2,3。同様の共培養実験は、星状細胞を介した神経毒性4,5やニューロンの過剰興奮性6などのALS病理生物学の特徴を再現することができます。さらに、分化プロトコルの進歩により、ヒト人工多能性幹細胞(hiPSC)は、皮質および脊髄hiPSC-AおよびhiPSC-N 7,8を含む領域特異的な神経サブタイプに分化することができます。これらの戦略は、ALSにおける皮質および脊髄運動ニューロンの病理、ならびに両方に対する星状細胞の影響をモデル化する可能性を提供します。しかしながら、これには、これらの効果を決定するための再現可能な機能アッセイが存在することが必要である。
最近、多電極アレイ(MEA)記録がニューロン-アストロサイト共培養の電気生理学的特性評価に特に適していることが示されました2。シングルセル電気生理学的分析とは対照的に、これらの高密度電極アレイは、培養条件を破壊したり、細胞膜の完全性を維持したりすることなく、ニューロンの大規模な集団からの細胞外野電位を受動的に記録します。これらのプラットフォームは、経時的および薬理学的操作に応答して培養物の細胞およびネットワーク活性を記録するのに特に有用である。最後に、アストロサイトの存在が培養変数である場合、MEA記録はアストロサイト-ニューロンの双方向相互作用に関する機能的な洞察を提供することができます2,9。
ここで紹介するのは、以前に検証されたhiPSCを脊髄hiPSC-AおよびhiPSC運動ニューロン(MN)に分化させるための最適化されたプロトコルです2。脊髄hiPSC-A分化プロトコルは一貫して星状細胞培養をもたらし、S100カルシウム結合タンパク質B(S100β)、グリア線維性酸性タンパク質(GFAP)、およびホメオボックスB4(HOXB4)に対して陽性であり、それぞれ最大80%、50%、および90%の細胞で陽性であり、成熟グリアおよび脊髄の仕様を示しています2,10.hiPSC-MN分化プロトコルは、コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)に対して>90%陽性のニューロンを生成し、成熟したα運動ニューロンの同一性を示唆しています2。さらに、このプロトコルでは、アストロサイトなしまたはげっ歯類のアストロサイトを使用したニューロン培養と比較した場合、ショール分析および免疫蛍光顕微鏡によって形態学的複雑さが増したニューロンをもたらすことが以前に実証されたhiPSC-A/MN共培養の生成技術について説明しています2。これらの説明は脊髄hiPSC-AおよびhiPSC-Nに固有ですが、ユニークな利点は、星状細胞とニューロンの最初の独立した培養とそれに続く後の時点での共培養のステップを翻訳して、他の特定の領域および疾患特異的細胞からのニューロン-アストロサイト相互作用の影響を研究できることです7,8.最後に、プロトコルは、細胞組成および培養条件を操作する能力を有する共培養組成物の因子としての機能的活性を経時的に研究できるように、MEAプレート上でこれらの培養物を増殖させる方法を記載している。
これらのプロトコルの目標は、星状細胞とニューロンの相互作用を調査し、疾患特異的な変化を調べ、ALSの分野で治療の可能性を秘めた薬物をテストするための機能アッセイを提供することです。このプロトコルの最も困難なステップについて、ビデオの説明が提供されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
今日まで、星状細胞とニューロンの共培養の電気生理学的記録のためのhiPSCおよびMEAベースの方法は、てんかん9のin vitroモデリングのためのより広範な使用とは対照的に、ALS6の分野では限られた用途であり、完全なヒトプラットフォームではまだ適用されていません。しかし、このプラットフォームは、ニューロンの過興奮性のメカニズム、神経毒?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この原稿は、2019 MSCRFF 5119(AT)によってサポートされました。K08NS102526 NIH / NINDS(CWH)、2020年ドリスデューク慈善財団臨床科学者キャリア開発賞(CWH)。1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM).記載された電気生理学的プラットフォームを検証するために利用したMEAプラットフォームとデータ分析ソフトウェアを提供してくれたRaha Dastgheyb博士とNorman Haughey博士に感謝します。プロトコルのデモンストレーションと撮影に協力してくれたKhalil Rustに感謝します。
Materials
| 10 cm sterile culture plates | Falcon | 353003 | |
| 25 cm2 sterile culture flasks | Falcon | 353136 | |
| 2-Mercaptoethanol (β-ME) | Thermofisher | 21985023 | Working concentration 110 µM |
| 500 mL 0.2 µm CA Filter System | Corning | 430769 | |
| 5 mL pipette | Falcon | 357543 | |
| 6 well sterile culture plates | Falcon | 3046 | |
| Amphotericine B | Gibco | 15290018 | Working concentration 2.0 μg/mL |
| Anionic detergent with protease enzyme – Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Working concentration 1% m/v |
| Ascorbic acid (ASAC) | Sigma | A4403 | Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL). |
| Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W) | Axion | OPT-24 | |
| Axion Edge MEA platform | Axion | Maestro Edge | |
| Basement Membrane matrix – Matrigel | Corning | 354277 | Details in the protocol |
| Benchtop microscope (sterile under cell culture hood) | Zeiss | 415510-1100-000 | Primo Vert |
| Bicuculline | Sigma Aldrich | 14340 | Working concentration10 μM |
| Ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| CO2 tanks and regulator for Axion Edge | AirGas/Harris | 9296NC | |
| Compound E | Abcam | ab142164 | Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM). |
| Cyanquixaline (CNQX) | Sigma Aldrich | C239 | Working concentration 50 μM |
| Dihydrokainic acid (DHK) | Tocris | 111 | Working concentration 50 μM and 300 μM |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 113300 | Working concentration 1x |
| Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement | Thermofisher | A1517001 | Combine 10 mL of Essential 8 (10x) supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermofisher | 16140071 | Working concentration 1x |
| Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF) | Peprotech | 450-10 | Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Hemocytometer | Election Microscopy Sciences | 63510-20 | |
| Heparin | Millipore-sigma | H3149-100KU | Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL). |
| Humidity controlled Cell culture incubator | ThermoFisher | 370 | set to 37 ºC, 5 % CO2 |
| Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) | R&D systems | 291-G1-200 | Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Kainc acid | Abcam | ab144490 | Working concentration 5 μM |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Thermofisher | 10828 | Working concentration 1x |
| Laminin | Thermofisher | 23017-015 | Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media) |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution |
| L-Glutamine | Thermofisher | 25030 | Working concentration 100x |
| MEA glass plates | MultiChannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti-gr | |
| Multichannel Pipet P200 | Gilson | PJ22224 | |
| Neurobasal | Thermofisher | 21103049 | Working concentration 1x |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermofisher | 11140050 | Working concentration 100x |
| Pencillin/Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | Working concentration 100x |
| Polyornithine (PLO) | Sigma-Aldrich | P3655 | Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL) |
| Potassium chloride (KCl) | NA | NA | Working concentration100 mM |
| Purmorphamine (PMN) | Millipore-Sigma | 540223 | Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM). |
| Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM). |
| ROCK-I nhibitor | Peprotech | 1293823 | Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM). |
| SB431542 | Sigma | S4317 | Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM) |
| Sterile cell culture hoods | Baker Company | SG-600 | |
| Supplement B – B27 Supplement | Thermofisher | 21985023 | Working concentration 50x |
| Supplement N – N2 Supplement | Thermofisher | 17502048 | Working concentration 100x |
| Table top cell culture centrifuge | ThermoFisher | 75004261 | Sorvall Legend X1R |
| Thermoplastic film – Parafilm | PARAFILM | P7793 | |
| Tissue dissociation protease – Dispase | StemCell Technologies | 7923 | Working concentration 1x |
| Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL). |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher | 2530054 | Working concentration 1x |
| Waterbath | ThermoFisher | 2332 | Isotemp |
Referências
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