Estabelecimento de uma plataforma eletrofisiológica para modelagem da ELA com astrócitos e neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas regionalmente específicas
Summary
Descrevemos um método para diferenciar astrócitos e neurônios derivados pluripotentes induzidos por humanos da medula espinhal e sua co-cultura para registro eletrofisiológico.
Abstract
Astrócitos e neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hiPSC-A) (hiPSC-N) fornecem uma ferramenta poderosa para modelar a fisiopatologia da Esclerose Lateral Amiotrófica ( ELA) in vitro. As gravações de matriz de múltiplos eletrodos (MEA) são um meio de registrar potenciais de campo elétrico de grandes populações de neurônios e analisar a atividade da rede ao longo do tempo. Foi demonstrado anteriormente que a presença de hiPSC-A que são diferenciados usando técnicas para promover um fenótipo de astrócitos da medula espinhal melhorou a maturação e a atividade eletrofisiológica dos neurônios hiPSC-motores (MN) da medula espinhal regionalmente específicos quando comparados àqueles cultivados sem hiPSC-A ou na presença de astrócitos de roedores. Descrito aqui é um método para co-cultura de hiPSC-A da medula espinhal com hiPSC-MN e registrar a atividade eletrofisiológica usando registros de MEA. Embora os protocolos de diferenciação descritos aqui sejam específicos de astrócitos e neurônios que são regionalmente específicos da medula espinhal, a plataforma de co-cultura pode ser aplicada a astrócitos e neurônios diferenciados com técnicas específicas para outros destinos, incluindo hiPSC-A cortical e hiPSC-N. Esses protocolos visam fornecer um ensaio eletrofisiológico para informar sobre as interações glia-neurônio e fornecer uma plataforma para testar drogas com potencial terapêutico na ELA.
Introduction
Astrócitos e neurônios derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hiPSC-A) (hiPSC-N) são ferramentas poderosas para modelar a fisiopatologia da Esclerose Lateral Amiotrófica (ELA) in vitro e fornecem um paradigma translacional para estratégias de descoberta de medicamentos1. Pesquisadores demonstraram que a cocultura de hiPSC-A com hiPSC-N aumenta a maturação morfológica, molecular, eletrofisiológica e farmacológica de ambos os tipos celulares, gerando redes neuronais complexas e interações astrócitos-neurônios que se assemelham às suas contrapartes in vivo 2,3. Experimentos de cocultura semelhantes podem recapitular características da patobiologia da ELA, como neurotoxicidade mediada por astrócitos 4,5 e hiperexcitabilidade neuronal6. Além disso, com os avanços nos protocolos de diferenciação, as células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSC) podem ser diferenciadas em subtipos neurais regionalmente específicos, incluindo hiPSC-A cortical e medular e hiPSC-N 7,8. Essas estratégias fornecem o potencial para modelar a patologia do neurônio motor cortical e espinhal na ELA, bem como a influência astrocítica em ambos. No entanto, isso requer que haja um ensaio funcional reprodutível para determinar esses efeitos.
Recentemente, demonstrou-se que o registro de multieletrodos (MEA) é particularmente adequado para a caracterização eletrofisiológica de coculturas neurônio-astrócitos2. Ao contrário das análises eletrofisiológicas de célula única, essas matrizes de eletrodos de alta densidade registram passivamente os potenciais de campo extracelular de grandes populações de neurônios sem interromper as condições de cultura e preservar a integridade das membranas celulares. Essas plataformas são particularmente úteis para registrar a atividade celular e de rede das culturas ao longo do tempo e em resposta à manipulação farmacológica. Finalmente, quando a presença de astrócitos é uma variável de cultura, os registros de MEA podem fornecer insights funcionais sobre as interações bidirecionais astrócitos-neurônios 2,9.
Apresenta-se aqui um protocolo otimizado para a diferenciação de hiPSC em hiPSC-A da medula espinhal e neurônios motores hiPSC (MN) previamente validado2. O protocolo de diferenciação hiPSC-A da medula espinhal resulta consistentemente em culturas de astrócitos, que são positivas para a proteína B de ligação ao cálcio S100 (S100β), proteína glial fibrilar ácida (GFAP) e Homeobox B4 (HOXB4) em até 80%, 50% e 90% das células, respectivamente, indicando uma especificação de maturação da glial e da medula espinhal 2,10 . O protocolo de diferenciação hiPSC-MN gera neurônios >90% positivos para a acetiltransferase de colina (ChAT), sugestivos de uma identidade de neurônio alfa-motor maduro2. Além disso, o protocolo descreve técnicas para a geração de coculturas hiPSC-A/MN previamente demonstradas como resultando em neurônios com maior complexidade morfológica pela análise de Scholl e microscopia imunofluorescente quando comparadas a culturas neuronais sem astrócitos ou com astrócitos de roedores2. Embora essas descrições sejam específicas para hiPSC-A e hiPSC-N da medula espinhal, uma vantagem única é que a cultura independente inicial de astrócitos e neurônios, seguida de etapas para co-cultura em momentos posteriores, pode ser traduzida para estudar os efeitos das interações neurônio-astrócitos de outras regiões específicas, bem como células específicas da doença 7,8 . Finalmente, o protocolo descreve como cultivar essas culturas em placas MEA para que a atividade funcional como fator de composição da cocultura possa ser estudada ao longo do tempo com a capacidade de manipular a composição celular, bem como as condições de cultura.
O objetivo desses protocolos é fornecer um ensaio funcional para investigar as interações astrócitos-neurônios, examinar alterações específicas da doença e testar drogas com potencial terapêutico no campo da ELA. Instruções em vídeo são fornecidas para as etapas mais desafiadoras deste protocolo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Até o momento, métodos baseados em hiPSC e MEA para registros eletrofisiológicos de coculturas de astrócitos-neurônios encontraram aplicação limitada no campo da ELA6 e ainda não em plataformas totalmente humanas, em contraste com seu uso mais difundido para modelagem in vitro da epilepsia9. Esta plataforma, no entanto, tem o potencial de abordar questões patofisiologicamente relevantes na pesquisa da ELA, como os mecanismos de hiperexcitabilidade neuronal…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este manuscrito foi apoiado pelo seguinte: 2019 MSCRFF 5119 (AT). K08NS102526 NIH/NINDS (CWH), 2020 Prêmio de Desenvolvimento de Carreira de Cientista Clínico (CWH) da Doris Duke Charitable Foundation. 1R01NS117604-01NIH/NINDS (NJM), DOD ALSRP W81XWH2010161 (NJM), 2019 MSCRFD 5122 (NJM). Agradecemos ao Dr. Raha Dastgheyb e ao Dr. Norman Haughey por fornecerem a plataforma MEA e o software de análise de dados que utilizamos para validar a plataforma eletrofisiológica descrita. Gostaríamos de agradecer a Khalil Rust por sua assistência com a demonstração do protocolo e filmagem.
Materials
| 10 cm sterile culture plates | Falcon | 353003 | |
| 25 cm2 sterile culture flasks | Falcon | 353136 | |
| 2-Mercaptoethanol (β-ME) | Thermofisher | 21985023 | Working concentration 110 µM |
| 500 mL 0.2 µm CA Filter System | Corning | 430769 | |
| 5 mL pipette | Falcon | 357543 | |
| 6 well sterile culture plates | Falcon | 3046 | |
| Amphotericine B | Gibco | 15290018 | Working concentration 2.0 μg/mL |
| Anionic detergent with protease enzyme – Terg-A-Zyme | Sigma-Aldrich | Z273287 | Working concentration 1% m/v |
| Ascorbic acid (ASAC) | Sigma | A4403 | Dissolve 100 mg into 250 mL of dH2O to get 0.4mg/ml stock. Sterile filter through a 0.22 µm filter, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 0.4 µg/mL). |
| Axion CytoView MEA 24 plates (M384-tMEA-24W) | Axion | OPT-24 | |
| Axion Edge MEA platform | Axion | Maestro Edge | |
| Basement Membrane matrix – Matrigel | Corning | 354277 | Details in the protocol |
| Benchtop microscope (sterile under cell culture hood) | Zeiss | 415510-1100-000 | Primo Vert |
| Bicuculline | Sigma Aldrich | 14340 | Working concentration10 μM |
| Ciliary neurotrophic factor (CNTF) | Peprotech | 450-13 | Dissolve 100 µg in 1mL of sterile PBS, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| CO2 tanks and regulator for Axion Edge | AirGas/Harris | 9296NC | |
| Compound E | Abcam | ab142164 | Dissolve 250 µg in 2.0387 mL of DMSO to get a 250 µM stock. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:2000 for use. (working concentration 125 nM). |
| Cyanquixaline (CNQX) | Sigma Aldrich | C239 | Working concentration 50 μM |
| Dihydrokainic acid (DHK) | Tocris | 111 | Working concentration 50 μM and 300 μM |
| DMEM/F12 | Thermofisher | 113300 | Working concentration 1x |
| Essential 8 Medium + Essential 8 Supplement | Thermofisher | A1517001 | Combine 10 mL of Essential 8 (10x) supplement with 500 mL of Essential 8 Growth Medium (1x) |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Thermofisher | 16140071 | Working concentration 1x |
| Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF) | Peprotech | 450-10 | Dissolve 100 µg in 1mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Hemocytometer | Election Microscopy Sciences | 63510-20 | |
| Heparin | Millipore-sigma | H3149-100KU | Dissolve 200 mg in 100 mL of PBS to get 2 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 15 mL and 500 µL tubes. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 2 µg/mL). |
| Humidity controlled Cell culture incubator | ThermoFisher | 370 | set to 37 ºC, 5 % CO2 |
| Insulin-like growth factor 1 (IGF-1) | R&D systems | 291-G1-200 | Dissolve 200 µg in 2 mL of PBS to 100 µg/mL, then add 18 mL of 0.1%BSA-PBS to make 10 µg/mL stock and store at -80 ºC. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 10 µg/mL stock at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Kainc acid | Abcam | ab144490 | Working concentration 5 μM |
| Knockout Serum Replacement (KSR) | Thermofisher | 10828 | Working concentration 1x |
| Laminin | Thermofisher | 23017-015 | Stock solution 1 mg/mL, working concentration 10 µg/mL (coating), 1 µg/mL (cell media) |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | Dissolve 2 mg of LDN into 500 µL of Chloroform to get 10 mM stock. Aliquot this and freeze at -80 ºC. For using, dilute the stock 1 to 10 into DMSO [to 1 mM] first, then dilute 1:5000 of 1 mM into the desired media to get 0.2 µM working solution |
| L-Glutamine | Thermofisher | 25030 | Working concentration 100x |
| MEA glass plates | MultiChannel Systems | 60MEA200/30iR-Ti-gr | |
| Multichannel Pipet P200 | Gilson | PJ22224 | |
| Neurobasal | Thermofisher | 21103049 | Working concentration 1x |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermofisher | 11140050 | Working concentration 100x |
| Pencillin/Streptomycin | Thermofisher | 15140122 | Working concentration 100x |
| Polyornithine (PLO) | Sigma-Aldrich | P3655 | Dissolve 100 mg in 1 mL of ddW to get 100 mg/mL stock solution. Aliquot the stock in 100 µL tubes. (working concentration 100 µg/mL) |
| Potassium chloride (KCl) | NA | NA | Working concentration100 mM |
| Purmorphamine (PMN) | Millipore-Sigma | 540223 | Dissolve 5 mg in 9.6 mL of DMSO to get 1 mM solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute 1:1000 for use. (working concentration 1 µM). |
| Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 µg in 1 mL of PBS to 100 µg/mL, and then add 9 mL of sterile 0.1% BSA-PBS to 10 µg/mL. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 1000 for use. (working concentration 10 ng/mL). |
| Retinoic acid (RA) | Sigma | R2625 | Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 µL/tube and freeze at -80 ºC. Take 200 µL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 µL/tube and store at -80 ºC. Dilute at 1:10000 for use. (working concentration 2 µM). |
| ROCK-I nhibitor | Peprotech | 1293823 | Dissolve 5 mg in 1480 µL of dH2O to get 10 mM stock, aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1: 500 for use. (working concentration 20 µM). |
| SB431542 | Sigma | S4317 | Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at -80 ºC. Dilute at 1:1000 for use. (working con 10 µM) |
| Sterile cell culture hoods | Baker Company | SG-600 | |
| Supplement B – B27 Supplement | Thermofisher | 21985023 | Working concentration 50x |
| Supplement N – N2 Supplement | Thermofisher | 17502048 | Working concentration 100x |
| Table top cell culture centrifuge | ThermoFisher | 75004261 | Sorvall Legend X1R |
| Thermoplastic film – Parafilm | PARAFILM | P7793 | |
| Tissue dissociation protease – Dispase | StemCell Technologies | 7923 | Working concentration 1x |
| Trypsin Inhibitor | Sigma | T6522-1G | Dissolve 1g in 100mL ddH2O to get 10 mg/mL stock. Aliquot and store at 4 ºC. Dilute 1:10 of trypsin volume for use. (working concentration 1 mg/mL). |
| Trypsin-EDTA (0.05%) | Thermofisher | 2530054 | Working concentration 1x |
| Waterbath | ThermoFisher | 2332 | Isotemp |
Referências
- Ferraiuolo, L., Maragakis, N. J. Mini-review: Induced pluripotent stem cells and the search for new cell-specific ALS therapeutic targets. Neuroscience Letters. 755, 135911 (2021).
- Taga, A., et al. Role of human-induced pluripotent stem cell-derived spinal cord astrocytes in the functional maturation of motor neurons in a multi-electrode array system. Stem Cells Translational Medicine. 8 (12), 1272-1285 (2019).
- Klapper, S. D., et al. Astrocyte lineage cells are essential for functional neuronal differentiation and synapse maturation in human iPSC-derived neural networks. Glia. 67 (10), 1893-1909 (2019).
- Zhao, C., et al. Mutant C9orf72 human iPSC-derived astrocytes cause non-cell autonomous motor neuron pathophysiology. Glia. 68 (5), 1046-1064 (2020).
- Almad, A. A., et al. Connexin 43 in astrocytes contributes to motor neuron toxicity in amyotrophic lateral sclerosis. Glia. 64 (7), 1154-1169 (2016).
- Wainger, B. J., et al. Intrinsic membrane hyperexcitability of amyotrophic lateral sclerosis patient-derived motor neurons. Cell Reports. 7 (1), 1-11 (2014).
- Tyzack, G., Lakatos, A., Patani, R. Human stem cell-derived astrocytes: Specification and relevance for neurological disorders. Current Stem Cell Reports. 2, 236-247 (2016).
- Imaizumi, K., et al. Controlling the regional identity of hPSC-derived neurons to uncover neuronal subtype specificity of neurological disease phenotypes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1010-1022 (2015).
- Odawara, A., Matsuda, N., Ishibashi, Y., Yokoi, R., Suzuki, I. Toxicological evaluation of convulsant and anticonvulsant drugs in human induced pluripotent stem cell-derived cortical neuronal networks using an MEA system. Scientific Reports. 8 (1), 10416 (2018).
- Haidet-Phillips, A. M., et al. Gene profiling of human induced pluripotent stem cell-derived astrocyte progenitors following spinal cord engraftment. Stem Cells Translational Medicine. 3 (5), 575-585 (2014).
- Roybon, L., et al. Human stem cell-derived spinal cord astrocytes with defined mature or reactive phenotypes. Cell Reports. 4 (5), 1035-1048 (2013).
- Shimojo, D., et al. simple motor neuron differentiation from human pluripotent stem cells. Molecular Brain. 8 (1), 79 (2015).
- Chandrasekaran, A., et al. Comparison of 2D and 3D neural induction methods for the generation of neural progenitor cells from human induced pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 25, 139-151 (2017).
- Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 29 (6), 528-534 (2011).
- Li, X. J., et al. Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells. Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).
- Liu, H., Zhang, S. C. Specification of neuronal and glial subtypes from human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (24), 3995-4008 (2011).
- Borghese, L., et al. Inhibition of notch signaling in human embryonic stem cell-derived neural stem cells delays G1/S phase transition and accelerates neuronal differentiation in vitro and in vivo. Stem Cells. 28 (5), 955-964 (2010).
- Shi, Y., Kirwan, P., Smith, J., Robinson, H. P., Livesey, F. J. Human cerebral cortex development from pluripotent stem cells to functional excitatory synapses. Nature Neuroscience. 15 (3), 477-486 (2012).
