CRISPR-Cas9基因组编辑系统是一个易于使用的基因组编辑器,已用于模型和非模型物种。在这里,我们提出了这个系统的蛋白质为基础的版本,用于将一个过早停止的科顿引入非模型丝质的共生真菌的交配基因。
CRISPR-Cas9基因组编辑系统是一种分子工具,可用于将精确的变化引入模型和非模型物种的基因组中。该技术可用于各种基因组编辑方法,从基因敲除和敲击到更具体的变化,如在目标位置引入一些核苷酸。基因组编辑可用于多种应用,包括基因的部分功能表征、转基因生物的产生和诊断工具的开发。与之前获得的基因编辑策略相比,CRISPR-Cas9系统已被证明是易于建立的新物种,并拥有高效率和特异性。其主要原因是,编辑工具使用RNA分子来瞄准感兴趣的基因或序列,使目标分子设计简单明了,因为可以利用标准碱基配对规则。与其他基因组编辑系统类似,基于CRISPR-Cas9的方法还需要高效和有效的转化方案,以及获得高质量的序列数据来设计靶向RNA和DNA分子。自2013年推出该系统以来,它已被用于基因工程的各种模型物种,包括糖精,阿拉比多普斯塔利亚,果蝇黑色素和穆斯库鲁斯。随后,研究非模型物种的研究人员利用了该系统,并利用于研究涉及真菌二次代谢、线虫生长和植物抗病等不同过程的基因。下文详述的这个协议描述了CRISPR-Cas9基因组编辑协议的使用,用于截断参与亨泰拉·阿曼尼西斯性周期的基因,一种属于Ceratocysidaceae家族的丝质异体真菌。
高质量、完全组装的基因组和转录组不断增加,这大大提高了研究一系列生物体1中各种生物过程的能力。模型物种和非模型物种都是如此,其中许多物种可能提供对生物过程的更多样化的理解。这些类型的数据可用于基因发现、转录网络的识别以及全基因组和转录组的比较,每种数据都具有各自的应用集。然而,当基因被预测、注释和以前所未见的速度与不同的功能通路相连时,这些基因的功能特征仍然落后,受到许多物种可用的分子工具包的有限限制。对于非模型物种来说尤其如此,基因组数据相对容易生成,但进一步的分子特征几乎不可能为,1,2。
对真菌物种生物学重要的特定基因的功能的部分表征可以通过敲除或敲击实验,然后对突变菌株进行表型分析。这两个系统完全依赖于基因工程协议的可用性,包括至少包括一个转换系统和一个基因编辑系统。有许多不同的转换系统已经开发在各种丝真菌4。像那些依赖生物和电穿孔的物理系统已经分别在特里乔德马哈齐亚努姆5和阿斯佩吉卢斯尼日尔6开发。利用氯化钙或醋酸锂等化学物质的系统在神经孢子7中已经开发。最后,依靠农业细菌图梅法辛进行转化的生物系统已经成功地在Ceratocystis albifundus8中使用过。
与不同转化协议的可用性相比,基因组编辑系统不太丰富。在丝形真菌中进行的许多传统功能表征实验都利用了分裂标记敲击结构,其形式为可选择的标记,由同源区域与基因组3中的目标区域或基因相对。该方法依赖于同源定向(HR)DNA修复,从而将敲除构造与感兴趣区域之间的同源重组进行。此重组事件导致将感兴趣的基因与可选标记序列替换。不幸的是,虽然这在许多物种是成功的,包括Cercospora尼科蒂亚纳10,阿斯佩吉卢斯富米加图斯11和格罗斯曼尼亚克拉维格拉12,同源重组率是高度可变的不同真菌物种,使这是一个低效的,有时无法使用的协议,在某些物种3。
其他基因组编辑系统,包括那些使用锌指核酶(ZFNs)和转录活化剂样效应剂核酸酶(TALENs)的系统代表了对旧系统有很大的改进,特别是考虑到它们能够做出特定和有针对性的改变13。ZFN和塔伦由核酸酶蛋白和能够识别特定核苷酸序列13的蛋白质组成。识别后,核酸酶诱导双链DNA断裂,可促进特定突变的引入。为了实现基因组变化,需要针对每个实验专门设计识别核苷酸序列的蛋白质区域。由于这种依赖蛋白质-核酸相互作用来指导编辑、设计和生产每个敲除或敲击实验的目标分子是困难的,劳动密集型14,15。,15这些挑战的例证是,很少丝真菌被使用这些系统进行基因组编辑。一个例子是基于塔伦的系统,是在水稻爆炸真菌,麦格纳波特奥里扎16开发。
可以说,基因组编辑领域最大的革命是CRISPR-Cas9系统的发现和随后的开发,该系统是一个基因组编辑器,它允许由RNA分子引导的内核糖酶对感兴趣的序列进行靶向裂解。这是对先前开发的基因组编辑器的巨大改进,这些编辑器依靠蛋白质-核酸相互作用作为CRISPR-Cas9系统的主要优势,即它依靠RNA分子来瞄准感兴趣的区域。这意味着系统依赖于RNA-DNA相互作用,因此在设计每个实验15时可以利用标准基础配对规则。
此处详细介绍的CRISPR-Cas9系统由三个主要成分组成:单导RNA(sgRNA)、Cas9酶和供体DNA(dDNA)17。sgRNA由一个称为原空间器的20核苷酸区域以及一个称为脚手架18的较长区域组成。原型空间区域用于引导编辑系统到目标区域,因此针对每个实验进行了重新设计。支架是RNA区域,物理上与Cas9酶结合,形成核糖核蛋白(RNP),因此无论目标区域如何,都是相同的。Cas9酶在物理上促进目标DNA的裂解,使用原空间器作为指南来识别这个区域19。最后一个组件,dDNA,是可选的,它的使用取决于特定的实验20。dDNA 包含应专门插入由 Cas9 酶切割区域的序列,因此非常适合基因敲击实验,当基因被引入基因组时,或在引入抗生素耐药基因或其他可选标记来取代感兴趣的基因的基因敲除实验时。dDNA的设计也可以将新的序列引入基因组。例如,如下文所述,当需要基因截断时,可以引入帧内停止科登到感兴趣的基因的特定区域。其他应用包括基因特定区域的突变,如功能域22,或引入标记序列23。
使用CRISPR-Cas9系统的一个主要好处是它的多功能性24。这种适应性的一个例子是,Cas9酶可以引入宿主细胞的三种形式之一 – DNA,RNA或蛋白质 – 取决于使用的特定转换系统。当以DNA形式引入时,cas9基因通常包含在质粒中,以及一个可选标记物、一个用于表达sgRNA的盒式磁带,以及一个编码dDNA序列25的盒式磁带。该系统的主要优点是,只需要将单个结构转换为细胞,成功的转换可确保存在 CRISRP-Cas9 培养的基因组编辑所需的所有组件。但是,此方法依赖于宿主物种的表达式系统的可用性。Cas9要成功诱导DNA损伤,需要在高水平上表达,因此,需要一个合适的和潜在的特定启动子。对于尚未开发此类启动子的非模型物种,这可能是一个减损因素,因此以RNA或蛋白质形式引入Cas9的能力可能是一个更具吸引力的选择。将RNA引入细胞会带来自身的挑战,特别是RNA不稳定,可能无法在转化过程中存活下来。此外,当以DNA或RNA形式引入时,Cas9基因序列可能需要经过合成优化,才能用于特定的宿主系统17。例如,来自链球菌的cas9基因在哺乳动物宿主细胞中可能不起作用,而经过优化的用于哺乳动物细胞的cas9基因在植物细胞中可能不起作用。所有这些挑战都可以使用Cas9的蛋白质形式来克服,它与sgRNA一起可以组装成R RNP并转化为宿主细胞26,27。,27该系统不依赖于任何内生表达系统或科登优化,因此应工作在大多数非模型物种。蛋白质系统缺点是它与基于DNA的转化系统(如农业细菌的转移)不兼容。因此,要使基于蛋白质的方法起作用,需要提供一种转化协议,如那些依赖蛋白酶或生物活性剂的转化方案。这个基于RNP的系统已经成功地用于丝质真菌,富萨里姆氧26和Mucor环氧27。
亨蒂埃拉·阿曼尼西斯,一个Ceratocysidaceae家族的成员,是一种世界性真菌,经常在刚受伤的木本植物28上发现。虽然有高质量的基因组和转录组数据可用于这个物种28,29,30,,29,30没有制定转化或基因组编辑方案。迄今为止,对H.omanensis的研究已经集中在其性周期29,31的基本遗传成分。这种真菌表现出典型的异质性循环,性生殖只发生在MAT1-1和MAT1-2交配类型31的分离物之间。相比之下,MAT1-2分离的密切相关的亨蒂拉单体能够独立性生殖和完成性周期的情况下,没有MAT1-1伴侣31。这种性能力的差异被认为是,至少部分是由于交配基因MAT1-2-7的主要差异,其中H.omanensis窝藏一个完整的长度和完整的拷贝,而基因被严重截断在H.moniliformis29,31。29,31为了进一步描述这种基因在性生殖中的作用,MAT1-2-7的H.omanensis基因被截断,以模仿在H.moniliformis21中看到的截断21。
以下协议详细介绍了 使用基于蛋白质的CRISPR-Cas9 基因组编辑系统对 MAT1-2-7 基因的转化和截断。该协议是在基于同源重组的基因替换和基于质粒的CRISPR-Cas9基因组编辑失败的方法之后开发的。
通过引入一个帧内过早停止的 codon 以及一个抗血霉素 B 21 的基因,演示了成功转化H. omanensis和编辑MAT1-2-7基因的协议。这是使用基于蛋白质的CRISPR-Cas9基因组编辑系统实现的。实验包括进行 sgRNA 的体外转录,基于 PCR 的 dDNA 组装,以及将这两种核酸与市售的 Cas9 酶共同转化为从H. omanensis 中提取的上原体 in vitro
与其他依赖许多其他分子工具的协议不同,上述协议可以成功地用于分子工具箱仍然相当有限的物种。该协议仅依赖于已建立的转换系统和NGS数据的可用性,最好是全基因组序列。虽然有效的转换系统可能需要对一个物种进行一些优化,而对于这个物种来说,这种机制是不可用的,但各种物种都有不同的协议。此外,基因组数据正越来越多地提供给最晦涩的物种, 如果它们尚未 存在,也变得更容易产生。
鉴于协议的长度,有许多步骤可以引入修改,并且可能需要故障排除。对于被视为特定物种的步骤来说,情况尤其如此。例如,此协议中有许多孵化步骤需要在特定温度和特定时间长度下进行,以便生成对实验重要的细胞类型。因此,这些步骤将需要针对物种的优化。在可能的情况下,提供了特定细胞或生长阶段的显微图,以帮助将此协议转移到不同的物种(图1)。用于降解真菌细胞细胞壁以释放原体酶的酶的类型和浓度也将特定于所研究的真菌种类。在此协议中,只使用一种解酶的来源,而在像Fusarium顶极素33等物种中提取蛋白酶需要不同的酶组合。这一步完全取决于细胞壁的化学制造,因此需要根据物种对物种进行优化。
这种方法对于研究非模型物种的人特别重要,因为不需要依赖表达系统。建立CRISPR-Cas9基因组编辑系统的一个流行方法是从一个或两个质粒中表达Cas9蛋白、sgRNA以及dDNA,这些质粒被转换成选择细胞。在这种情况下,Cas9 需要由能够对所研究的特定生物体中具有高表达水平的启动子表示。一般促进剂已经开发用于丝真菌,虽然它们不兼容的所有物种,他们允许低水平表达,并可以成功地用于表达,例如,抗生素耐药性基因。然而,这些促进剂通常不允许高表达,因此不能用于表达Cas9蛋白。使用基于蛋白质版本的CRISPR-Cas9基因组编辑系统克服了这一限制,允许sgRNA和dDNA与已经生产的Cas9酶共同转化为细胞。
这种基于蛋白质的系统在H.omanensis中使用,在使用经典分裂标记方法以及基于质粒的CRISPR-Cas9系统进行基因组编辑的许多尝试失败后,出现了开发。虽然效率因物种的不同,但分离标记方法已经成功地使用,在不同物种,如阿尔泰纳里亚改变34,35,35和C.尼科蒂亚纳36的物种100%的效率。相比之下,尽管有80多个独立的转换和集成事件,但H.omanensis系统的效率为零。同样,基于质粒的CRISPR-Cas9系统已经成功地在Trichoderma里西(>93%)17和青霉素菊17原(高达100%)37中高效率使用。这再次与这个系统在H.omanensis中的有用性相反。尽管尝试了一些潜在的促进者,包括从家政基因预测的两个物种特异性促进剂,但Casnensis的充分表达在H.omanensis中是无法实现的。因此,这个系统不能使用。然而,使用基于蛋白质的CRISPR-Cas9系统,产生了许多独立的转化剂,其中两个在正确的位置容纳了集成的dDNA。此外,这个实验只尝试了一次,并且是成功的,这进一步说明了这个系统的易用性。
该协议的未来应用包括其优化和用于其他物种的Ceratocysidaceae。已有大量NGS数据可供这些物种提供30、38、39,,38,39有关宿主特异性40、生长速率和毒性41的研究已经进行。这些研究可以通过被认为参与这些过程的基因的功能特征来加强,由于有转化和基因组编辑协议的提供,这些研究现在成为可能。
总之,由于提供了不依赖于大量生物资源和分子工具包的易于使用的基因组编辑协议,对非模型物种重要生物过程基础的基因的彻底调查正变得越来越容易获得。研究非模型物种正变得越来越容易,并且将允许发现新的途径和有趣的偏差,从标准生物过程,已经阐明的模型物种。
The authors have nothing to disclose.
该项目得到了比勒陀利亚大学科学技术部/国家研究基金会(NRF)树木健康生物技术卓越中心的支持。该项目还得到了BD温菲尔德教授的DST/NRF SARCHI真菌基因组学主席(格兰特编号:98353)以及阿姆·威尔逊博士的NRF博士助学金(108548)的支持。赠款持有人承认,本工作所表达的意见、结论和结论或建议是研究人员的意见、结论和结论或建议,资助机构在这方面不承担任何责任。
EcoRI-HF | New England Biolabs, Ipswich, USA | R3101S | |
EnGen Spy Cas9 NLS protein | New England Biolabs, Ipswich, USA | M0646T | Used to assemble the RNP |
Eppendorf 5810 R centrifuge | Eppendorf, Hamberg, Germany | ||
FastStart Taq DNA Polymerase | Sigma, St Louis, USA | 12032902001 | Standard DNA polyermase |
GeneJET Gel Extraction Kit | ThermoFisher Scientific, Waltham, USA | K0691 | |
HindIII-HF | New England Biolabs, Ipswich, USA | R3104S | |
HiScribeTM T7 Quick High Yield RNA synthesis kit | New England Biolabs, Ipswich, USA | E2050S | |
Hygromycin B from Streptomyces hygroscopicus | Sigma, St Louis, USA | 10843555001 | |
Infors HT Ecotron Shaking Incubator | Infors AG, Bottmingen, Switzerland | ||
LongAmp Taq DNA Polymerase | New England Biolabs, Ipswich, USA | M0323S | Long-range, high-fidelity DNA polymerase |
Malt extract agar, 2% (MEA) | 20 g ME and 20 g agar in 1 l ddH20 | ||
Malt extract | Sigma, St Louis, USA | 70167-500G | |
Agar | Sigma, St Louis, USA | A5306 | |
Malt Extract broth, 1% (MEB) | Sigma, St Louis, USA | 70167-500G | 2 g ME in 200 ml ddH20 |
Malt Extract broth, 2% (MEB) | Sigma, St Louis, USA | 70167-500G | 4 g ME in 200 ml ddH20 |
Miracloth | Merck Millipore, New Jersey, USA | 475855 | |
Nylon membrane (positively charged) | Sigma, St Louis, USA | 11209299001 | |
Osmotic control medium (OCM) | 0.3% yeast extract, 20% sucrose, 0.3% casein hydrolysate | ||
Casein Hydrolysate | Sigma, St Louis, USA | 22090 | |
Sucrose | Sigma, St Louis, USA | 84097 | |
Yeast extract | Sigma, St Louis, USA | Y1625 | |
Osmotic control medium (OCM) agar | Osmotic control medium (OCM) + 1% agar | ||
Agar | Sigma, St Louis, USA | A5306 | |
PCR DIG Labeling Mix | Sigma, St Louis, USA | 11585550910 | |
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | ThermoFisher Scientific, Waltham, USA | F-530XL | High fidelity DNA polymerase |
Plasmid pcb1004 | N/A | N/A | From: Carroll et al., 1994 |
Presynthesized sgRNA | Inqaba Biotec, Pretoria, South Africa | Ordered as an synthesized dsDNA with specified sequence | |
Proteinase K | Sigma, St Louis, USA | P2308 | |
PTC Solution | 30% polyethylene glycol 8000 in STC buffer from above | ||
Polyethylene glycol 8000 | Sigma, St Louis, USA | 1546605 | |
RNase A | ThermoFisher Scientific, Waltham, USA | 12091021 | |
RNAfold Webserver | Institute for Theoretical Chemistry, University of Vienna | N/A | http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi |
RNAstructure | Mathews Lab | N/A | https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html |
Sorbitol, 1 M | Sigma, St Louis, USA | 1617000 | 182.17g sorbitol in 1 l ddH20 |
STC Buffer | 20% sucrose, 50 mM Tris-HCl pH 8.00 and 50 mM CaCl2 | ||
Calcium chloride | Sigma, St Louis, USA | 429759 | |
Tris-HCl pH 8.00 | Sigma, St Louis, USA | 10812846001 | |
Sucrose | Sigma, St Louis, USA | 84097 | |
Trichoderma harzianum lysing enzymes | Sigma, St Louis, USA | L1412 | |
Zeiss Axioskop 2 Plus Ergonomic Trinocular Microscope | Zeiss, Oberkochen, Germany |