JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genética

CRISPR-Cas9-Опосредованное редактирование генома в filamentous Ascomycete Huntiella omanensis

Published: June 09, 2020
doi:
10.3791/61367
,
1Department of Biochemistry, Genetics & Microbiology,University of Pretoria, 2Forestry & Agricultural Biotechnology Institute (FABI),University of Pretoria

Summary

Система редактирования генома CRISPR-Cas9 является простым в использовании редактором генома, который используется в модельных и не моделных видах. Здесь мы представляем белковую версию этой системы, которая была использована для введения преждевременного стоп-кодона в брачный ген не-модель нитеозного гриба аскомицета.

Abstract

Система редактирования генома CRISPR-Cas9 является молекулярным инструментом, который может быть использован для внесения точных изменений в геномы моделей и не моделей видов. Эта технология может быть использована для различных подходов к редактированию генома, от генных нокаутов и стуканий до более конкретных изменений, таких как введение нескольких нуклеотидов в целевом месте. Редактирование генома может быть использовано для множества применений, включая частичную функциональную характеристику генов, производство трансгенных организмов и разработку диагностических инструментов. По сравнению с ранее доступными стратегиями редактирования генов, было показано, что система CRISPR-Cas9 легко устанавливается в новых видах и может похвастаться высокой эффективностью и специфичностью. Основная причина этого заключается в том, что инструмент редактирования использует молекулу РНК для таргетинга на ген или последовательность интересов, что делает проектирование молекулы-мишени простым, учитывая, что стандартные правила базового сопряжения могут быть использованы. Как и в других системах редактирования генома, методы на основе CRISPR-Cas9 также требуют эффективных и эффективных протоколов трансформации, а также доступа к высококачественной последовательности данных для разработки целевых молекул РНК и ДНК. С момента введения этой системы в 2013 году, он был использован для генетически инженер различных видов модели, в том числе Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster и Mus musculus. Впоследствии исследователи, работающие над не модели видов воспользовались системой и использовали его для изучения генов, участвующих в процессах, как разнообразны, как вторичный метаболизм в грибах, рост нематод и устойчивость к болезням в растениях, среди многих других. Этот протокол подробно описано использование протокола редактирования генома CRISPR-Cas9 для усечения гена, участвующая в сексуальном цикле Huntiella omanensis, нитеозного гриба аскомицета, принадлежащего к семейству Ceratocystidaceae.

Introduction

Растущая доступность высококачественных, полностью собранных геномов и транскриптомов значительно улучшила способность изучать широкий спектр биологических процессов в массиве организмов1. Это относится как к типообразуемым видам, так и к нео модели, многие из которых могут предложить более разнообразное понимание биологических процессов. Такого рода данные могут быть использованы для обнаружения генов, идентификации транскрипционных сетей и сравнения всего генома и транскриптома, каждый из которых имеет свой собственный набор приложений. Однако, в то время как гены предсказываются, аннотированы и если можно иначе связаны с различными функциональными путями с никогда еще не замеченной скоростью, функциональная характеристика этих генов остается позади, ограниченная молекулярными наборами инструментов, доступных для многих видов. Это особенно верно для не-модельных видов, где геномные данные относительно легко генерировать, но где дальнейшая молекулярная характеристика былапочти невозможна 1,2.

Частичная характеристика функций специфических генов, важных для биологии грибковых видов, может быть достигнута либо нокаутом, либо нокин-экспериментами с последующим фенотипическим анализом штаммовмутантов 3. Эти две системы полностью зависят от наличия протоколов генной инженерии, включая, как минимум, систему трансформации и систему генетического редактирования. Есть целый ряд различных систем трансформации, которые были разработаны в различных нитей грибов4. Физические системы, как те, которые полагаются на биолистику и электропорации были разработаны в Trichoderma harzianum5 и Aspergillus niger6, соответственно. Системы, которые используют химические вещества, такие как хлорид кальция или ацетат лития были разработаны в Neurospora crassa7. Наконец, биологические системы, которые полагаются на использование Agrobacterium tumefaciens для преобразования были успешно использованы в Ceratocystis albifundus8.

В отличие от наличия различных протоколов трансформации, системы редактирования генома менее обильны. Многие из традиционных функциональных экспериментов характеристики, проведенные в нитеозных грибов использовали сплит маркер нокаутом построить в виде выбираемого маркера в окружении регионов гомологии в целевой области или гена вгеноме 3. Метод опирается на гомологию направленного (HR) ремонта ДНК, которая условия гомологичной рекомбинации между нокаутом построить и области интереса. Это событие рекомбинации приводит к замене гена интереса последовательностью выбираемого маркера. К сожалению, в то время как это было успешным во многих видах, включая Cercospora nicotianae10, Aspergillus fumigatus11 и Grosmannia clavigera12, темпы гомологичной рекомбинации очень изменчивы между различными грибковыми видами, что делает это неэффективным, а иногда и непригодным для использования протоколом внекоторых видах 3.

Другие системы редактирования генома, в том числе те, которые используют нуклеазы цинка-пальца (ЗФН) и транскрипционные активаторные нуклеазы эффектора (TALENs), представляют собой значительное улучшение старых систем, особенно учитывая их способность вносить конкретные и целенаправленныеизменения 13. Оба ЗФН и TALENs состоят из белка нуклеазы и белка, который способен распознать конкретные нуклеотидные последовательности13. После распознавания, нуклеаза вызывает двойной мель разрыв ДНК, которые могут способствовать введению конкретных мутаций. Для того, чтобы добиться изменения генома, белковая область, которая распознает нуклеотидную последовательность, должна быть специально разработана для каждого эксперимента. Из-за этой зависимости от белково-нуклеиновой кислоты взаимодействий для руководства редактирования, проектирования и производства целевых молекул для каждого нокаута или стука эксперимента трудно итрудоемких 14,15. Иллюстрируя эти проблемы, очень немногие нитеозные грибы были подвергнуты редактированию генома с помощью этих систем. Одним из примеров является TALENs основе системы, которая была разработана в грибок взрыва риса, Magnaporthe oryzae16.

Возможно, величайшей революцией в области редактирования генома стало открытие и последующее развитие системы CRISPR-Cas9 – редактора генома, который позволяет целенаправленно расщепление последовательности интересов эндонуклеазой, которая руководствуется молекулой РНК. Это было огромным улучшением по сравнению с ранее разработанными редакторами генома, которые полагались на взаимодействие белково-нуклеиновой кислоты, поскольку основным преимуществом системы CRISPR-Cas9 является то, что она полагается на молекулу РНК для целевой области интереса. Это означает, что система опирается на взаимодействие РНК-ДНК и, таким образом, стандартные правила базового сопряжения могут быть использованы при проектировании каждогоэксперимента 15.

Система CRISPR-Cas9, подробно описанная здесь, состоит из трех основных компонентов: одногидной РНК (sgRNA), фермента Cas9 и донорской ДНК (dDNA)17. SgRNA состоит из 20 нуклеотидной области, называемой протопространственница, а также более длинной области, называемой эшафот18. Область протопространственного используется для руководства системой редактирования в целевой регион и, таким образом, переработана для каждого эксперимента. Эшафот является областью РНК, которая физически связывается с ферментом Cas9, чтобы сформировать рибонуклеопротеин (RNP) и, таким образом, идентичны независимо от региона, который будет мишенью. Фермент Cas9 физически облегчает расщепление ДНК цели, используя протопространство в качестве руководства для идентификации этой области19. Последний компонент, dDNA, является необязательным и его использование зависит от конкретного эксперимента20. DDNA гавани последовательность, которая должна быть специально вставлена в регионе разрезается ферментом Cas9, и, таким образом, идеально подходит для генных экспериментов стук, где ген вводится в геном или для гена нокаут экспериментов, где ген устойчивости к антибиотикам или другой выбираемый маркер вводится для замены гена интереса. DDNA также может быть разработан таким образом, чтобы ввести новые последовательности в геном. Например, как описано ниже, можно ввести в кадре стоп-кодон в конкретной области в гене интереса, когда уточение генатребуется 21. Другие приложения включают мутацию определенных областей гена, таких как функциональныйдомен 22, или введение последовательности пометки23.

Основным преимуществом использования системы CRISPR-Cas9 является ее универсальность24. Одним из примеров этой приспособляемости является то, что фермент Cas9 может быть введен в клетку-хозяина в одной из трех его форм – ДНК, РНК или белка – в зависимости от конкретной используемой системы трансформации. При введения в форме ДНК, ген cas9 часто включается в плазмиду вместе с выбираемым маркером, кассетой для выражения sgRNA и, при необходимости, кассетой, кодирующей последовательность dDNA25. Основным преимуществом этой системы является то, что только одна конструкция должна быть преобразована в ячейку, и успешная трансформация гарантирует наличие всех необходимых компонентов для редактирования генома при посредничестве CRISRP-Cas9. Однако этот метод опирается на наличие системы выражения для видов-хозяек. Для того, чтобы Cas9 успешно вызвать повреждение ДНК, он должен быть выражен на высоком уровне, и, таким образом, подходящий и потенциально специфический промоутер не требуется. Для не-модельных видов, где такие промоутеры еще не были разработаны, это может быть фактором, который отвлекает, и, таким образом, возможность внедрения Cas9 в РНК или белковой форме может быть более привлекательным вариантом. Внедрение РНК в клетку приносит свои собственные проблемы, особенно в том, что РНК нестабильна и не может выжить в процессе трансформации. Кроме того, при введения в виде ДНК или РНК, последовательность генов Cas9, возможно, потребуется оптимизировать кодон для использования в конкретной принимающей системе17. Например, ген cas9 от Streptococcus pyogenes может не работать в клетке-хозяине млекопитающих, а ген cas9, оптимизированный для использования в клетке млекопитающих, может не работать в растительной клетке. Все эти проблемы могут быть преодолены с помощью белковой формы Cas9, которая, вместе с sgRNA, может быть собрана в RNP и преобразована вклетку-хозяина 26,27. Эта система не опирается на какую-либо эндогенную систему выражения или оптимизацию кодона и, таким образом, должна работать в большинстве немодеородных видов. Недостатком системы на основе белка является то, что она не совместима с системами трансформации на основе ДНК, такими как Agrobacterium-опосредованнаяпередача. Таким образом, для того, чтобы метод на основе белка работал, необходимо иметь в наличии протокол трансформации, такой как те, которые полагаются на протопласты или биолистику. Эта система на основе RNP была успешно использована в нитеозных грибов, Fusarium оксиспорум26 и Mucor circinelloides27.

Huntiella omanensis, член семьи Ceratocystidaceae, является космополитическим грибом часто встречается на свежераненых древесныхрастений 28. В то время как высококачественные данные генома и транскриптомадоступны для этого вида 28,29,30, никаких преобразований или протоколов редактирования генома не были разработаны. На сегодняшний день, исследования на H. omanensis была сосредоточена на основных генетических компонентов своего сексуальногоцикла 29,31. Этот гриб проявляет типичный гетероталический половой цикл, с половым размножением происходит исключительно между изолятами MAT1-1 и MAT1-2 спариваниятипов 31. В отличие от MAT1-2 изоляты тесно связанных Huntiella moniliformis способны к независимому половому размножению и завершить половой цикл в отсутствие партнера MAT1-131. Эта разница в сексуальных возможностях, как полагают, по крайней мере частично, из-за значительной разницы в гене спаривания, MAT1-2-7, где H. omanensis гавани полной длины и нетронутой копии, в то время как ген сильно усечен в H. moniliformis29,31. Для дальнейшей характеристики роли этого гена в половом размножении, MAT1-2-7 ген H. omanensis был усечен, чтобы имитировать усечение видели в H. moniliformis21.

В протоколе ниже подробно говорится о преобразовании H. omanensis и truncation гена MAT1-2-7 с использованием белковой версии системы редактирования генома CRISPR-Cas9. Этот протокол был разработан после того, как подходы к гомологичной рекомбинации на основе замены генов и плазмидной основе редактирования генома CRISPR-Cas9 оказались безуспешными.

Protocol

1. Проектирование и синтез sgRNA Чтобы определить потенциальные регионы протопространственного, которые будут в составе sgRNA, вручную искать через ген-интерес для 5′ NGG 3′ тройни, используя функцию поиска в какой бы программе используется. Аннотировать эти тройни, как PAM последовательностей.ПРИМЕЧАНИЕ: Доступны различные программы, которые ищут и аннотируют потенциальные последовательности PAM и protospacer. Выберите 20 bp вверх по течению каждой из идентифицированных последовательностей PAM и аннотировать эти последовательности в качестве потенциальных протопространсеров. Чтобы определиться с одним протопространственницы, выполните следующие шаги фильтрации, чтобы отказаться от низкого качества последовательностей. Чтобы проверить специфичность потенциальных протопространсеров, объединить последовательность PAM и протопространсер в единую последовательность и использовать его в качестве запроса BLASTn против всего генома. Откажитесь от любых протопространсеров, которые показывают сходство с любой областью в геноме, кроме целевой области(рисунок 1A). Для обеспечения того, чтобы молекула РНК складывалась в правильную 3D-структуру для связывания с ферментом Cas9, создайте комбинированную последовательность, включая протопространство и последовательность эшафота, специфичную для фермента Cas9. Загрузите каждую из комбинированных последовательностей протопространственного леса в инструмент прогнозирования вторичной структуры РНК(Таблица материалов). Проанализируйте результаты, сравнив минимальную свободную энергию и центроидные вторичные структуры.ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальные кандидаты-протопространды будут иметь одинаковые минимальные свободные энергии и центроидные вторичные структуры. Обе вторичные структуры должны состоять из трех стволовых петель, прерванных пятью кольцевых структурами. Структуры должны также проявлять высокую вероятность связывания (показаны красным цветом) по всей структуре, за исключением региона, представляющего протопространство(рисунок 1B). Фактические значения энергии не имеют значения. Выберите конечного кандидата из тех, кто прошел вышеуказанные шаги фильтрации, выбрав кандидата, который находится ближе всего к конкретному региону, на который идет мишень. Для синтеза sgRNA в качестве одной молекулы РНК, используйте комплект синтеза sgRNA(Таблица материалаs) совместимый с конкретным ферментом Cas9, который будет использоваться (например, Cas9 от Streptococcus pyogenes).ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги могут зависеть от используемого комплекта синтеза sgRNA. В случае, если используется другой комплект, следуйте инструкциям производителя. Кроме того, sgRNA можно заказать предварительно синтезированы. При работе с РНК используйте реагенты без нуклеазы и одноразовые. Если 20 bp протопространитель, выбранный в шаге 1.3 выше, не укрывает G в конце 5′, добавьте G в этот регион. Добавьте последовательность промоутеров T7 к концу целевой последовательности 5′ Эта последовательность является стандартной и 5′ TTCTAACGACTCACTATAG 3′. Добавьте последовательность перекрытия 14 nt к концу целевой последовательности 3′ Эта последовательность является комплект конкретных и 5′ GTTTTAGAGCTAGA 3 ‘для комплекта, используемого здесь. Заказать полученный фрагмент 5′ TTCTAACACTCACTATAG(N)20 GTTTTAGAGCTAGA, с (N)20 представляющих выбранный протопространитель presynthesized (Таблица материалов). В соответствии с протоколом производителя(Таблица материалов), объединить следующие реагенты при комнатной температуре: 2 МЛ воды, 10 йл буфера реакции, 5 йл синтезированных протопространственной последовательности, 1 йл 0,1 МТТ и 2 йл фермента транскриптазы. Инкубировать этот раствор при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут и перейти на лед. Добавьте 30 йл воды и 2 МКЛ DNase I, смешайте и инкубировать при 37 градусов по Цельсию еще 15 мин. Визуализуй полученную sgRNA на 2% агарозный гель. 2. Тестирование способности расщепления in vitro sgRNA ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным, но рекомендуется. Дизайн грунтовки, которые будут усиливать фрагмент укрывательство последовательность сайта, что выбранная sgRNA будет направлена и усилить регион с помощью стандартной полимеразы ДНК.ПРИМЕЧАНИЕ: Если возможно, дизайн грунтовки таким образом, что расщепление на целевом сайте будет производить два фрагмента очень разных размеров, которые можно легко отличить друг от друга на стандартном агарозе гель. Соберите комбинированный рибонуклеопротеин sgRNA-Cas9 (RNP), инкубируя раствор, состоящий из 30 nM sgRNA, синтезированных выше, 30 nM Cas9 белка, 10x буфер реакции и 10 МКЛ воды при 25 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Проверьте способность расщепления sgRNA, добавив продукт ПЦР целевого региона в решение RNP до конечной концентрации 3 nM. Инкубировать раствор при 37 градусов по Цельсию в течение 15 мин. Добавьте 3 мкг протеиназы K и 2 мкг RNase к раствору, чтобы остановить реакцию расщепления и инкубировать при комнатной температуре в течение 10 минут. Визуализуя полученные фрагменты ДНК на 2% агарозовом геле. SgRNA подходит для экспериментов in vivo, если на геле наблюдаются две полосы ожидаемого размера. 3. Проектирование и синтез dDNA Дизайн dDNA будет состоять из трех регионов- 5′ и 3′ регионов с взаимодополняемость геномного региона мишенью и среднего региона укрывательство выбираемый маркер(Таблица материалов, рисунок 2).ПРИМЕЧАНИЕ: Другие конкретные последовательности также могут быть добавлены к этому выбираемому маркеру. Для этого конкретного эксперимента, стоп-кодон последовательность (5′ TGA 3′) был добавлен незадолго до выбора маркера, тем самым вводя в кадре стоп-кодон в ген. DDNA можно заказать presynthesized. Кроме того, dDNA может быть усилена и собрана с помощью шаг за шагом, перекрытия ПЦР подход, как описано ниже. Дизайн грунтовки, чтобы усилить около 800 bp из 5′ и 3′ фланговых регионов. Добавьте 20 nt последовательности, которая дополняет последовательность выбираемого маркера к обратной грунтовки региона 5′ и форвардной грунтовки 3′ региона. Дизайн грунтовки, которые усиливают выбираемый маркер, гарантируя, что усиленный продукт гавани ген сопротивления, а также промоутер, как известно, работают в видах, представляющих интерес. Используя полимеразу ДНК высокой точности(Таблица материалов),усиливайте три области dDNA. Усиление 5′ и 3′ регионов от gDNA организма редактируется. Увеличь выбираемый маркер из соответствующего источника. В одной реакции объедините усиленную область 5′ с выбираемым маркером и, используя полимеразу ДНК дальнего радиуса действия, усиливают всю область. Во второй одной реакции объединить усиленную область 3′ с выбираемым маркером и, используя полимеразу ДНК дальнего радиуса действия, усилить всю область. Наконец, объединить два предыдущих продукта ПЦР в единую реакцию и усилить всю последовательность dDNA с дальнего, высокой точности ДНК полимеразы. Визуализировать фрагмент ДНК на 1% агарозного геля. В случае, если производятся два или более фрагментов, очистите правильно размер фрагмента от геля с помощью комплекта для очистки геля. 4. Извлечение протопластов Для производства конидии, привить 200 мл свежего 2% солодового экстракта бульона (MEB) в 500 мл колбы с 1 см х 1 см мицелии покрытые агар блока.ПРИМЕЧАНИЕ: Не все грибы способны производить конидию. В этом случае, mycelia также может быть использован. Это, как правило, требует более высоких концентраций фермента лисирования дальше в протоколе. Инкубировать жидкую культуру в трясущимся инкубаторе при 25 градусов по Цельсию при тряске при 120 об/мин при 24 – 48 ч.ПРИМЕЧАНИЕ: Это инкубацио время и температура была оптимизирована для H. omanensis. Это необходимо будет оптимизировать для других видов. Для сбора конидии; фильтровать жидкую культуру через слой стерильной лабораторной ткани (например, Miracloth), передавать конидиальную суспензию в 50 мл центрифуг трубки и центрифуги при 3220 х г при 4 градусов по Цельсию в течение 10 мин. Откажитесь от супернатанта. Resuspend конидии в 5 мл воды и пипетки 10 йл раствора конидии на слайд микроскопа и накрыть крышкой. Визуализация с помощью соединения микроскопа под 40x увеличение для обеспечения только конидии были восстановлены (Рисунок 3A). В колбе объемом 500 мл прививают 200 мл свежей 1% МЭБ с общим объемом перерасхода конидии. Инкубировать жидкую культуру в трясущимся инкубаторе при 25 градусов по Цельсию при тряске при 120 об/мин до 12 ч.ПРИМЕЧАНИЕ: Это время инкубации было оптимизировано для H. omanensis. Это необходимо будет оптимизировать для других видов. Для сбора зародышей перенесите жидкую культуру в 50 мл центрифугных трубок и центрифуг при 3220 х г при 4 градусах Цельсия в течение 10 мин. Откажитесь от супернатанта. Повторное распространение проросток до 10 мл 1 М сорбитол. Pipette 10 йл прорастания раствора на слайд микроскопа и крышка с крышкой. Визуализация с помощью соединения микроскопа под 40x увеличение для обеспечения только прорастание были восстановлены (Рисунок 3B).ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь. Храните проростки в 1 M сорбитол при -80 градусов по Цельсию. Чтобы озимить клеточные стенки молодых прорастающих и выпустить протопласты, добавьте 1 мл прорастающих суспензий до 9 мл фермента лизайного фермента в различных концентрациях в стерильной колбе 50 мл.ПРИМЕЧАНИЕ: Используются различные концентрации ферментов и инкубационые времена, которые можно найти в таблице 1. Ферменты и концентрации также могут варьироваться в зависимости от гриба и должны быть оптимизированы для каждого вида. Инкубировать споро-ферментный раствор в трясущимся инкубаторе при 25 градусах Цельсия при тряске при 80 об/мин в течение 2-3 ч. Фильтр протопласт раствор через слой стерильной лабораторной ткани и собирать протопласты центрифугации при 1810 х г при 4 градусов по Цельсию в течение 10 мин. Откажитесь от супернатанта.ПРИМЕЧАНИЕ: Протопласты являются клетками без клеточных стенок и, таким образом, очень чувствительны к механическим нарушениям. Будьте уверены, чтобы справиться с ними тщательно, особенно при трубопроводе. Тщательно resuspend протопласт гранулы в 200 йл буфера STC(Таблица материалов). Pipette 10 йл протопластового раствора на слайд микроскопа и крышка с крышкой. Визуализация с помощью соединения микроскопа под 40x увеличение для обеспечения только протопласты были восстановлены (Рисунок 3C). Используя гемоцитометр, подсчитайте и вычислите количество протопластов, генерируемых в вышеуказанных шагах. Разбавьте протопластический раствор в алициты, содержащие примерно 5 х 106 протопластов.ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь. Храните протопласты в буфере STC при -80 градусов по Цельсию. 5. Протопласт и ПЕГ-помощь преобразования и преобразования восстановления Чтобы начать преобразование, объединить приблизительно 5 х10 6 протопластов с одним объемом раствора RNP и приблизительно 6 мкг фрагмента dDNA.ПРИМЕЧАНИЕ: Протопласты очень чувствительны к механическим нарушениям. Будьте уверены, чтобы справиться с ними тщательно, особенно при трубопроводе. Используя пипетку, медленно капайте 1 мл свежеприготовленного 30% раствора PTC на раствор протопласта и инкубировать раствор при комнатной температуре в течение 20 минут.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является чувствительным и очень важным шагом. Убедитесь в том, чтобы использовать свежеприготовленный раствор PTC и падение раствора над клетками как можно медленнее и равномерно, создавая гидрофобный слой по всей поверхности клетки. Добавьте 5 мл осмотической среды управления (OCM) в раствор протопласта и пипетку медленно и мягко, чтобы обеспечить тщательное смешивание раствора. Инкубировать раствор протопласта в трясущимся инкубаторе при 25 градусах Цельсия при тряске при 80 об/мин за ночь. Чтобы выбрать преобразованные изоляты, разделите раствор на 5 пустых 60-мм пластин культуры. Добавьте 10 мл Агара OCM, дополненного 30 мкг/мл гигромицина B к каждой пластине культуры, и медленно поверните каждую пластину, чтобы тщательно перемешать. Разрешить первый слой агара установить перед добавлением 10 мл осмотического контроля среднего агара дополняется 40 мкг / мл гигромицина B. Разрешить второй слой агара, чтобы установить и инкубировать культур при 25 градусов по Цельсию, пока одиночные изоляты можно увидеть растет через оба слоя агара. Чтобы восстановить успешно преобразованные изоляты, перенесите отдельные изоляты, способные к росту через агарный слой, дополненный 40 мкг/мл гигромицина B, на свежие солодовые экстракты агара (MEA), дополненные 50 мкг/мл гигромицина B (MEA-50). Инкубировать свежие культуры при 25 градусов по Цельсию в течение 5 дней, ежедневно проверяя на рост. Культуры, способные к устойчивому росту на этих средствах массовой информации, успешно трансформировались и могут быть использованы для дальнейшего изучения. 6. Подтверждение интеграции и стабильности ДДНА Для того, чтобы подтвердить, что dDNA была интегрирована в геном в целевой области, дизайн грунтовки, что фланг предсказал 5′ и 3’ вставки сайтов(рисунок 2). Выполните два ПЦР с помощью этих двух наборов грунтовки и полимеразы ДНК высокой точности. Если оба ПЦР дают ампликоны ожидаемого размера и последовательности, ДДНА успешно интегрируется в целевой регион. Затем оцените мутант пятно для стабильной интеграции dDNA. Для того, чтобы подтвердить, что dDNA была стабилико интегрирована в геном и будет поддерживаться во время вегетативного роста, выполнить тест передачи средств массовой информации. Передача блока mycelial покрытые агара от активно растущего мутанта изолировать на MEA-50 средних до неизгладимых MEA среды. Инкубировать при 25 градусов по Цельсию в течение 3 дней. Перенесите блок агара, покрытого мизелией, из изолята, растущего на среде MEA, в среду MEA-50. Инкубировать при 25 градусов по Цельсию в течение 3 дней. Повторите этот процесс, перенося активно растущую мизелию из дополненной в неоплоделированную среду, по крайней мере, на четыре раунда.ПРИМЕЧАНИЕ: Если изолят способен к устойчивому росту на МЕА-50 среды после многих переводов, dDNA была устойчиво интегрирована в геном и может быть сохранена за счет вегетативного роста. Мутант пятно может быть оценено на наличие только одной копии интегрированного dDNA. Для того, чтобы подтвердить, что dDNA была интегрирована в геном в одном месте, выполнить анализ южной помарки. Дайджест в общей сложности 30 мкг гДНА из каждого штамма мутантов с использованием ферментов ограничения HindIII и EcoRI в соответствии с протоколами производителя.ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как выбор фермента ограничения до исследователя, убедитесь, что место распознавания фермента ограничения не присутствует в последовательности dDNA. Разделите переваренный гДНК на 0,75% агарозного геля и перенесите ДНК на нейлоновую мембрану с помощью стандартныхпроцедур 32. Подвергнуте мембрану гибридизации с помощью зонда, нацеленного на последовательность dDNA. Дизайн грунтовки для усиления короткой (300 bp) области dDNA. Используя эти грунтовки, синтезировать зонд с помощью PCR DIG маркировки смеси. Используйте недавно синтезированный зонд для гибридизации мембран, лечения и визуализации с использованием стандартныхпроцедур 32. Если в каждой полосе виден только одна полоса движения, то dDNA присутствует только в одном месте в геноме. Штамм мутантов теперь может использоваться для дальнейшего фенотипического анализа и экспериментов с функциональной характеристикой. 7. Фенотипический анализ штаммов мутантов Проведение брачных экспериментов, чтобы определить, повлияло ли нарушение гена MAT на сексуальные возможности изучаемого гриба.ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг зависит от конкретного гена и изучаемых видов. В этом случае считается, что таргетинг гена участвует в половом размножении и, таким образом, были проведены брачные тесты. Если ген думал, например, участвовать в бесполом воспроизводстве, то что-то вроде конидиального производства может быть измерено. Для того, чтобы проверить гетероталические возможности штамма мутантов, со-прививают свежие meA среды с мутантным штаммом, а также штамм противоположного типа спаривания. В случае H. omanensis, держитекрышки пластин закрытыми, но не запечатанными и инкубировать при комнатной температуре в течение 7 дней. Визуально оценить для производства половых структур. Для того, чтобы проверить гомоталические возможности штамма мутантов, привить свежую среду MEA с мутантным штаммом. В случае H. omanensis, держитекрышки пластин закрытыми, но не запечатанными и инкубировать при комнатной температуре в течение 7 дней. Визуально оценить для производства половых структур. Проведение экспериментов по темпам роста, чтобы определить, повлияло ли нарушение гена MAT на темпы роста изучаемого гриба. Создайте mycelial покрытые агар пробки из активно растущего края культур мутантов и штаммов дикого типа, вставив заднюю сторону большой, стерильной наконечник пипетки в агар. Прививка свежей среды MEA с этими агар пробками. Убедитесь, что на каждый тип культуры воспроизводятся по крайней мере три репликации. После 3 дней роста при 20 градусов по Цельсию, измерить рост на двух перпендикулярных диаметров. Сравните данные из штаммов дикоготипа и мутантов.

Representative Results

Описанный выше протокол способствовал введению преждевременного стоп-кодона в ген спаривания из не-модельного аскомицета H. omanensis. Этот процесс использовал версию системы редактирования генома CRISPR-Cas9 и как таковой одним из наиболее важных шагов в этом протоколе является проектирование и синтез высококачественной sgRNA. На рисунке 1 показано, как эта молекула была разработана таким образом, что она А) специально нацелена на ген, представляющий интерес, и показывает небольшое сходство с другими регионами в геноме и B) складки правильно, чтобы связать с белком Cas9. SgRNA также должны быть способны эффективно расщепляя целевой регион. Способность sgRNA к цели и позволяют расщепление целевой области была проведена в пробирке, что дает два продукта ожидаемого размера. После успешной трансформации важно обеспечить интеграцию ДДНА в геном только один раз и в ожидаемом месте. Рисунок 2 иллюстрирует дизайн праймеров ПЦР, которые нацелены на сайты вставки, которые могут быть использованы для проверки потенциальных трансформаторов для правильного сайта интеграции. При проектировании грунтовок, которые фланг 5′ и 3′ вставки сайтов, усиление возможно только в том случае, если dDNA вставляется в правильной области. Рисунок 4 иллюстрирует, что преждевременный стоп-кодон был введен в ген MAT1-2-7 в правильную рамку чтения, гарантируя, что ген будет усечен таким же образом, что и H. moniliformis. Кроме того, анализ южных помарки показал, что конструкция dDNA была интегрирована только на одном участке в геноме. Успех протокола был подтвержден на фенотипический анализ штаммов мутантов. В случае эксперимента по нарушению MAT1-2-7 были разработаны два независимых штамма мутантов. В обоих изолятах вегетативные радиальные темпы роста были значительно снижены, что свидетельствует о плейотропном эффекте нового брачного гена(рисунок 5). Кроме того, мутантные изоляты были неспособны завершить половой цикл, производя только незрелые сексуальные структуры, которые не производили сексуальных спор(рисунок 5). Это было в отличие от изолятов дикого типа, которые завершили весь половой цикл в течение нескольких дней инкубации(рисунок 5). Рисунок 1: Выбор подходящего кандидата sgRNA.(A)Подходящая sgRNA будет иметь только сходство с целевой областью генома (в данном случае указывается на последовательность локуса MAT). (B) Подходящая sgRNA будет иметь идентичные минимальные свободные энергии и центроидные вторичные структуры, с тремя стволовыми петлями и пятью кольцами в основной петле шага. Кроме того, большая часть структуры будет иметь высокую вероятность связывания (указанную в темно-оранжевом и красном цветах), в то время как более низкие связывающие вероятности должны быть видны в области протопространственного (указывается черными треугольниками). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 2: Проектирование, усиление и сборка dDNA.Первая и вторая грунтовое пары (PP1 и PP2) используются для усиления примерно 800 bp вверх по течению (5′) и 800 bp вниз по течению (3′) гена интереса. Обратная грунтовка PP1 и передовая грунтовка PP2 включают области гомологии к кассете сопротивления гигромицина. Третья грунтовка усиливает всю кассету сопротивления гигромицина. В шаг за шагом, различные amplicons собираются до тех пор, пока весь dDNA, состоящий из 5 ‘ области, гигромицин сопротивление кассеты и 3’ области, собирается. При преобразовании в клетку, dDNA должны рекомбинировать в регионе, где фермент Cas9 будет направлен на разрез, тем самым заменив ген интереса с гигромицин резистентности кассеты. PP4 и PP5 могут быть использованы для определения правильной вставки dDNA в геном в соответствующем месте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 3: Различные типы клеток важны во время протокола извлечения протопласта.(A)Conidia используются в качестве исходного материала для протокола. Эти конидии разрешено прорастать и расти, пока они не (B) молодых проросток. Идеальная фаза роста молодых прорастащих указывается двумя черными стрелками. Другие mycelial нити видели на (B) являются слишком зрелыми для деградации и не должны использоваться. Заключительным шагом протокола является выпуск(C) круглыхпротопластов, обозначенных черными, пунктирными кругами. Эти клетки больше не имеют клеточных стенок и, таким образом, очень чувствительны к механическим нарушениям. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 4: Успешная интеграция TGA остановить кодон в MAT1-2-7 ген H. omanensis.(A) Полнометражный ген H. omanensis MAT1-2-7, с целевым участком sgRNA, указанным зеленой стрелкой. (B)Увеличенная схема целевого участка sgRNA в гене H. omanensis MAT1-2-7. (C) Увеличенная схема области dDNA показывая стоп-кодон в окружении оружия гомологичный к MAT1-2-7 гена H. omanensis. (D) Краматограмма последовательности Сэнгера, указывающая на успешную интеграцию стоп-кодона в ген MAT1-2-7. Изменено от Wilson et al. 202021. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Рисунок 5: Фенотипические различия между (A) изолятами дикого типа и (B) мутантами- изолятами.Первые три изображения в каждой панели показывают различия в сексуальных возможностях двух типов изолятов. В то время как изоляты дикого типа образуют зрелую аскомату во время полового размножения, в комплекте с источением спор из кончиков аскоматальных шеи, мутантные изоляты образуют только незрелые сексуальные структуры, которые не производят никаких сексуальных спор. Четвертое изображение в каждой панели показывает разницу в темпах роста и морфологии двух типов изолятов. В то время как изолят дикого типа растет гораздо быстрее и с более воздушной мизелии, мутант показывает медленнее и погружается в агар. Изменено от Wilson et al. 202021. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры. Реакции Концентрация ферментов Время деградации A 1.250 мг/мл 180 мин. B 1,875 мг/мл 180 мин. C 2.500 мг/мл 150 мин. D 3,750 мг/мл 150 мин. E 4.375 мг/мл 120 мин. F 5.000 мг/мл 120 мин. Таблица 1: Деградация раствора прорастающих/мицелий с лизингой ферментов из Trichoderma harzianum. Различные концентрации ферментов соответствуют различным инкубационный период, с более низкими концентрациями, требующими более длительных инкубаций.

Discussion

Протокол успешной трансформации H. omanensis и редактирования гена MAT1-2-7 был продемонстрирован путем введения в кадре преждевременного стоп-кодона вместе с геном устойчивости к гигромицину B21. Это было достигнуто с помощью белковой версии системы редактирования генома CRISPR-Cas9. Эксперимент повлек за собой транскрипцию в пробирке sgRNA, ПЦР-сборки dDNA и совместное преобразование этих двух нуклеиновых кислот с коммерчески доступным ферментом Cas9 в протопласты, извлеченные из H. omanensis

В отличие от других протоколов, которые полагаются на наличие многих других молекулярных инструментов, описанный выше протокол может быть успешно использован в видах, для которых молекулярный набор инструментов по-прежнемудовольно ограничен 21. Протокол опирается только на установленную систему преобразований и наличие данных NGS, предпочтительно всей последовательности генома. В то время как эффективная система трансформации может занять некоторое оптимизацию в видов, для которых это не доступно, Есть много различных протоколов, доступных для различных видов. Кроме того, данные генома становятся все более доступными даже для самых неясных видов и становится легче генерировать de novo, если он еще не существует.

Учитывая длину протокола, существует множество шагов, на которых могут быть внесены изменения и где может потребоваться устранение неполадок. Это особенно верно в отношении шагов, которые считаются специфическими видами. Например, в этом протоколе есть много этапов инкубации, которые необходимо проводить при определенных температурах и в течение определенного периода времени для создания типов клеток, важных для эксперимента. Таким образом, эти шаги потребуют оптимизации конкретных видов. Там, где это возможно, были предоставлены микрографы конкретных клеток или фаз роста для оказания помощи в передаче этого протокола другому виду (Figure 1). Тип и концентрация ферментов, используемых для деградации клеточных стенок грибковых клеток для высвобождения протопластов, также будут специфичны для изучаемых видов грибов. В этом протоколе используется только один источник ферментов лизай- из, в то время как различные комбинации ферментов необходимы для извлечения протопластов у таких видов, как Fusarium verticillioides33. Этот шаг полностью зависит от химической продукции клеточной стенки и, таким образом, должны быть оптимизированы на видовой основе.

Этот метод имеет особенно важное значение для тех, кто изучает не моделные виды, поскольку нет никакой зависимости от системы выражения. Популярным методом создания системы редактирования генома CRISPR-Cas9 является выражение белка Cas9, sgRNA, а также dDNA из одной или двух плазмидов, которые преобразуются в клетки выбора. В этом случае Cas9 должен быть выражен промоутером, который способен к высокому уровню экспрессии в конкретном изучаемом организме. Общие промоутеры были разработаны для использования в нитеозных грибов и, хотя они не совместимы во всех видах, они позволяют низкий уровень экспрессии и может быть успешно использован для выражения, например, гены устойчивости к антибиотикам. Эти промоутеры, однако, часто не позволяют высокий уровень выражения и, таким образом, не могут быть использованы для выражения белка Cas9. Использование белковой версии системы редактирования генома CRISPR-Cas9 преодолевает это ограничение и позволяет трансформировать sgRNA и dDNA в клетку с уже произведенным ферментом Cas9.

Разработка этой белковой системы для использования в H. omanensis произошла после многих неудачных попыток редактирования генома с использованием как классического подхода сплит-маркеров, так и плазмидной системы CRISPR-Cas9. Хотя эффективность отличается от вида к виду, сплит маркер подход был успешно использован со 100% эффективностью в видах, как разнообразны, как Alternaria alternata34,35, и C. nicotianae36. В отличие от этого, эффективность этой системы в H. omanensis была нулевой, несмотря на более чем 80 независимых мероприятий по трансформации и интеграции. Аналогичным образом, плазмидная система CRISPR-Cas9 успешно используется с высокой эффективностью в Trichoderma reesei (nogt;93%)17 и Penicillium chrysogenum (до 100%)37. Это, опять же, в отличие от полезности этой системы в H. omanensis. Достаточное выражение белка Cas9 не было достижимо в H. omanensis, несмотря на попытки ряда потенциальных промоутеров, в том числе двух видов конкретных промоутеров предсказал от домашнего хозяйства генов. Таким образом, эта система не может быть использована вообще. Использование белковой версии системы CRISPR-Cas9, однако, дало много независимых трансформаторов, два из которых укрывал интегрированный dDNA в правильном месте. Кроме того, этот эксперимент был предпринят только один раз и был успешным, что еще больше иллюстрирует легкость, с которой эта система может быть использована.

Будущие применения этого протокола включают его оптимизацию и использование в других видах Ceratocystidaceae. Существует уже множество данных NGS доступны для этих видов30,38,39 и исследования, касающиеся ихпринимающей специфики 40, темпы роста и вирулентность41 были проведены., Эти исследования могут быть усилены функциональной характеристикой генов, которые, как полагают, участвуют в этих процессах, исследования, которые теперь станут возможными из-за наличия протокола преобразования и редактирования генома.

В заключение я хотел бы отметить, что тщательное исследование генов, лежащих в основе важных биологических процессов у не моделей видов, становится все более доступным благодаря наличию простых в использовании протоколов редактирования генома, которые не зависят от наличия обширных биологических ресурсов и молекулярных инструментариев. Изучение не моделей видов становится все проще и позволит найти новые пути и интересные отклонения от стандартных биологических процессов, которые были выяснены в модельных видах.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Этот проект был поддержан Университетом Претории, Кафедрой науки и техники (DST)/Национальным исследовательским фондом (NRF) Центром передового опыта в области биотехнологии здоровья деревьев (CTHB). Проект был дополнительно поддержан профессор BD Wingfield в DST / NRF SARChI кафедры в грибной геномики (Грант номер: 98353), а также Д-р AM Уилсона NRF PhD стипендий (108548). Владельцы грантов признают, что мнения, выводы и выводы или рекомендации, высказанные в этой части работы, являются мнениями исследователей и что финансные органы не будут принимать на себя никакой ответственности в этом отношении.

Materials

EcoRI-HF New England Biolabs, Ipswich, USA R3101S
EnGen Spy Cas9 NLS protein New England Biolabs, Ipswich, USA M0646T Used to assemble the RNP
Eppendorf 5810 R centrifuge Eppendorf, Hamberg, Germany
FastStart Taq DNA Polymerase Sigma, St Louis, USA 12032902001 Standard DNA polyermase
GeneJET Gel Extraction Kit ThermoFisher Scientific, Waltham, USA K0691
HindIII-HF New England Biolabs, Ipswich, USA R3104S
HiScribeTM T7 Quick High Yield RNA synthesis kit New England Biolabs, Ipswich, USA E2050S
Hygromycin B from Streptomyces hygroscopicus Sigma, St Louis, USA 10843555001
Infors HT Ecotron Shaking Incubator Infors AG, Bottmingen, Switzerland
LongAmp Taq DNA Polymerase New England Biolabs, Ipswich, USA M0323S Long-range, high-fidelity DNA polymerase
Malt extract agar, 2% (MEA) 20 g ME and 20 g agar in 1 l ddH20
Malt extract Sigma, St Louis, USA 70167-500G
Agar Sigma, St Louis, USA A5306
Malt Extract broth, 1% (MEB) Sigma, St Louis, USA 70167-500G 2 g ME in 200 ml ddH20
Malt Extract broth, 2% (MEB) Sigma, St Louis, USA 70167-500G 4 g ME in 200 ml ddH20
Miracloth Merck Millipore, New Jersey, USA 475855
Nylon membrane (positively charged) Sigma, St Louis, USA 11209299001
Osmotic control medium (OCM) 0.3% yeast extract, 20% sucrose, 0.3% casein hydrolysate
Casein Hydrolysate Sigma, St Louis, USA 22090
Sucrose Sigma, St Louis, USA 84097
Yeast extract Sigma, St Louis, USA Y1625
Osmotic control medium (OCM) agar Osmotic control medium (OCM) + 1% agar
Agar Sigma, St Louis, USA A5306
PCR DIG Labeling Mix Sigma, St Louis, USA 11585550910
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase ThermoFisher Scientific, Waltham, USA F-530XL High fidelity DNA polymerase
Plasmid pcb1004 N/A N/A From: Carroll et al., 1994
Presynthesized sgRNA Inqaba Biotec, Pretoria, South Africa Ordered as an synthesized dsDNA with specified sequence
Proteinase K Sigma, St Louis, USA P2308
PTC Solution 30% polyethylene glycol 8000 in STC buffer from above
Polyethylene glycol 8000 Sigma, St Louis, USA 1546605
RNase A ThermoFisher Scientific, Waltham, USA 12091021
RNAfold Webserver Institute for Theoretical Chemistry, University of Vienna N/A http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi
RNAstructure Mathews Lab N/A https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html
Sorbitol, 1 M Sigma, St Louis, USA 1617000 182.17g sorbitol in 1 l ddH20
STC Buffer 20% sucrose, 50 mM Tris-HCl pH 8.00 and 50 mM CaCl2
Calcium chloride Sigma, St Louis, USA 429759
Tris-HCl pH 8.00 Sigma, St Louis, USA 10812846001
Sucrose Sigma, St Louis, USA 84097
Trichoderma harzianum lysing enzymes Sigma, St Louis, USA L1412
Zeiss Axioskop 2 Plus Ergonomic Trinocular Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Ekblom, R., Galindo, J. Applications of next generation sequencing in molecular ecology of non-model organisms. Heredity. 107, 1-15 (2011).
  2. Russell, J. J., et al. Non-model model organisms. BMC Biology. 15 (55), 1-31 (2017).
  3. Kück, U., Hoff, B. New tools for the genetic manipulation of filamentous fungi. Applied Microbiology and Biotechnology. 86, 51-62 (2010).
  4. Li, D., Tang, Y., Lin, J., Cai, W. Methods for genetic transformation of filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 16 (168), 1-13 (2017).
  5. Lorito, M., Hayes, C. K., Di Pietro, A., Harman, G. E. Biolistic transformation of Trichoderma harzianum and Gliocladium virens using plasmid and genomic DNA. Current Biotechnology. 24, 349-356 (1993).
  6. Taylor, P., et al. Transformation of intact Aspergillus niger by electroporation. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 58 (12), 2224-2227 (2014).
  7. Dhawale, S. S., Paietta, J. V., Marzluf, G. A. A new, rapid and efficient transformation procedure for Neurospora. Current Genetics. 8, 77-79 (1984).
  8. Sayari, M., Van Der Nest, M. A., Steenkamp, E. T., Adegeye, O. O., Marincowitz, S. Agrobacterium-mediated transformation of Ceratocystis albifundus. Microbiological Research. 226, 55-64 (2019).
  9. Meyer, V. Genetic engineering of filamentous fungi- Progress, obstacles and future trends. Biotechnology Advances. 26, 177-185 (2008).
  10. You, B. J., Lee, M. H., Chung, K. R. Gene-specific disruption in the filamentous fungus Cercospora nicotianae using a split-marker approach. Archives of Microbiology. 191, 615-622 (2009).
  11. Gravelat, F. N., Askew, D. S., Sheppard, D. C. Targeted gene deletion in Aspergillus fumigatus using the hygromycin-resistance split-marker approach. Host-Fungus Interactions. 845, 119-130 (2012).
  12. Wang, Y., Diguistini, S., Bohlmann, J., Breuil, C. Agrobacterium-meditated gene disruption using split-marker in Grosmannia clavigera, a mountain pine beetle associated pathogen. Current Genetics. 56, 297-307 (2010).
  13. Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333, 307 (2011).
  14. Mahfouz, M. M., Piatek, A., Neal, C. Genome engineering via TALENs and CRISPR/Cas9 systems: Challenges and perspectives. Plant Biotechnology. 12, 1006-1014 (2014).
  15. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in genome editing and beyond. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).
  16. Arazoe, T., et al. Tailor-made TALEN system for highly efficient targeted gene replacement in the rice blast fungus. Biotechnology and Bioengineering. 112 (7), 1335-1342 (2015).
  17. Liu, R., Chen, L., Jiang, Y., Zhou, Z., Zou, G. Efficient genome editing in filamentous fungus Trichoderma reesei using the CRISPR/Cas9 system. Cell Discovery. 1, 1-11 (2015).
  18. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-822 (2012).
  19. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (39), 2579-2586 (2012).
  20. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Cell. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  21. Wilson, A. M., Wilken, P. M., Van Der Nest, M. A., Wing, M. J., Wing, B. D. The novel Huntiella omanensis mating gene, MAT1-2-7, is essential for ascomatal maturation. Fungal Genetics and Biology. 137, 103335 (2020).
  22. Miao, J., et al. Characterization of an N-terminal non-core domain of RAG1 gene disrupted Syrian Hamster model generated by CRISPR Cas9. Viruses. 10 (243), 10050243 (2018).
  23. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2016).
  24. Schneider, S., Kirchner, M., Kirchner, M., Schneider, S. CRISPR-Cas: From the bacterial adaptive immune system to a versatile tool for genome engineering. Angewandte Chemie International Edition. 54 (46), 13508-13514 (2015).
  25. Nødvig, C. S., Nielsen, J. B., Kogle, M. E., Mortensen, U. H. A CRISPR-Cas9 system for genetic engineering of filamentous fungi. PLoS ONE. 10 (7), 1-18 (2015).
  26. Wang, Q., Cobine, P. A., Coleman, J. J. Efficient genome editing in Fusarium oxysporum based on CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Fungal Genetics and Biology. 117, 21-29 (2018).
  27. Nagy, G., et al. Development of a plasmid free CRISPR-Cas9 system for the genetic modification of Mucor circinelloides. Scientific Reports. 7 (16800), 1-10 (2017).
  28. Al-Subhi, A. M., Al-Adawi, A. O., Van Wyk, M., Deadman, M. L., Wingfield, M. J. Ceratocystis omanensis, a new species from diseased mango trees in Oman. Mycological Research. 110 (2), 237-245 (2006).
  29. Wilson, A. M., van der Nest, M. A., Wilken, P. M., Wingfield, M. J., Wingfield, B. D. Pheromone expression reveals putative mechanism of unisexuality in a saprobic ascomycete fungus. PLoS ONE. 13 (3), 0192517 (2018).
  30. van der Nest, M. A., et al. Draft genomes of Amanita jacksonii, Ceratocystis albifundus, Fusarium circinatum, Huntiella omanensis, Leptographium procerum, Rutstroemia sydowiana, and Sclerotinia echinophila. IMA Fungus. 5 (2), 472-485 (2014).
  31. Wilson, A. M., Godlonton, T., van der Nest, M. A., Wilken, P. M., Wingfield, M. J., Wingfield, B. D. Unisexual reproduction in Huntiella moniliformis. Fungal Genetics and Biology. 80, 1-9 (2015).
  32. Sambrook, J., Green, M. . Molecular cloning: A laboratory manual. , (2012).
  33. Ramamoorthy, V., Govindaraj, L., Dhanasekaran, M., Vetrivel, S., Kumar, K. K., Ebenezar, E. Combination of driselase and lysing enzyme in one molar potassium chloride is effective for the production of protoplasts from germinated conidia of Fusarium verticillioides. Journal of Microbiological Methods. , (2015).
  34. Lin, C., Yang, S. L., Wang, N., Chung, K. The FUS3 MAPK signaling pathway of the citrus pathogen Alternaria alternata functions independently or cooperatively with the fungal redox-responsive AP1 regulator for diverse developmental, physiological and pathogenic processes. Fungal Genetics and Biology. 47 (4), 381-391 (2010).
  35. Lin, C., Chung, K. Specialized and shared functions of the histidine kinase- and HOG1 MAP kinase-mediated signaling pathways in Alternaria alternata, a filamentous fungal pathogen of citrus. Fungal Genetics and Biology. 47 (10), 818-827 (2010).
  36. Choquer, M., et al. The CTB1 gene encoding a fungal polyketide synthase is required for cercosporin biosynthesis and fungal virulence of Cercospora nicotianae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (5), 468-476 (2005).
  37. Pohl, C., Kiel, J. A. K. W., Driessen, A. J. M., Bovenberg, R. A. L., Nygård, Y. CRISPR/Cas9 based genome editing of Penicillium chrysogenum. ACS Synthetic Biology. 5 (7), 754-764 (2016).
  38. van der Nest, M. A. M. A., et al. Draft genome sequences of Diplodia sapinea, Ceratocystis manginecans and Ceratocystis moniliformis. IMA Fungus. 5 (1), 135-140 (2014).
  39. Wingfield, B. D., et al. Draft genome sequences for Ceratocystis fagacearum, C. harringtonii, Grosmannia penicillata, and Huntiella bhutanensis. IMA Fungus. 7 (2), 317-323 (2016).
  40. Fourie, A., Van Der Nest, M. A., De Vos, L., Wingfield, M. J., Wingfield, B. D., Barnes, I. QTL mapping of mycelial growth and aggressiveness to distinct hosts in Ceratocystis pathogens. Fungal Genetics and Biology. 131, 103242 (2019).
  41. Lee, D. H., Roux, J., Wingfield, B. D., Wingfield, M. J. Variation in growth rates and aggressiveness of naturally occurring self-fertile and self-sterile isolates of the wilt pathogen Ceratocystis albifundus. Plant Pathology. 64 (5), 1103-1109 (2015).

Tags

CRISPR-Cas9Genome EditingHuntiella OmanensisFilamentous AscomyceteNon-model FungiConidiaGermlingsProtoplastsTransformationRibonucleoproteinDonor DNAPTC Solution

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Wilson, A. M., Wingfield, B. D. CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis. J. Vis. Exp. (160), e61367, doi:10.3791/61367 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image