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Genética

CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascoycete Huntiella omanensis

Published: June 09, 2020
doi:
10.3791/61367
,
1Department of Biochemistry, Genetics & Microbiology,University of Pretoria, 2Forestry & Agricultural Biotechnology Institute (FABI),University of Pretoria

Summary

Le système d’édition du génome CRISPR-Cas9 est un éditeur de génome facile à utiliser qui a été utilisé dans les espèces modèles et non modèles. Ici, nous présentons une version à base de protéines de ce système qui a été utilisé pour introduire un codon d’arrêt prématuré dans un gène d’accouplement d’un champignon filamenteux d’ascocète non-modèle.

Abstract

Le système d’édition du génome CRISPR-Cas9 est un outil moléculaire qui peut être utilisé pour introduire des changements précis dans les génomes des espèces modèles et non modèles. Cette technologie peut être utilisée pour une variété d’approches d’édition du génome, des knock-outs de gène et des knockins à des changements plus spécifiques comme l’introduction de quelques nucléotides à un endroit ciblé. L’édition du génome peut être utilisée pour une multitude d’applications, y compris la caractérisation fonctionnelle partielle des gènes, la production d’organismes transgéniques et le développement d’outils de diagnostic. Par rapport aux stratégies d’édition de gènes précédemment disponibles, le système CRISPR-Cas9 s’est avéré facile à établir chez de nouvelles espèces et bénéficie d’une grande efficacité et d’une spécificité. La raison principale en est que l’outil d’édition utilise une molécule d’ARN pour cibler le gène ou la séquence d’intérêt, ce qui rend la conception de molécule cible simple, étant donné que les règles standard d’appariement de base peuvent être exploitées. À l’instar d’autres systèmes d’édition du génome, les méthodes basées sur CRISPR-Cas9 nécessitent également des protocoles de transformation efficaces et efficaces ainsi que l’accès à des données de séquence de bonne qualité pour la conception des molécules d’ARN et d’ADN ciblants. Depuis l’introduction de ce système en 2013, il a été utilisé pour concevoir génétiquement une variété d’espèces modèles, y compris Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, Drosophila melanogaster et Mus musculus. Par la suite, les chercheurs travaillant sur des espèces non modèles ont profité du système et l’ont utilisé pour l’étude des gènes impliqués dans des processus aussi divers que le métabolisme secondaire chez les champignons, la croissance des nématodes et la résistance aux maladies chez les plantes, entre autres. Ce protocole décrit ci-dessous l’utilisation du protocole d’édition du génome CRISPR-Cas9 pour la troncation d’un gène impliqué dans le cycle sexuel de Huntiella omanensis, un champignon incamenteux d’ascocète appartenant à la famille des Ceratocystidaceae.

Introduction

La disponibilité croissante de génomes et de transcriptomes de haute qualité entièrement assemblés a grandement amélioré la capacité d’étudier une grande variété de processus biologiques dans un éventail d’organismes1. Cela est vrai tant pour les espèces modèles que pour les espèces non modèles, dont bon nombre peuvent offrir une compréhension plus diversifiée des processus biologiques. Ces types de données peuvent être utilisés pour la découverte de gènes, l’identification des réseaux de transcription et les comparaisons du génome entier et du transcriptome, chacun d’entre eux avec son propre ensemble d’applications. Cependant, alors que les gènes sont prédits, annotés et misativement liés à différentes voies fonctionnelles à un rythme jamais vu auparavant, la caractérisation fonctionnelle de ces gènes reste en retard, limitée par les boîtes à outils moléculaires disponibles pour de nombreuses espèces. C’est particulièrement le cas pour les espèces non modèles, où les données génomiques sont relativement faciles à générer, mais où d’autres caractérisations moléculaires ont été presqueimpossibles 1,2.

La caractérisation partielle des fonctions de gènes spécifiques importants pour la biologie des espèces fongiques peut être réalisée par des expériences par KO ou knockin suivies d’une analyse phénotypique des souches mutantes3. Ces deux systèmes reposent entièrement sur la disponibilité de protocoles de génie génétique, y compris, au minimum, un système de transformation et un système d’édition génétique. Il existe un certain nombre de différents systèmes de transformation qui ont été développés dans une variété de champignons filamenteux4. Des systèmes physiques comme ceux qui reposent sur la biolistique et l’électroporation ont été développés dans Trichoderma harzianum5 et Aspergillus niger6, respectivement. Des systèmes qui utilisent des produits chimiques tels que le chlorure de calcium ou l’acétate de lithium ont été développés dans Neurospora crassa7. Enfin, les systèmes biologiques qui reposent sur l’utilisation d’Agrobacterium tumefaciens pour la transformation ont été utilisés avec succès dans Ceratocystis albifundus8.

Contrairement à la disponibilité de différents protocoles de transformation, les systèmes d’édition du génome sont moins abondants. Bon nombre des expériences traditionnelles de caractérisation fonctionnelle menées dans des champignons filamenteux ont utilisé une construction par KO de marqueurs fendus sous la forme d’un marqueur sélectionnable flanqué de régions d’homologie à la région cible ou au gène dans le génome3. La méthode repose sur l’homologie dirigée (HR) réparation de l’ADN, qui installations recombinaison homologue entre la construction knockout et la région d’intérêt. Cet événement de recombinaison entraîne le remplacement du gène d’intérêt par la séquence du marqueur sélectionnable. Malheureusement, bien que cela ait été couronné de succès chez de nombreuses espèces, y compris Cercospora nicotianae10, Aspergillus fumigatus11 et Grosmannia clavigera12, les taux de recombinaison homologue sont très variables entre les différentes espèces fongiques, ce qui en fait un protocole inefficace et parfois inutilisable dans certaines espèces3.

D’autres systèmes d’édition du génome, y compris ceux qui utilisent des nucléases zinc-doigts (ZFN) et des nucléases effecteurs de type activateur de transcription (TALENs) ont représenté une grande amélioration par rapport aux systèmes plus anciens, en particulier compte tenu de leurs capacités à apporter des changements spécifiques et ciblés13. Les ZFN et TALENs sont composés d’une protéine nucléase et d’une protéine capable de reconnaître des séquences nucléotides spécifiques13. Une fois la reconnaissance, la nucléase induit une double rupture d’ADN échouée qui peut faciliter l’introduction de mutations spécifiques. Afin d’apporter des changements du génome, la région protéique qui reconnaît la séquence des nucléotides doit être spécialement conçue pour chaque expérience. En raison de cette dépendance sur les interactions protéine-acide nucléique pour guider l’édition, la conception et la production des molécules de ciblage pour chaque expérience knockout ou knockin est difficile et la main-d’œuvre intensive14,15. Illustrant ces défis, très peu de champignons filamenteux ont été soumis à l’édition du génome à l’aide de ces systèmes. Un exemple est le système à base de TALENs qui a été développé dans le champignon de souffle de riz, Magnaporthe oryzae16.

On peut soutenir que la plus grande révolution dans le domaine de l’édition du génome a été la découverte et le développement ultérieur du système CRISPR-Cas9, un éditeur de génome qui permet le clivage ciblé d’une séquence d’intérêt par une endonuclease qui est guidée par une molécule d’ARN. Il s’agissait d’une énorme amélioration par rapport aux éditeurs du génome précédemment développés qui s’appuyaient sur les interactions protéine-nucléique d’acide, car l’avantage majeur du système CRISPR-Cas9 est qu’il s’appuie sur une molécule d’ARN pour cibler la région d’intérêt. Cela signifie que le système repose sur une interaction ARN-ADN et donc des règles standard d’appariement de base peuvent être exploitées lors de la conception de chaque expérience15.

Le système CRISPR-Cas9 tel que détaillé ici est composé de trois composantes principales : un ARN guide unique (sgRNA), l’enzyme Cas9 et un ADN donneur (ADND)17. Le sgRNA est composé d’une région de 20 nucléotides appelée le protospacer ainsi que d’une région plus longue appelée l’échafaudage18. La région protospacer est utilisée pour guider le système d’édition vers la région cible et est donc repensée pour chaque expérience. L’échafaudage est la région de l’ARN qui se lie physiquement à l’enzyme Cas9 pour former la ribonucléoprotéine (RNP) et est donc identique quelle que soit la région à cibler. L’enzyme Cas9 facilite physiquement le clivage de l’ADN cible, en utilisant le protospacer comme guide pour identifier cette région19. Le dernier composant, l’ADND, est facultatif et son utilisation dépend de l’expérienceparticulière 20. L’ADND abrite la séquence qui devrait être spécifiquement insérée dans la région coupée par l’enzyme Cas9, et est donc idéal pour les expériences de knockin de gène où un gène est introduit dans le génome ou pour des expériences de knock-out de gène où un gène de résistance aux antibiotiques ou un autre marqueur sélectionnable est introduit pour remplacer le gène d’intérêt. L’ADND peut également être conçu de manière à introduire de nouvelles séquences dans le génome. Par exemple, comme indiqué ci-dessous, il est possible d’introduire un codon d’arrêt en images dans une région particulière dans le gène d’intérêt lorsqu’une troncation génétique est requise21. D’autres applications incluent la mutation de régions spécifiques du gène, telles qu’un domaine fonctionnel22, ou l’introduction d’une séquence de marquage23.

Un avantage majeur de l’utilisation du système CRISPR-Cas9 est sa polyvalence24. Un exemple de cette adaptabilité est que l’enzyme Cas9 peut être introduite dans la cellule hôte dans l’une de ses trois formes – ADN, ARN ou protéine – selon le système de transformation particulier utilisé. Lorsqu’il est introduit sous forme d’ADN, le gène cas9 est souvent inclus sur un plasmide avec un marqueur sélectionnable, une cassette pour exprimer le sgRNA et, si nécessaire, une cassette codant la séquence dDNA25. Le principal avantage de ce système est qu’une seule construction doit être transformée en cellule et une transformation réussie garantit la présence de tous les composants nécessaires à l’édition du génome à médiation CRISRP-Cas9. Toutefois, cette méthode repose sur la disponibilité d’un système d’expression pour l’espèce hôte. Pour que Cas9 puisse causer des dommages à l’ADN, il doit être exprimé à des niveaux élevés, et donc, un promoteur approprié et potentiellement spécifique est nécessaire. Pour les espèces non modèles où de tels promoteurs n’ont pas encore été développés, cela peut être un facteur de détraction et donc la capacité d’introduire Cas9 sous forme d’ARN ou de protéines peut être une option plus attrayante. L’introduction de l’ARN dans la cellule apporte ses propres défis, en particulier dans le fait que l’ARN est instable et peut ne pas survivre au processus de transformation. En outre, lorsqu’elle est introduite sous forme d’ADN ou d’ARN, la séquence du gène Cas9 peut devoir être codon-optimisée pour une utilisation dans le système hôte particulier17. Par exemple, le gène cas9 de Streptococcus pyogenes peut ne pas fonctionner dans une cellule hôte de mammifères et un gène cas9 qui a été codon-optimisé pour une utilisation dans une cellule de mammifères peut ne pas fonctionner dans une cellule végétale. Tous ces défis peuvent être surmontés en utilisant la forme protéique de Cas9, qui, avec le sgRNA, peut être assemblé en RNP et transformé en cellule hôte26,27. Ce système ne repose pas sur un système d’expression endogène ou l’optimisation du codon et devrait donc fonctionner dans la majorité des espèces non modèles. L’inconvénient du système à base de protéines est qu’il n’est pas compatible avec les systèmes de transformation à base d’ADN comme le transfert agrobacterium-médié. Ainsi, pour que la méthode à base de protéines fonctionne, un protocole de transformation tel que ceux qui reposent sur des protoplastes ou des biolistiques doit être disponible. Ce système à base de RNP a été utilisé avec succès dans les champignons filamenteux, Fusarium oxysporum26 et Mucor circinelloides27.

Huntiella omanensis, un membre de la famille Ceratocystidaceae, est un champignon cosmopolite souvent trouvé sur les plantes ligneuses fraîchement blessées28. Bien que des données de haute qualité sur le génome et la transcription sont disponibles pour cette espèce28,29,30, aucun protocole de transformation ou d’édition du génome n’a été développé. À ce jour, la recherche sur H. omanensis s’est concentrée sur les composantes génétiques sous-jacentes de son cycle sexuel29,31. Ce champignon présente un cycle sexuel hétérothallique typique, avec la reproduction sexuelle se produisant exclusivement entre les isolats des types d’accouplement MAT1-1 et MAT1-231. En revanche, les isolats MAT1-2 des Huntiella moniliformis étroitement apparentés sont capables de reproduction sexuelle indépendante et complètent un cycle sexuel en l’absence d’un partenaire MAT1-131. Cette différence dans les capacités sexuelles est pensé pour être, au moins en partie, en raison d’une différence majeure dans le gène d’accouplement, MAT1-2-7, où H. omanensis abrite une pleine longueur et copie intacte, tandis que le gène est sévèrement tronqué dans H. moniliformis29,31. Pour caractériser davantage le rôle de ce gène dans la reproduction sexuelle, le gène MAT1-2-7 de H. omanensis a été tronqué pour imiter la troncation observée dans H. moniliformis21.

Le protocole ci-dessous détaille la transformation de H. omanensis et la troncation du gène MAT1-2-7 à l’aide d’une version à base de protéines du système d’édition du génome CRISPR-Cas9. Ce protocole a été développé après que les approches du remplacement homologue de gène basé sur la recombinaison et l’édition du génome de CRISPR-Cas9 basée sur le plasmide aient échoué.

Protocol

1. Conception et synthèse du sgRNA Pour identifier les régions protospacers potentielles qui feront partie de l’ARNE sg, recherchez manuellement à travers le gène d’intérêt pour les triplets 5′ NGG 3′, en utilisant la fonction de recherche dans n’importe quel programme utilisé. Annoter ces triplets comme des séquences PAM.REMARQUE : Divers logiciels sont disponibles qui recherchent et annotent les séquences pam et protospacer potentielles. Sélectionnez les 20 pb en amont de chacune des séquences PAM identifiées et annoter ces séquences comme protospacers potentiels. Pour décider d’un seul protospacer, effectuez les étapes de filtrage suivantes pour supprimer les séquences de faible qualité. Pour tester la spécificité des protospacers potentiels, combinez la séquence PAM et le protospacer en une seule séquence et utilisez-la comme requête BLASTn par rapport à l’ensemble du génome. Jetez tous les protopacteurs qui présentent une similitude avec n’importe quelle région du génome autre que la région cible (Figure 1A). Pour s’assurer que la molécule d’ARN se pliera dans la structure 3D correcte pour la liaison à l’enzyme Cas9, créez une séquence combinée comprenant le protospacer et la séquence d’échafaudage spécifique à l’enzyme Cas9. Téléchargez chacune des séquences combinées protospacer-échafaudage dans un outil de prédiction de la structure secondairede l’ARN( Tableau des matériaux ). Analyser les résultats en comparant l’énergie libre minimale et les structures secondaires centroïdes.REMARQUE : Les candidats protospacers idéaux auront l’énergie libre minimale identique et les structures secondaires centroïdes. Les deux structures secondaires doivent être composées de trois boucles de tige, interrompues par cinq structures d’anneau. Les structures doivent également présenter des probabilités de liaison élevées (indiquées en rouge) dans l’ensemble de la structure, à l’exception de la région représentant le protospacer (figure 1B). Les valeurs énergétiques réelles ne sont pas pertinentes. Choisissez un candidat final parmi ceux qui ont passé les étapes de filtrage ci-dessus en sélectionnant le candidat le plus proche de la région spécifique visée. Pour synthétiser le sgRNA en tant que molécule d’ARN unique, utilisez un kit de synthèse sgRNA(tableau de matériels) compatible avec l’enzyme Cas9 particulière qui sera utilisée (par exemple, Cas9 de Streptococcus pyogenes).REMARQUE : Les étapes suivantes peuvent dépendre du kit de synthèse sgRNA utilisé. Dans le cas où un kit différent est utilisé, suivez les instructions du fabricant. Alternativement, le sgRNA peut être commandé pré-synthétisé. Lorsque vous travaillez avec de l’ARN, utilisez des réactifs et des produits jetables sans nucléase. Si le protospacer de 20 pb choisi à l’étape 1.3 ci-dessus n’abrite pas un G à l’extrémité 5′, ajoutez un G à cette région. Ajoutez la séquence de promoteur T7 à la fin de la séquence cible à 5′. Cette séquence est standard et est de 5′ TTTATALACTCACTACTATAG 3′. Ajoutez une séquence de chevauchement de 14 nt à la fin de la séquence cible à 3′. Cette séquence est spécifique au kit et est de 5′ GTTTAGAGCTAGA 3′ pour le kit utilisé ici. Commandez le fragment résultant 5′ TTCTAACTACTACTATAG(N)20 GTTTAGAGCTAGA, avec (N)20 représentant le protospacer sélectionné presynthése (Table des matériaux). Conformément au protocole du fabricant(tableau des matériaux),combiner les réactifs suivants à température ambiante : 2 μL d’eau, 10 μL de tampon de réaction, 5 μL de séquence protoespacer synthétisée, 1 μL de 0,1 M TNT et 2 μL d’enzyme transcriptase. Incuber cette solution à 37 °C pendant 30 min et transférer sur la glace. Ajouter 30 μL d’eau et 2 μL de DNase I, mélanger et incuber à 37 °C pendant 15 minutes supplémentaires. Visualisez le sgRNA résultant sur un gel agarose de 2 %. 2. Test de la capacité de clivage in vitro de l’ARne sgRNA REMARQUE : Cette étape est facultative mais est recommandée. Concevoir des amorces qui amplifieront un fragment abritant la séquence du site que le sgRNA choisi ciblera et amplifiera la région à l’aide d’une polymérase d’ADN standard.REMARQUE : Si possible, concevez les amorces de manière à ce que le clivage sur le site cible produise deux fragments de tailles très différentes qui peuvent facilement être distingués les uns des autres sur un gel agarose standard. Assembler la ribonucléoprotéine (RNP) combinée sgRNA-Cas9 en incuber une solution composée de 30 nM sgRNA tel que synthétisé ci-dessus, 30 nM protéine Cas9, 10x tampon de réaction et 10 μL d’eau à 25 °C pendant 10 min. Testez la capacité de clivage du sgRNA en ajoutant le produit PCR de la région cible dans la solution RNP à une concentration finale de 3 nM. Incuber la solution à 37 °C pendant 15 min. Ajouter 3 μg de protéinase K et 2 μg de RNase à la solution pour arrêter la réaction de clivage et incuber à température ambiante pendant 10 min. Visualisez les fragments d’ADN résultants sur un gel agarose de 2%. Le sgRNA convient à l’expérimentation in vivo si deux bandes de la taille prévue sont observées sur le gel. 3. Conception et synthèse de l’ADN Concevoir l’ADD composé de trois régions – 5′ et 3′ avec complémentarité avec la région génomique ciblée et une région moyenne abritant un marqueur sélectionnable (Tableau des matériaux, Figure 2).REMARQUE : D’autres séquences spécifiques peuvent également être ajoutées à ce marqueur sélectionnable. Pour cette expérience particulière, une séquence de codon d’arrêt (5′ TGA 3′) a été ajoutée juste avant le marqueur sélectionnable, introduisant ainsi un codon d’arrêt dans le cadre dans le gène. L’ADD peut être commandé presynthésized. Alternativement, l’ADD peut être amplifié et assemblé à l’aide d’une approche pcr de chevauchement dans le sens des étapes comme indiqué ci-dessous. Concevoir des amorces pour amplifier environ 800 pb des régions de flanc de 5′ et 3′. Ajoutez 20 nt de séquence complémentaire à la séquence du marqueur sélectionnable à l’amorce inverse de la région de 5′ et à l’amorce avant de la région de 3′. Concevoir des amorces qui amplifient le marqueur sélectionnable, en veillant à ce que le produit amplifié abrite le gène de résistance ainsi qu’un promoteur connu pour travailler dans les espèces d’intérêt. À l’aide d’une polymérase d’ADN haute fidélité(Tableau des matériaux),amplifient les trois régions dDNA. Amplifier les régions de 5′ et 3′ du gDNA de l’organisme en cours de modification. Amplifiez le marqueur sélectionnable à partir d’une source pertinente. En une seule réaction, combiner la région amplifiée de 5′ avec le marqueur sélectionnable et, à l’aide d’une polymérase d’ADN à longue portée et haute fidélité, amplifier toute la région. Dans une deuxième réaction unique, combiner la région amplifiée de 3′ avec le marqueur sélectionnable et, à l’aide d’une polymérase d’ADN à longue portée et haute fidélité, amplifier toute la région. Enfin, combinez les deux produits PCR précédents en une seule réaction et amplifiez toute la séquence dDNA avec une polymérase d’ADN à longue portée et haute fidélité. Visualisez le fragment d’ADN sur un gel agarose de 1%. Dans le cas où deux fragments ou plus sont produits, purifier le fragment correctement dimensionné du gel à l’aide d’un kit de purification de gel. 4. Extraction de protoplastes Pour produire de la conidie, inoculer 200 ml de bouillon d’extrait de malt frais de 2 % (MEB) dans une fiole de 500 ml avec un bloc d’agar couvert de mycélie de 1 cm x 1 cm.REMARQUE : Tous les champignons ne sont pas capables de produire de la conidie. Dans ce cas, mycelia peut également être utilisé. Cela nécessite généralement des concentrations plus élevées d’enzymes de lysing plus loin dans le protocole. Incuber la culture liquide dans un incubateur de secousses à 25 °C avec des secousses à 120 tr/min pendant 24 à 48 h.NOTE: Ce temps d’incubation et la température a été optimisé pour H. omanensis. Cela devra être optimisé pour d’autres espèces. Pour récolter la conidie; filtrer la culture liquide à travers une couche de tissu de laboratoire stérile (p. ex., Miracloth), transférer la suspension conidiale dans des tubes de centrifugeuse de 50 mL et la centrifugeuse à 3 220 x g à 4 °C pendant 10 min. Jetez le supernatant. Resuspendez la conidie dans 5 mL d’eau et de pipette 10 μL de la solution de conidia sur une lame de microscope et couvrez-la d’un couvercle. Visualisez à l’aide d’un microscope composé sous grossissement 40x pour s’assurer que seules les conidies ont été récupérées (Figure 3A). Dans une fiole de 500 ml, inoculer 200 ml de 1% meb frais avec le volume total de conidia résuspendé. Incuber la culture liquide dans un incubateur de secousses à 25 °C avec des secousses à 120 tr/min jusqu’à 12 h.NOTE: Ce temps d’incubation a été optimisé pour H. omanensis. Cela devra être optimisé pour d’autres espèces. Pour récolter les germlings, transférer la culture liquide dans des tubes de centrifugeuse de 50 mL et la centrifugeuse à 3 220 x g à 4 °C pendant 10 min. Jetez le supernatant. Resuspendez les germinales jusqu’à 10 mL de sorbitol de 1 M. Pipette 10 μL de la solution germinale sur une lame de microscope et couvrir d’un couvercle. Visualiser à l’aide d’un microscope composé sous grossissement 40x pour s’assurer que seuls les germes ont été récupérés (figure 3B).REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. Conserver les germinations dans 1 M sorbitol à -80 °C. Pour lyser les parois cellulaires des jeunes germes et libérer les protoplastes, ajouter 1 mL de la suspension germinale à 9 ml d’enzyme de lysing à différentes concentrations dans une fiole stérile de 50 ml.REMARQUE : Différentes concentrations enzymatiques et temps d’incubation sont utilisées et peuvent être trouvées dans le tableau 1. Les enzymes et les concentrations sont également susceptibles de varier en fonction du champignon et devront être optimisées pour chaque espèce. Incuber la solution spore-enzyme dans un incubateur de secousses à 25 °C avec des secousses à 80 tr/min pendant 2 à 3 h. Filtrer la solution protoplaste à travers une couche de tissu de laboratoire stérile et recueillir les protoplastes par centrifugation à 1 810 x g à 4 °C pendant 10 min. Jetez le supernatant.REMARQUE : Les protoplastes sont des cellules sans paroi cellulaire et sont donc très sensibles aux perturbations mécaniques. Assurez-vous de les manipuler avec soin, en particulier lors du pipetage. Resuspendez soigneusement le granulé protoplaste dans 200 μL de tampon STC (Tableau des matériaux). Pipette 10 μL de la solution protoplaste sur une lame de microscope et couvrir d’une lame de couverture. Visualiser à l’aide d’un microscope composé sous grossissement 40x pour s’assurer que seuls les protoplastes ont été récupérés (figure 3C). À l’aide d’un hémocytomètre, compter et calculer le nombre de protoplastes générés dans les étapes ci-dessus. Diluer la solution protoplaste en aliquots contenant environ 5 x 106 protoplastes.REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici. Stockez les protoplastes dans la mémoire tampon STC à -80 °C. 5. Transformation et récupération de transformation assistée par protoplaste et PEG Pour commencer la transformation, combiner environ 5 x 106 protoplastes avec un seul volume de la solution RNP et environ 6 μg du fragment dDNA.REMARQUE : Les protoplastes sont très sensibles aux perturbations mécaniques. Assurez-vous de les manipuler avec soin, en particulier lors du pipetage. À l’aide d’une pipette, égoutter lentement 1 mL d’une solution PTC fraîchement préparée sur la solution protoplaste et incuber la solution à température ambiante pendant 20 min.REMARQUE : Cette étape est une étape sensible et très importante. Assurez-vous d’utiliser la solution PTC fraîchement préparée et de laisser tomber la solution sur les cellules aussi lentement et uniformément que possible, créant une couche hydrophobe à travers la surface de la cellule. Ajouter 5 mL de milieu de commande osmotique (OCM) à la solution protoplaste et pipette lentement et doucement pour s’assurer que la solution est bien mélangée. Incuber la solution protoplaste dans un incubateur de secousses à 25 °C avec des secousses à 80 tr/min pendant la nuit. Pour sélectionner les isolats transformés, divisez la solution en 5 plaques de culture vides de 60 mm. Ajouter 10 mL d’agar OCM complété par 30 μg/mL d’hygromycine B à chaque plaque de culture et faire pivoter lentement chaque plaque pour bien mélanger. Laisser reposer la première couche d’agar avant d’ajouter 10 mL d’agar de commande osmotique complété par une hygromycine B de 40 μg/mL. Laisser la deuxième couche d’agar régler et incuber les cultures à 25 °C jusqu’à ce que des isolats simples puissent être vus se développer à travers les deux couches d’agar. Pour récupérer avec succès les isolats transformés, transférer les isolats individuels capables de croissance à travers la couche d’agar complétée par 40 μg/mL hygromycine B à des plaques d’agar d’extraction de malt frais (MEA) complétées par 50 μg/mL hygromycine B (MEA-50). Incuber les cultures fraîches à 25 °C pendant 5 jours, en vérifiant la croissance quotidienne. Les cultures capables d’une croissance soutenue sur ces médias ont été transformées avec succès et peuvent être utilisées pour des études plus approfondies. 6. Confirmation de l’intégration et de la stabilité de l’ADN Afin de confirmer que l’ADND a été intégré dans le génome de la région cible, concevoir des amorces qui flanquent les sites d’insertion prévus de 5 ‘ et 3’ (Figure 2). Effectuez deux PCR à l’aide de ces deux ensembles d’amorces et d’une polymérase d’ADN haute fidélité. Si les deux PCR produisent des amplicons de taille et de séquence prévues, l’ADNd a été intégré avec succès dans la région cible. Ensuite, évaluez la tache mutante pour l’intégration stable de l’ADND. Afin de confirmer que l’ADND a été intégré dans le génome et sera maintenu pendant la croissance végétative, effectuer un test de transfert de médias. Transférer un bloc d’agar couvert mycélial d’un isolat mutant en croissance active sur le milieu MEA-50 à un milieu MEA non approvisionnement. Incuber à 25 °C pendant 3 jours. Transférer un bloc d’agar couvert de mycélie de l’isolat qui pousse sur le milieu MEA à mea-50 moyen. Incuber à 25 °C pendant 3 jours. Répétez ce processus, transférant activement la croissance de mycélie de complété à un milieu non complété pour au moins quatre tours.REMARQUE : Si l’isolat est capable d’une croissance soutenue sur le mea-50 moyen après de nombreux transferts, l’ADD a été intégré dans le génome et peut être maintenu par la croissance végétative. La tache mutante peut être évaluée pour la présence d’une seule copie de l’ADNN intégré. Afin de confirmer que l’ADND a été intégré dans le génome à un seul endroit, effectuer une analyse de tache du Sud. Digérer un total de 30 μg d’ADG de chaque souche mutante à l’aide d’enzymes de restriction HindIII et EcoRI conformément aux protocoles du fabricant.REMARQUE : Bien que le choix de l’enzyme de restriction soit à la hauteur du chercheur, assurez-vous que le site de reconnaissance de l’enzyme de restriction n’est pas présent dans la séquence dDNA. Séparez le gDNA digéré sur un gel agarose de 0,75 % et transférez l’ADN sur une membrane de nylon à l’aide de procédures standard32. Soumettez la membrane à l’hybridation à l’aide d’une sonde ciblant la séquence dDNA. Concevoir des amorces pour amplifier une région courte (300 pb) de l’ADND. À l’aide de ces amorces, synthétisez la sonde à l’aide d’un mélange d’étiquetage PCR DIG. Utilisez la sonde nouvellement synthétisée pour l’hybridation, le traitement et la visualisation des membranes à l’aide des procédures standard32. Si une seule bande est observée dans chaque voie, l’ADND n’est présente qu’à un seul endroit du génome. La souche mutante peut maintenant être utilisée pour d’autres expériences d’analyse phénotypique et de caractérisation fonctionnelle. 7. Analyse phénotypique des souches mutantes Mener des expériences d’accouplement pour déterminer si la perturbation du gène MAT a eu un effet sur les capacités sexuelles du champignon étudié.REMARQUE : Cette étape dépend du gène et de l’espèce à l’étude. Dans ce cas, on pense que le gène ciblé est impliqué dans la reproduction sexuelle et que des tests d’accouplement ont donc été effectués. Si l’on pensait, par exemple, que le gène était impliqué dans la reproduction asexuée, on pourrait mesurer quelque chose comme la production conidiale. Afin de tester les capacités hétérothalliques de la souche mutante, co-inoculer le milieu mea frais avec une souche mutante ainsi qu’une souche de type d’accouplement opposé. Dans le cas de H. omanensis, garder les couvercles des plaques fermés, mais pas scellés et incuber à température ambiante pendant 7 jours. Évaluer visuellement la production de structures sexuelles. Afin de tester les capacités homothalliques de la souche mutante, inoculer le milieu mea frais avec une souche mutante. Dans le cas de H. omanensis, garder les couvercles des plaques fermés, mais pas scellés et incuber à température ambiante pendant 7 jours. Évaluer visuellement la production de structures sexuelles. Mener des expériences sur le taux de croissance pour déterminer si la perturbation du gène MAT a eu un effet sur le taux de croissance du champignon étudié. Créez des bouchons d’agar recouverts de mycélial à partir du bord activement croissant des cultures des souches mutantes et de type sauvage en insérant le côté arrière d’une grande pointe de pipette stérile dans l’agar. Inoculer le milieu mea frais avec ces bouchons d’agar. Assurez-vous qu’au moins trois répliques par type de culture sont effectuées. Après 3 jours de croissance à 20 °C, mesurer la croissance sur deux diamètres perpendiculaires. Comparez les données des souches de type sauvage et mutant.

Representative Results

Le protocole décrit ci-dessus a facilité l’introduction d’un codon d’arrêt prématuré dans un gène d’accouplement de l’ascomycete non-modèle, H. omanensis. Ce processus a utilisé une version du système d’édition du génome CRISPR-Cas9 et, en tant que telle, l’une des étapes les plus importantes de ce protocole est la conception et la synthèse d’un sgRNA de haute qualité. La figure 1 montre comment cette molécule a été conçue de telle manière qu’elle A) cible spécifiquement le gène d’intérêt et montre peu de similitude avec d’autres régions du génome et B) se plie correctement afin de se lier avec la protéine Cas9. Le sgRNA doit également être capable de couper efficacement la région cible. La capacité de l’ARne de sgRNA à cibler et à permettre le clivage de la région cible a été effectuée in vitro,produisant deux produits de la taille prévue. Une fois la transformation réussie effectuée, il est important de s’assurer que l’ADD ne s’est intégré au génome qu’une seule fois et à l’endroit prévu. La figure 2 illustre la conception d’amorces PCR qui ciblent les sites d’insertion, qui peuvent être utilisés pour filtrer les transformateurs potentiels pour le site d’intégration correct. En concevant des amorces qui flanquent les sites d’insertion de 5′ et 3′, l’amplification n’est possible que si l’ADN est inséré dans la bonne région. La figure 4 illustre que le codon d’arrêt prématuré a été introduit dans le gène MAT1-2-7 dans le cadre de lecture correct, assurant que le gène serait tronqué de la même manière que celui de H. moniliformis. En outre, l’analyse de tache du sud a montré que la construction dDNA n’a été intégrée qu’à un seul site dans le génome. Le succès du protocole a été confirmé lors de l’analyse phénotypique des souches mutantes. Dans le cas de l’expérience de perturbation MAT1-2-7, deux souches mutantes indépendantes ont été développées. Dans les deux isolats, le taux de croissance radiale végétative a été sensiblement réduit, ce qui suggère un effet pléiotrope du nouveau gène d’accouplement (figure 5). En outre, les isolats mutants étaient incapables de compléter un cycle sexuel, ne produisant que des structures sexuelles immatures qui ne produisaient pas de spores sexuelles (figure 5). Cela contrastait avec les isolats de type sauvage, qui ont terminé tout le cycle sexuel dans les quelques jours suivant l’incubation (figure 5). Figure 1 : Choix d’un candidat sgRNA approprié.(A) Un sgRNA approprié n’aura que des similitudes avec la région cible du génome (dans ce cas indiqué par la séquence de locus MAT). (B) Un sgRNA approprié aura l’énergie libre minimale identique et les structures secondaires centroïdes, avec les trois boucles de tige et cinq anneaux dans la boucle d’étape primaire. En outre, la majorité de la structure aura des probabilités de liaison élevées (indiquées en orange foncé et rouge) tandis que des probabilités de liaison inférieures devraient être observées à la région protospacer (indiquée par les triangles noirs). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 2 : Conception, amplification et assemblage de l’ADND.Les paires de première et deuxième amorces (PP1 et PP2) sont utilisées pour amplifier environ 800 pb en amont (5′) et 800 pb en aval (3′) du gène d’intérêt. L’amorce inverse de PP1 et l’amorce avant de PP2 incluent des régions d’homologie à la cassette de résistance à l’hygromycine. La troisième paire d’amorces amplifie toute la cassette de résistance à l’hygromycine. D’une manière progressive, les différents amplicons sont assemblés jusqu’à ce que l’ensemble de l’ADN, composé de la région de 5′, la cassette de résistance à l’hygromycine et la région de 3′, soit assemblé. Une fois transformé en cellule, l’ADD devrait se recombiner à la région où l’enzyme Cas9 aura été dirigée pour couper, remplaçant ainsi le gène d’intérêt par la cassette de résistance à l’hygromycine. PP4 et PP5 peuvent être utilisés pour déterminer si l’ADD a été correctement inséré dans le génome à l’emplacement approprié. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 3 : Les différents types de cellules importants pendant le protocole d’extraction protoplaste.(A) Les conidies sont utilisées comme matériau de départ pour le protocole. Ces conidies sont autorisées à germer et à se développer jusqu’à ce qu’elles soient (B) de jeunes germes. La phase de croissance idéale des jeunes germes est indiquée par les deux flèches noires. D’autres brins mycéliels observés sur (B) sont trop matures pour la dégradation et ne doivent pas être utilisés. La dernière étape du protocole est la libération des protoplastes ronds (C),indiqués par les cercles noirs et pointillés. Ces cellules n’ont plus de parois cellulaires et sont donc très sensibles aux perturbations mécaniques. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 4 : Intégration réussie du codon d’arrêt TGA dans le gène MAT1-2-7 de H. omanensis.(A) Le gène H. omanensis MAT1-2-7, avec le site cible sgRNA indiqué par la flèche verte. (B) Schéma magnifié du site cible sgRNA dans le gène H. omanensis MAT1-2-7. (C) Schéma magnifié d’une région de l’ADD montrant le codon d’arrêt flanqué d’armes homologues au gène MAT1-2-7 de H. omanensis. (D) chromatogramme de séquence de Sanger indiquant l’intégration réussie du codon d’arrêt dans le gène MAT1-2-7. Modifié de Wilson et coll. 202021. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Figure 5 : Les différences phénotypiques entre (A) isolats de type sauvage et (B) isolats mutants.Les trois premières images de chaque panneau montrent les différences dans les capacités sexuelles des deux types d’isolats. Alors que le type sauvage isole la forme d’ascomata mature pendant la reproduction sexuelle, avec l’exsudation des spores des extrémités des cous ascomataux, les isolats mutants ne forment que des structures sexuelles immatures qui ne produisent pas de spores sexuelles. La quatrième image de chaque panneau montre la différence dans le taux de croissance et la morphologie des deux types d’isolats. Alors que l’isolat wildtype pousse beaucoup plus vite et avec plus de mycélie aérienne, le mutant montre plus lentement et est submergé dans l’agar. Modifié de Wilson et coll. 202021. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. Réaction Concentration enzymatique Temps de dégradation Un 1,250 mg/mL 180 min B 1,875 mg/mL 180 min C 2.500 mg/mL 150 min D 3.750 mg/mL 150 min E 4,375 mg/mL 120 min F 5.000 mg/mL 120 min Tableau 1 : Dégradation de la solution germling/mycelia avec des enzymes de lysing de Trichoderma harzianum. Les différentes concentrations d’enzymes correspondent à différentes périodes d’incubation, avec des concentrations plus faibles nécessitant des incubations plus longues.

Discussion

Le protocole pour la transformation réussie de H. omanensis et l’édition du gène MAT1-2-7 a été démontré par l’introduction d’un codon d’arrêt prématuré dans le cadre avec un gène pour la résistance à l’hygromycine B21. Ceci a été réalisé à l’aide d’une version à base de protéines du système d’édition du génome CRISPR-Cas9. L’expérience a nécessité la transcription in vitro de l’assemblage sgRNA, à base de PCR de l’ADN et la co-transformation de ces deux acides nucléiques avec une enzyme Cas9 disponible dans le commerce en protoplastes extraits de H. omanensis

Contrairement à d’autres protocoles qui reposent sur la disponibilité de nombreux autres outils moléculaires, le protocole décrit ci-dessus peut être utilisé avec succès dans les espèces pour lesquelles la boîte à outils moléculaire est encore assez limitée21. Le protocole ne repose que sur un système de transformation établi et la disponibilité des données NGS, de préférence séquence du génome entier. Bien qu’un système de transformation efficace puisse prendre une certaine optimisation dans une espèce pour laquelle cela n’est pas disponible, il existe de nombreux protocoles différents disponibles pour une variété d’espèces. En outre, les données génomiques sont de plus en plus disponibles même pour les espèces les plus obscures et deviennent plus faciles à générer de novo si elles n’existent pas déjà.

Compte tenu de la longueur du protocole, il existe de nombreuses étapes à laquelle des modifications peuvent être introduites et où le dépannage peut être nécessaire. Cela est particulièrement vrai pour les étapes qui sont considérées comme spécifiques aux espèces. Par exemple, il existe de nombreuses étapes d’incubation dans ce protocole qui doivent être menées à des températures spécifiques et pour des durées spécifiques afin de générer des types de cellules importants pour l’expérience. Ces étapes nécessiteraient donc une optimisation spécifique aux espèces. Dans la mesure du possible, des micrographes des cellules ou des phases de croissance particulières ont été fournis pour aider à transférer ce protocole à une espèce différente (Figure 1). Le type et la concentration des enzymes utilisées pour dégrader les parois cellulaires des cellules fongiques afin de libérer les protoplastes seront également spécifiques à l’espèce de champignon à l’étude. Dans ce protocole, une seule source d’enzymes de lysing est utilisée, tandis que différentes combinaisons d’enzymes sont nécessaires pour l’extraction de protoplastes chez des espèces comme Fusarium verticillioides33. Cette étape dépend entièrement de la fabrication chimique de la paroi cellulaire et devra donc être optimisée d’une espèce à l’autre.

Cette méthode est particulièrement importante pour ceux qui étudient des espèces non modèles, car il n’y a pas de dépendance à l’égard d’un système d’expression. Une méthode populaire d’établissement du système d’édition du génome CRISPR-Cas9 consiste à exprimer la protéine Cas9, le sgRNA ainsi que l’ADN d’un ou deux plasmides qui sont transformés en cellules de choix. Dans ce cas, le Cas9 doit être exprimé par un promoteur capable de niveaux élevés d’expression dans l’organisme particulier étudié. Des promoteurs généraux ont été développés pour être utilisés dans les champignons filamenteux et bien qu’ils ne soient pas compatibles chez toutes les espèces, ils permettent une expression de faible niveau et peuvent être utilisés avec succès pour exprimer, par exemple, des gènes de résistance aux antibiotiques. Ces promoteurs, cependant, ne permettent souvent pas des niveaux élevés d’expression et ne peuvent donc pas être utilisés pour exprimer la protéine Cas9. L’utilisation d’une version à base de protéines du système d’édition du génome CRISPR-Cas9 surmonte cette limitation et permet à l’ARN et à l’ADD d’être co-transformés en cellule avec une enzyme Cas9 déjà produite.

Le développement de ce système à base de protéines pour une utilisation dans H. omanensis est venu après de nombreuses tentatives infructueuses à l’édition du génome en utilisant à la fois l’approche classique de marqueur fractionné ainsi que le système à base de plasmide CRISPR-Cas9. Bien que les gains d’efficacité diffèrent d’une espèce à l’autre, l’approche des marqueurs fractionnés a été utilisée avec succès avec une efficacité de 100 % chez des espèces aussi diverses qu’Alternaria alternata34,35et C. nicotiayae36. En revanche, l’efficacité de ce système à H. omanensis était nulle, malgré plus de 80 événements indépendants de transformation et d’intégration. De même, le système CRISPR-Cas9 basé sur le plasmide a été utilisé avec succès avec une grande efficacité dans Trichoderma reesei (>93%)17 et Penicillium chrysogenum (jusqu’à 100%)37. C’est, encore une fois, en contraste avec l’utilité de ce système dans H. omanensis. L’expression suffisante de la protéine Cas9 n’était pas accessible à H. omanensis malgré l’essai d’un certain nombre de promoteurs potentiels, y compris deux promoteurs spécifiques à l’espèce prédits à partir des gènes d’entretien ménager. Ainsi, ce système ne pouvait pas être utilisé du tout. L’utilisation de la version à base de protéines du système CRISPR-Cas9, cependant, a donné de nombreux transformateurs indépendants, dont deux abritaient l’ADND intégré dans le bon emplacement. En outre, cette expérience n’a été tentée qu’une seule fois et a été couronnée de succès, illustrant davantage la facilité avec laquelle ce système peut être utilisé.

Les applications futures de ce protocole incluent son optimisation et son utilisation dans d’autres espèces des Ceratocystidaceae. Il ya déjà une mine de données NGS disponibles pour ces espèces30,38,39 et des études concernant leur spécificité hôte40, taux de croissance et de virulence41 ont été menées. Ces études peuvent être renforcées par la caractérisation fonctionnelle des gènes qui sont censés être impliqués dans ces processus, la recherche qui deviendra maintenant possible en raison de la disponibilité d’un protocole de transformation et d’édition du génome.

En conclusion, une étude approfondie des gènes sous-jacents à d’importants processus biologiques chez des espèces non modèles est de plus en plus accessible grâce à la disponibilité de protocoles d’édition du génome faciles à utiliser qui ne reposent pas sur l’existence de vastes ressources biologiques et de boîtes à outils moléculaires. L’étude des espèces non modèles devient plus facile et permettra la découverte de nouvelles voies et de déviations intéressantes par rapport aux processus biologiques standard qui ont été élucidés chez les espèces modèles.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce projet a été soutenu par l’Université de Pretoria, le Department of Science and Technology (DST)/National Research Foundation (NRF) Centre of Excellence in Tree Health Biotechnology (CTHB). Le projet a également été soutenu par la chaire SARChi du Professeur BD Wingfield en génomique fongique (numéro de subvention : 98353) ainsi que par la bourse de doctorat NRF du Dr AM Wilson (108548). Les titulaires de subventions reconnaissent que les opinions, les conclusions et conclusions ou recommandations exprimées dans ce travail sont celle des chercheurs et que les organismes de financement n’acceptent aucune responsabilité à cet égard.

Materials

EcoRI-HF New England Biolabs, Ipswich, USA R3101S
EnGen Spy Cas9 NLS protein New England Biolabs, Ipswich, USA M0646T Used to assemble the RNP
Eppendorf 5810 R centrifuge Eppendorf, Hamberg, Germany
FastStart Taq DNA Polymerase Sigma, St Louis, USA 12032902001 Standard DNA polyermase
GeneJET Gel Extraction Kit ThermoFisher Scientific, Waltham, USA K0691
HindIII-HF New England Biolabs, Ipswich, USA R3104S
HiScribeTM T7 Quick High Yield RNA synthesis kit New England Biolabs, Ipswich, USA E2050S
Hygromycin B from Streptomyces hygroscopicus Sigma, St Louis, USA 10843555001
Infors HT Ecotron Shaking Incubator Infors AG, Bottmingen, Switzerland
LongAmp Taq DNA Polymerase New England Biolabs, Ipswich, USA M0323S Long-range, high-fidelity DNA polymerase
Malt extract agar, 2% (MEA) 20 g ME and 20 g agar in 1 l ddH20
Malt extract Sigma, St Louis, USA 70167-500G
Agar Sigma, St Louis, USA A5306
Malt Extract broth, 1% (MEB) Sigma, St Louis, USA 70167-500G 2 g ME in 200 ml ddH20
Malt Extract broth, 2% (MEB) Sigma, St Louis, USA 70167-500G 4 g ME in 200 ml ddH20
Miracloth Merck Millipore, New Jersey, USA 475855
Nylon membrane (positively charged) Sigma, St Louis, USA 11209299001
Osmotic control medium (OCM) 0.3% yeast extract, 20% sucrose, 0.3% casein hydrolysate
Casein Hydrolysate Sigma, St Louis, USA 22090
Sucrose Sigma, St Louis, USA 84097
Yeast extract Sigma, St Louis, USA Y1625
Osmotic control medium (OCM) agar Osmotic control medium (OCM) + 1% agar
Agar Sigma, St Louis, USA A5306
PCR DIG Labeling Mix Sigma, St Louis, USA 11585550910
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase ThermoFisher Scientific, Waltham, USA F-530XL High fidelity DNA polymerase
Plasmid pcb1004 N/A N/A From: Carroll et al., 1994
Presynthesized sgRNA Inqaba Biotec, Pretoria, South Africa Ordered as an synthesized dsDNA with specified sequence
Proteinase K Sigma, St Louis, USA P2308
PTC Solution 30% polyethylene glycol 8000 in STC buffer from above
Polyethylene glycol 8000 Sigma, St Louis, USA 1546605
RNase A ThermoFisher Scientific, Waltham, USA 12091021
RNAfold Webserver Institute for Theoretical Chemistry, University of Vienna N/A http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi
RNAstructure Mathews Lab N/A https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html
Sorbitol, 1 M Sigma, St Louis, USA 1617000 182.17g sorbitol in 1 l ddH20
STC Buffer 20% sucrose, 50 mM Tris-HCl pH 8.00 and 50 mM CaCl2
Calcium chloride Sigma, St Louis, USA 429759
Tris-HCl pH 8.00 Sigma, St Louis, USA 10812846001
Sucrose Sigma, St Louis, USA 84097
Trichoderma harzianum lysing enzymes Sigma, St Louis, USA L1412
Zeiss Axioskop 2 Plus Ergonomic Trinocular Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany
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Referências

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Wilson, A. M., Wingfield, B. D. CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis. J. Vis. Exp. (160), e61367, doi:10.3791/61367 (2020).
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