JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genética

CRISPR-Cas9-מתווכת עריכת גנום ב- Ascomycete ההאנטילה אומנסיס נימה

Published: June 09, 2020
doi:
10.3791/61367
,
1Department of Biochemistry, Genetics & Microbiology,University of Pretoria, 2Forestry & Agricultural Biotechnology Institute (FABI),University of Pretoria

Summary

מערכת עריכת הגנום CRISPR-Cas9 היא עורכת גנום קלה לשימוש ששימשה למינים מודלים ולא דגם. כאן אנו מציגים גרסה מבוססת חלבון של מערכת זו ששימשה להכנסת קודון עצירה מוקדמת לגן הזדווגות של פטריית אסקומיסט לא מודלית.

Abstract

מערכת עריכת הגנום CRISPR-Cas9 היא כלי מולקולרי שניתן להשתמש בו כדי להכניס שינויים מדויקים בגנומים של מינים מודלים ולא דגם כאחד. טכנולוגיה זו יכולה לשמש למגוון רחב של גישות עריכת גנום, החל מנוקאאוטים גנטיים ודפיקות ועד לשינויים ספציפיים יותר כמו הכנסת כמה נוקלאוטידים במיקום ממוקד. עריכת גנום יכולה לשמש עבור מספר רב של יישומים, כולל אפיון תפקודי חלקי של גנים, ייצור אורגניזמים טרנסגניים ופיתוח של כלי אבחון. בהשוואה לאסטרטגיות עריכת גנים שהיו זמינות בעבר, מערכת CRISPR-Cas9 הוצגה כקלה להקמה מינים חדשים ומתגאה ביעילות גבוהה ובספספות. הסיבה העיקרית לכך היא כי כלי העריכה משתמש מולקולת RNA כדי למקד את הגן או רצף של עניין, מה שהופך עיצוב מולקולת היעד פשוט, בהתחשב בכך שכללי שיוך בסיס סטנדרטיים ניתן לנצל. בדומה למערכות עריכה אחרות של הגנום, שיטות מבוססות CRISPR-Cas9 דורשות גם פרוטוקולי טרנספורמציה יעילים ויעילים, כמו גם גישה לנתוני רצף באיכות טובה לעיצוב מולקולות RNA ו-DNA מיקוד. מאז כניסתה של מערכת זו בשנת 2013, הוא שימש כדי להנדס גנטית מגוון רחב של מינים מודל, כולל Saccharomyces cerevisiae, Arabidopsis thaliana, מלנוגסטר Drosophila ו Mus mus mus musculus. לאחר מכן, חוקרים עובדים על מינים שאינם מודל ניצלו את המערכת והשתמשו בו לחקר גנים המעורבים בתהליכים מגוונים כמו חילוף חומרים משני בפטריות, צמיחת נמטודה והתנגדות למחלות בצמחים, בין רבים אחרים. פרוטוקול זה מפורט להלן מתאר את השימוש בפרוטוקול עריכת הגנום CRISPR-Cas9 לחיתוך של גן המעורב במחזור המיני של Huntiella omanensis, פטריית ascomycete נימה השייכת למשפחת Ceratocystidaceae.

Introduction

הזמינות הגוברת של גנומים ותעתיקים איכותיים המורכבים במלואם שיפרה מאוד את היכולת ללמוד מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים במגוון אורגניזמים1. הדבר נכון לגבי שני מיני הדגמים, כמו גם מינים שאינם מודל, שרבים מהם עשויים להציע הבנה מגוונת יותר של תהליכים ביולוגיים. נתונים מסוג זה יכולים לשמש לגילוי גנים, זיהוי רשתות שעתוק והשוואות גנום ותעתיק שלמות, שכל אחת מהן מגיעה עם סט יישומים משלהן. עם זאת, בעוד גנים נחזה, ביאורים וsedly מקושר מסלולים פונקציונליים שונים בקצב שלא נראה מעולם, האפיון הפונקציונלי של גנים אלה נשאר מאחור, מוגבל על ידי ארגזי הכלים המולקולריים הזמינים עבור מינים רבים. זה במיוחד המקרה עבור מינים שאינם מודל, שבו נתונים גנומיים קל יחסית ליצור אבל איפה אפיון מולקולרי נוסף כבר כמעטבלתי אפשרי 1,,2.

אפיון חלקי של הפונקציות של גנים ספציפיים חשובים לביולוגיה של מינים פטרייתיים ניתן להשיג על ידי או נוקאאוט או דפיקות ניסויים ואחריו ניתוח פנוטיפי של זנים מוטציה3. שתי מערכות אלה מסתמכות לחלוטין על הזמינות של פרוטוקולים הנדסיים גנטיים, כולל, לכל הפחות, מערכת טרנספורמציה ומערכת עריכה גנטית. ישנן מספר מערכות טרנספורמציה שונות שפותחו במגוון פטריות נימה4. מערכות פיזיות כמו אלה המסתמכות על ביוליסטיקה ואלקטרואידיות פותחו בטרכודרמה הרזאום5 ואספרגילוס ניז’ר6, בהתאמה. מערכות המשתמשות כימיקלים כגון סידן כלוריד או ליתיום אצטט פותחו ב Neurospora crassa7. לבסוף, מערכות ביולוגיות המסתמכות על השימוש של אגרובקטריום tumefaciens לטרנספורמציה שימשו בהצלחה Ceratocystis albifundus8.

בניגוד לזמינות של פרוטוקולי טרנספורמציה שונים, מערכות עריכת הגנום פחות שופעות. רבים מניסוויו האפיון הפונקציונלי המסורתי שנערך בפטריות נימה השתמשו במבנה נוקאאוט של סמן מפוצל בצורה של סמן בר-בחירה המוקף באזורים של הומולוגיה לאזור היעד אולגן בגנום 3. השיטה מסתמכת על הומולוגיה מכוונת (HR) תיקון DNA, אשר מתקנים שילוב הומולוגי בין מבנה נוקאאוט לאזור של עניין. אירוע זה recombination תוצאות החלפת הגן של עניין עם הרצף של הסמן לבחירה. למרבה הצער, למרות שזה היה מוצלח מינים רבים כולל Cercospora nicotianae10, אספרגילוס fumigatus11 ו Grosmannia clavigera12, שיעורי שילוב הומולוגי משתנים מאוד על פני מינים פטרייתיים שונים, מה שהופך את זה פרוטוקול יעיל ולעתים לא שמיש מיניםמסוימים 3.

מערכות עריכה אחרות של הגנום, כולל אלה לעשות שימוש בגרעין אצבע אבץ (ZFNs) ו nucleases אפקט כמו מפעיל שעתוק (TALENs) ייצגשיפור גדול במערכות ישנות, במיוחד בהתחשב ביכולות שלהם לבצע שינויים ספציפיים ומכוונים13. הן ZFNs והן TALENs מורכבים חלבון גרעין וחלבון המסוגל לזהות רצפי נוקלאוטידים ספציפיים13. עם ההכרה, הגרעין גורם להפסקת דנ”א כפולה שנתקעה שיכולה להקל על כניסתן של מוטציות ספציפיות. על מנת להביא לשינויים בגנום, אזור החלבון המזהה את רצף הנוקלאוטיד צריך להיות מתוכנן במיוחד עבור כל ניסוי. בשל הסתמכות זו על אינטראקציות חומצה גרעין חלבון כדי להנחות את העריכה, עיצוב וייצור מולקולות מיקוד עבור כל נוקאאוט או ניסוי knockin קשהועבודה אינטנסיבית 14,15. המחשה של אתגרים אלה, מעט מאוד פטריות נימה היו נתונים לעריכת הגנום באמצעות מערכות אלה. דוגמה אחת היא מערכת מבוססת TALENs שפותחה בפטריות פיצוץ האורז, Magnaporthe oryzae16.

ניתן לטעון שהמהפכה הגדולה ביותר בתחום עריכת הגנום הייתה הגילוי והפיתוח הבא של מערכת CRISPR-Cas9- עורך גנום המאפשר מחשוף ממוקד של רצף של עניין על ידי אנדונוקליאז המונחה על ידי מולקולת RNA. זה היה שיפור עצום על עורכי הגנום שפותחו בעבר שהסתמכו על אינטראקציות חומצה גרעין חלבון כיתרון העיקרי של מערכת CRISPR-Cas9 הוא שהיא מסתמכת על מולקולת RNA כדי למקד את אזור העניין. משמעות הדבר היא כי המערכת מסתמכת על אינטראקציה RNA-DNA ולכן כללי שיוך בסיס סטנדרטיים ניתן לנצל בעת עיצוב כל ניסוי15.

מערכת CRISPR-Cas9 כמפורט כאן מורכבת משלושה מרכיבים עיקריים: RNA מדריך יחיד (sgRNA), אנזים Cas9 ו-DNA תורם (dDNA)17. ה-SGRNA מורכב מאזור נוקלאוטיד בן 20 הנקרא פרוטו-ספייסר, כמו גם מאזור ארוך יותר הנקרא פיגומים18. אזור פרוטו-ספייסר משמש להדריך את מערכת העריכה לאזור היעד ולכן הוא מעוצב מחדש עבור כל ניסוי. הפיגומים הוא האזור של RNA כי פיזית נקשר אנזים Cas9 כדי ליצור ribonucleoprotein (RNP) ולכן זהה ללא קשר לאזור להיות ממוקד. אנזים Cas9 מקל פיזית על המחשוף של ה-DNA היעד, באמצעות protospacer כמדריך כדי לזהות את האזורהזה 19. הרכיב האחרון, dDNA, הוא אופציונלי והשימוש בו תלוי בניסוי המסוים20. DDNA נמלים את הרצף כי צריך במיוחד להיות מוכנס לאזור להיות חתוך על ידי אנזים Cas9, ולכן הוא אידיאלי עבור ניסויים גנים knockin שבו גן הוא הציג לתוך הגנום או לניסויים נוקאאוט גנים שבו גן עמידות לאנטיביוטיקה או סמן אחר לבחירה הוא הציג כדי להחליף את הגן של עניין. DDNA יכול גם להיות מעוצב באופן כזה כדי להכניס רצפי רומן לתוך הגנום. לדוגמה, כמפורט להלן, ניתן להכניס קודון עצירה בתוך מסגרת לאזור מסוים בגן של עניין כאשר צורך ב-21. יישומים אחרים כוללים את המוטציה של אזורים ספציפיים של הגן, כגוןתחום פונקציונלי 22, או המבוא של רצףתיוג 23.

יתרון מרכזי בשימוש במערכת CRISPR-Cas9 הוא הרב-תכליתיות שלה24. דוגמה אחת ליכולת הסתגלות זו היא שניתן להציג את אנזים Cas9 לתא המארח באחת משלוש צורותיו- DNA, RNA או חלבון, בהתאם למערכת הטרנספורמציה הספציפית המשמשת. כאשר הציג בצורת DNA, הגן cas9 נכלל לעתים קרובות על פלסמיד יחד עם סמן לבחירה, קלטת לבטא את sgRNA, במידת הצורך, קלטת קידוד רצף dDNA25. היתרון העיקרי של מערכת זו הוא שיש להפוך רק מבנה יחיד לתא והשינוי המוצלח מבטיח כי כל הרכיבים הדרושים לעריכת גנום בתיווך CRISRP-Cas9 קיימים. עם זאת, שיטה זו מסתמכת על הזמינות של מערכת ביטוי עבור המינים המארחים. כדי ש-Cas9 תסתיר בהצלחה נזק לדנ”א, יש להתבטא ברמות גבוהות, ולכן נדרש יזם מתאים וספציפי. עבור מינים שאינם מודל שבו יזמים כאלה עדיין לא פותחו, זה עשוי להיות גורם גורע ולכן היכולת להציג Cas9 בצורת RNA או חלבון עשוי להיות אופציה אטרקטיבית יותר. כניסתה של RNA לתא מביאה אתגרים משלה, במיוחד בכך שרנ”א אינו יציב ולא ישרוד את תהליך השינוי. יתר על כן, כאשר הציגו ב- DNA או בצורת RNA, רצף הגן Cas9 ייתכן שיהיה צורך להיות ממוטב codon לשימוש במערכת המארח מסוים17. לדוגמה, הגן cas9 מ Pyogenes סטרפטוקוקוס לא יכול לעבוד בתא מארח יונקים גן cas9 כי כבר codon אופטימיזציה לשימוש בתא יונקים לא יכול לעבוד בתא צמח. ניתן להתגבר על כל האתגרים הללו באמצעות צורת החלבון של Cas9, אשר, יחד עם sgRNA, ניתן להרכיב לתוך RNP והפך לתא המארח26,27. מערכת זו אינה מסתמכת על כל מערכת ביטוי אנדוגנית או אופטימיזציה codon ולכן צריך לעבוד ברוב המינים שאינם מודל. החיסרון של המערכת מבוססת החלבון הוא שהיא אינה תואמת למערכות טרנספורמציה מבוססות DNA כמו העברהבתיווך אגרובקטריום. לכן, כדי שהשיטה המבוססת על חלבונים תעבוד, פרוטוקול טרנספורמציה כגון אלה המסתמכים על פרוטופלסטים או ביוליסטים צריך להיות זמין. מערכת מבוססת RNP זו שימשה בהצלחה פטריות נימה, Fusarium oxysporum26 ו Mucor circinelloides27.

Huntiella omanensis, חברה בממשפחה Ceratocystidaceae, היא פטריה קוסמופוליטית לעתים קרובות למצוא עלצמחי עצים טריים פצועים 28. בעוד שנתוני גנום ותעתיק באיכות גבוהה זמינים למיןזה 28,29,30, לא פותחו פרוטוקולי טרנספורמציה או עריכת גנום. עד כה, מחקר על H. omanensis התמקד המרכיבים הגנטיים הבסיסיים של המחזור המיני שלה29,31. פטריה זו מציגה מחזור מיני הטרוטהאלי טיפוסי, עם רבייה מינית המתרחשת באופן בלעדי בין מבודדים של MAT1-1 ו MAT1-2 סוגיםשל הזדווגות 31. לעומת זאת, MAT1-2 מבודד של moniliformis Huntiella הקשורים באופן הדוק מסוגלים רבייה מינית עצמאית להשלים מחזור מיני בהיעדר שותף MAT1-131. הבדל זה ביכולות המיניות נחשב, לפחות בחלקו, בשל הבדל גדול בגן ההזדווגות, MAT1-2-7, שבו H. omanensis נמלים עותק מלא אורך ושלם, בעוד הגן נחתך קשות H. moniliformis29,31. כדי לאפיין עוד יותר את התפקיד של גן זה ברבייה מינית, הגן MAT1-2-7 של H. omanensis נחתך כדי לחקות את הניתוק לראות H. moniliformis21.

הפרוטוקול שלהלן מפרט את הטרנספורמציה של H. omanensis ואת הניתוח של הגן MAT1-2-7 באמצעות גרסה מבוססת חלבון של מערכת עריכת הגנום CRISPR-Cas9. פרוטוקול זה פותח לאחר הגישות של החלפת גנים הומולוגית מבוססי שילוב מחדש וערוך גנום CRISPR-Cas9 מבוסס פלסמיד לא הצליחו.

Protocol

1. עיצוב וסינתזה של sgRNA כדי לזהות אזורי פרוטו-ספייסר פוטנציאליים שיהוו חלק מה-sgRNA, חפש באופן ידני בגן העניין אחר שלישייה של 5′ NGG 3′ , באמצעות פונקציית החיפוש שבה נעשה שימוש בתוכנית. ביאור שלישיות אלה כרצף PAM.הערה: תוכנות שונות זמינות המחפשות ומבוארות את רצפי PAM ו- protospacer פוטנציאליים. בחר את 20 bp במעלה הזרם של כל רצפי PAM מזוהה ביאור רצפים אלה כprotospacers פוטנציאליים. כדי להחליט על protospacer יחיד, בצע את שלבי הסינון הבאים כדי למחוק רצפים באיכות נמוכה. כדי לבדוק את הייחודיות של הפרוטו-ספייסרים הפוטנציאליים, שלב את רצף PAM ואת הפרוטו-רר לרצף אחד והשתמש בו כשאילתת BLASTn מול הגנום כולו. בטל כל פרוטו-ספייסרים המהרים דמיון לאזור ים אחר בגנום מלבד אזור היעד(איור 1A). כדי להבטיח כי מולקולת RNA תתקפל לתוך המבנה 3D הנכון עבור איגוד אנזים Cas9, ליצור רצף משולב כולל protospacer ואת רצף הפיגומים ספציפי אנזים Cas9. העלה כל אחד מהרציפים הפרוטו-פומר-פיגומים המשולבים לכלי חיזוי מבנה משני של RNA(טבלת חומרים). לנתח את התוצאות על ידי השוואת האנרגיה החופשית המינימלית ומבנים משניים centroid.הערה: מועמדים אידיאליים protospacer יהיו אנרגיה חופשית מינימלית זהה ומבנים משניים centroid. שני המבנים המשניים צריכים להיות מורכבים משלוש לולאות גזע, שנקטעו על ידי חמישה מבני טבעת. המבנים צריכים גם להציג הסתברויות מחייבות גבוהות (המצוין באדום) בכל המבנה, למעט האזור המייצג את הפרוטו-spacer (איור 1B). ערכי האנרגיה בפועל אינם רלוונטיים. בחר מועמד סופי מאלה שעברו את שלבי הסינון לעיל על-ידי בחירת המועמד הקרוב ביותר לאזור הספציפי המיועד. כדי לסנתז את sgRNA כמו מולקולת RNA יחיד, להשתמש ערכת סינתזה sgRNA(טבלתחומרים) תואם אנזים Cas9 מסוים שישמש (למשל, Cas9 מ סטרפטוקוקוס פיוגנס).הערה: השלבים הבאים עשויים להיות תלויים ערכת סינתזה sgRNA בשימוש. במקרה שבו נעשה שימוש ערכה אחרת, בצע את הוראות היצרן. לחלופין, ניתן להזמין את sgRNA מסונתז מראש. בעת עבודה עם RNA, השתמשו בריאגנטים חד-פעמיים ללא גרעין. אם הפרוטו-spacer של 20 bp שנבחר בשלב 1.3 לעיל אינו נותן מחסה ל-G בקצה של 5 אינץ’, הוסף G לאזור זה. הוסף את רצף מקדם T7 לסוף 5′ של רצף היעד. רצף זה הוא סטנדרטי והוא 5′ TTCTAATACGACTCACTATAG 3′. הוסף רצף חפיפה של 14 nt לסוף ה-3′ של רצף היעד. רצף זה הוא ספציפי לערכה והוא 5′ GTTTTAGAGCTAGA 3′ עבור הערכה המשמשת כאן. הזמן את הקטע שנוצר 5′ TTCTATACGACTCACTATAG(N)20 GTTTTAGAGCTAGA, עם (N)20 המייצג את הפרוטוספייסר שנבחר מסונתז מראש(טבלת חומרים). בהתאם לפרוטוקול היצרן(טבלת חומרים),לשלב את הריאגנטים הבאים בטמפרטורת החדר: 2 μL של מים, 10 μL של מאגר תגובה, 5 μL של רצף פרוטוספייסר מסונתז, 1 μL של 0.1 M DTT ו 2 μL של אנזים תעתיק. דגירה פתרון זה ב 37 ° C במשך 30 דקות ולהעביר לקרח. להוסיף 30 μL של מים 2 μL של DNase I, לערבב דגירה ב 37 ° C במשך 15 דקות נוספות. לדמיין את sgRNA וכתוצאה מכך על 2% ג’ל agarose. 2. בדיקת יכולת מחשוף במבחנה של sgRNA הערה: שלב זה הוא אופציונלי אך מומלץ. פריימרים עיצוב זה יהיה להגביר את השבר מחסה את הרצף של האתר כי sgRNA שנבחר יהיה יעד ולהגביר את האזור באמצעות פולימראז DNA סטנדרטי.הערה: אם אפשר, לעצב פריימרים באופן כזה שמחשוף באתר היעד יפיק שני שברים בגדלים שונים מאוד שניתן להבחין בקלות אחד עם השני על ג’ל agarose סטנדרטי. להרכיב את sgRNA-Cas9 ריבונוקלאופרוטאין משולב (RNP) על ידי דגירה פתרון המורכב 30 nM sgRNA כמו מסונתז לעיל, 30 nM Cas9 חלבון, 10x מאגר תגובה ו 10 μL של מים ב 25 ° C עבור 10 דקות. בדוק את יכולת המחשוף של sgRNA על ידי הוספת מוצר PCR של אזור היעד לתוך פתרון RNP לריכוז סופי של 3 nM. דגירה בתמיסה ב 37 °C במשך 15 דקות. להוסיף 3 μg של חלבון K ו 2 μg של RNase לפתרון כדי לעצור את תגובת המחשוף דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות. דמיין את שברי הדנ”א המתווברים על ג’ל אגרוז של 2%. SgRNA מתאים בניסויים vivo אם שתי להקות בגודל הצפוי נצפו על הג’ל. 3. עיצוב וסינתזה של dDNA תכנן את ה-dDNA כך שיכלול שלושה אזורים, 5′ ו-3′ עם השלמה לאזור הגנומי המיועד לאזור הגנומי המיועד לאזור האמצעי, המפנה סמן הניתן לבחירה(טבלת חומרים, איור 2).הערה: ניתן להוסיף גם רצפים ספציפיים אחרים לסמן הניתן לבחירה זה. עבור ניסוי מסוים זה, רצף stop codon (5′ TGA 3′) נוסף ממש לפני הסמן לבחירה, ובכך החדרת codon עצירה בתוך המסגרת לתוך הגן. ניתן להזמין את ה-dDNA מסונתז מראש. לחלופין, dDNA ניתן להגביר ולהרכיב באמצעות צעד צעד, גישת PCR חופף כמפורט להלן. עצב פריימרים כדי להגביר כ-800 סיביות של אזורי איגוף של 5 ו-3 אינץ’. הוסף 20 nt של רצף המשלים לרצף של הסמן הניתן לבחירה פריימר ההפוך של אזור 5′ ואת פריימר קדימה של אזור 3′ . פריימרים עיצוב להגביר את הסמן לבחירה, להבטיח כי המוצר מוגבר נמלים גן ההתנגדות, כמו גם מקדם ידוע לעבוד במין של עניין. שימוש בפולימראז DNA באיכות גבוהה(טבלת חומרים),להגביר את שלושת אזורי dDNA. הגבירו את האזורים של 5 ו-3′ מה-gDNA של האורגניזם שנערך. הגביר את הסמן הניתן לבחירה ממקור רלוונטי. בתגובה אחת, שלבו את האזור ההגדלה של 5 אינץ’ עם הסמן הניתן לבחירה, ובשימוש בפולימראז DNA ארוך טווח ונאמנות גבוהה, הגבירו את האזור כולו. בתגובה אחת שנייה, שלבו את האזור ה-3′ ההגדלה עם הסמן הניתן לבחירה, ובשימוש בפולימראז DNA ארוך טווח ונאמנות, הגבירו את האזור כולו. לבסוף, לשלב את שני מוצרי PCR הקודמים לתגובה אחת ולהגביר את רצף dDNA כולו עם ארוך טווח, פולימראז DNA באיכות גבוהה. דמיין את שבר הדי.אן.איי על ג’ל אגרוז 1%. במקרה כי שני שברים או יותר מיוצרים, לטהר את השבר בגודל הנכון מן הג’ל באמצעות ערכת טיהור ג’ל. 4. חילוץ פרוטופלסטים כדי לייצר conidia, לחסן 200 מ”ל של טרי 2% מרק תמצית מאלט (MEB) בקבוקון 500 מ”ל עם 1 ס”מ x 1 ס”מ mycelia מכוסה agar בלוק.הערה: לא כל הפטריות מסוגלות לייצר קונידיה. במקרה זה, ניתן להשתמש גם במיליה. זה בדרך כלל ידרוש ריכוזים גבוהים יותר של אנזים lysing עוד יותר בפרוטוקול. דגירה את התרבות הנוזלית באינקובטור רועד ב 25 מעלות צלזיוס עם טלטול ב 120 סל”ד עבור 24 – 48 שעות.הערה: זמן הדגירה והטמפרטורה ממוטבים עבור H. omanensis. זה יצטרך להיות אופטימיזציה עבור מינים אחרים. לקצור את הקונידיה; לסנן את התרבות הנוזלית דרך שכבה של בד מעבדה סטרילי (למשל, Miracloth), להעביר את המתלים conidial לתוך 50 mL צנטריפוגה צינורות צנטריפוגה ב 3,220 x g ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. זרוק את הסופרנטנט. תוסתה מחדש את conidia ב 5 מ”ל של מים פיפטה 10 μL של תמיסת conidia על שקופית מיקרוסקופ ולכסות עם כיסוי. דמיין באמצעות מיקרוסקופ מורכב תחת הגדלה 40x כדי להבטיח רק conidia כבר התאושש(איור 3A). בקבוקון 500 מ”ל, לחסן 200 מ”ל של טרי 1% MEB עם הנפח הכולל של conidia resuspened. דגירה את התרבות הנוזלית באינקובטור רועד ב 25 מעלות צלזיוס עם טלטול של 120 סל”ד עד 12 שעות.הערה: זמן הדגירה הזה עבר אופטימיזציה עבור H. omanensis. זה יצטרך להיות אופטימיזציה עבור מינים אחרים. כדי לקצור את הנבטים, להעביר את התרבות הנוזלית לתוך צינורות צנטריפוגה 50 מ”ל צנטריפוגה ב 3,220 x g ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. זרוק את הסופרנטנט. תוסתר מחדש את הנבטים ב-10 מ”ל של 1 מ’ סורביטול. פיפטה 10 μL של פתרון הנבט על שקופית מיקרוסקופ ולכסות עם כיסוי. לדמיין באמצעות מיקרוסקופ מורכב תחת הגדלה 40x כדי להבטיח רק germlings כבר התאוששו(איור 3B).הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. לאחסן חיידקים ב-1 מ’ סורביטול ב-80 מעלות צלזיוס. כדי ללקט את קירות התא של germlings הצעיר ולשחרר את protoplasts, להוסיף 1 מ”ל של מתלה germling 9 מ”ל של אנזים lysing בריכוזים שונים בקבוק סטרילי 50 מ”ל.הערה: ריכוזי אנזימים שונים וזמן דגירה משמשים ותוכנן למצוא בטבלה 1. האנזימים והריכוזים צפויים להשתנות גם הם בהתאם לפטרייה ויהיה צורך לייעל את המקום עבור כל מין. דגירה בתמיסת נבוב-אנזים באינקובטור רועד ב-25 מעלות צלזיוס עם טלטול של 80 סל”ד למשך 2-3 שעות. לסנן את פתרון protoplast דרך שכבה של בד מעבדה סטרילי ולאסוף את protoplasts על ידי צנטריפוגה ב 1,810 x g ב 4 ° C במשך 10 דקות. זרוק את הסופרנטנט.הערה: Protoplasts הם תאים ללא קירות תא ולכן רגישים מאוד לשיבוש מכני. הקפד לטפל בהם בזהירות, במיוחד כאשר pipetting. בזהירות respenpent את גלולת protoplast ב 200 μL של מאגר STC (טבלת חומרים). פיפטה 10 μL של פתרון protoplast על שקופית מיקרוסקופ ולכסות עם כיסוי. לדמיין באמצעות מיקרוסקופ מורכב תחת הגדלה 40x כדי להבטיח רק protoplasts כבר התאוששו(איור 3C). באמצעות המוציטטומטר, לספור ולחשב את מספר protoplasts שנוצר בשלבים לעיל. לדלל את תמיסת protoplast לתוך aliquots המכיל כ 5 x 106 protoplasts.הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. אחסן פרוטופלטס במאגר STC ב- -80 °C. 5. טרנספורמציה בסיוע Protoplast ו-PEG והתאוששות טרנספורמטיבית כדי להתחיל את הטרנספורמציה, לשלב כ 5 x 106 protoplasts עם אמצעי אחסון יחיד של פתרון RNP וכ 6 μg של קטע dDNA.הערה: Protoplasts רגישים מאוד לשיבוש מכני. הקפד לטפל בהם בזהירות, במיוחד כאשר pipetting. באמצעות פיפטה, לאט לטפטף 1 מ”ל של פתרון PTC טרי 30% על פתרון protoplast דגירה את הפתרון בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.הערה: שלב זה הוא צעד רגיש וחשוב מאוד. הקפד להשתמש בפתרון PTC טרי ושחרר את הפתרון על התאים לאט ובאופן שווה ככל האפשר, יצירת שכבה הידרופובית על פני פני התא. הוסף 5 מ”ל של אמצעי בקרה אוסמוטי (OCM) לפתרון protoplast ופיפט לאט ובעדינות כדי להבטיח את הפתרון מעורב ביסודיות. דגירה תמיסת protoplast באינקובטור רועד ב 25 מעלות צלזיוס עם טלטול ב 80 סל”ד לילה. כדי לבחור את המבודדים שהפכו, חלק את הפתרון ל-5 לוחות תרבות ריקים של 60 מ”מ. להוסיף 10 מ”ל של OCM אגר בתוספת עם 30 μg / מ”ל hygromycin B לכל צלחת תרבות ולסובב לאט כל צלחת לערבב ביסודיות. אפשר את השכבה הראשונה של אגר להגדיר לפני הוספת 10 מ”ל של אגר בינוני בקרת אוסמוטי בתוספת 40 μg / מ”ל hygromycin B. אפשר לשכבה השנייה של אגר להגדיר דגירה את התרבויות ב 25 מעלות צלזיוס עד מבודד יחיד ניתן לראות גדל דרך שתי שכבות של אגר. כדי לשחזר מבודדים שעברו שינוי מוצלח, להעביר את מבודדים בודדים מסוגל צמיחה דרך שכבת אגר בתוספת 40 μg / מ”ל hygromycin B כדי טרי תמצית מאלט אגר (MEA) צלחות בתוספת עם 50 μg / מ”ל hygromycin B (MEA-50). דגירה תרבויות טריות ב 25 °C במשך 5 ימים, בדיקת מדי יום לצמיחה. תרבויות המסוגלות לצמיחה מתמשכת במדיה זו השתנו בהצלחה ותוכו לשמש למחקר נוסף. 6. אישור האינטגרציה והיציבות של dDNA על מנת לאשר כי dDNA כבר משולב לתוך הגנום באזור היעד, פריימרים עיצוב המקיפים את האתרים הצפויים 5 ‘ ו 3 ‘ להוסיף(איור 2). בצע שני PCRs באמצעות שתי ערכות פריימר אלה פולימראז DNA באיכות גבוהה. אם שני ה-PCRs מניבים אמפליצ’ונים בגודל ורצף צפויים, ה-dDNA שולב בהצלחה באזור היעד. לאחר מכן, להעריך את כתם מוטציה לאינטגרציה יציבה של dDNA. על מנת לאשר כי dDNA כבר משולב באופן יציב לתוך הגנום יישמר במהלך צמיחה צמחית, לבצע בדיקת העברת מדיה. העבר בלוק של אגר מכוסה mycelial ממוטציה גדל באופן פעיל מבודד על MEA-50 בינוני עד בינוני MEA לא מותנה. דגירה ב 25 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים. העבר בלוק של אגר מכוסה mycelia מן המבודד גדל על MEA בינוני MEA-50 בינוני. דגירה ב 25 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים. חזור על תהליך זה, העברת mycelia גדל באופן פעיל מ בתוספת למדיום לא מותל לפחות ארבעה סיבובים.הערה: אם המבודד מסוגל לצמיחה מתמשכת על MEA-50 בינוני לאחר העברות רבות, dDNA כבר משולב באופן יציב לתוך הגנום, ניתן לשמור באמצעות צמיחה צמחית. ניתן להעריך את כתם המוטנטים לנוכחות של עותק אחד בלבד של dDNA המשולב. על מנת לאשר כי dDNA כבר משולב לתוך הגנום במיקום אחד, לבצע ניתוח כתם דרומי. לעכל סך של 30 μg של gDNA מכל זן מוטציה באמצעות אנזימי הגבלת דיל היןו- EcoRI בהתאם לפרוטוקולי היצרן.הערה: בעוד הבחירה של אנזים הגבלה תלוי החוקר, ודא כי אתר הזיהוי של אנזים ההגבלה אינו קיים ברצף dDNA. להפריד את gDNA מעוכל על ג’ל agarose 0.75% ולהעביר את ה-DNA על קרום ניילון באמצעות הליכיםסטנדרטיים 32. נושא את הממברנה להכלאה באמצעות גשוש הכוון את רצף dDNA. עצב פריימרים כדי להגביר אזור קצר (300 bp) של dDNA. באמצעות פריימרים אלה, לסנתז את הגשוש באמצעות תמהיל תיוג PCR DIG. השתמש בבדיקה מסונתזת חדשה עבור הכלאה קרום, טיפול והדמיה באמצעות הליכים סטנדרטיים32. אם רק להקה אחת נראית בכל נתיב, dDNA נמצא במיקום אחד בלבד בגנום. זן המוטנטים יכול לשמש כעת לניתוח פנוטיפיק נוסף ותניסווני אפיון פונקציונליים. 7. ניתוח פנוטיפי של זנים מוטנטיים לערוך ניסויי הזדווגות כדי לקבוע אם לשיבוש של הגן MAT הייתה השפעה על היכולות המיניות של הפטריה הנחקרת.הערה: שלב זה תלוי בגן מסוים ומינים הנחקרים. במקרה זה, הגן להיות מיקוד נחשב להיות מעורב ברבייה מינית ובכך נערכו בדיקות הזדווגות. אם הגן נחשב, למשל, להיות מעורב ברבייה א-מינית, אז משהו כמו ייצור חסין יכול להימדד. על מנת לבדוק את היכולות ההטרותאליות של זן המוטנטים, לחסן יחד מדיום MEA טרי עם זן מוטציה, כמו גם זן של סוג הזדווגות נגד. במקרה של ה. אומנסיס, יש לשמור על מכסי הלוחות סגורים, אך לא אטומים ותווסתים בטמפרטורת החדר למשך 7 ימים. הערכה חזותית לייצור מבנים מיניים. על מנת לבדוק את היכולות ההומותאליות של זן המוטנטים, לחסן מדיום MEA טרי עם זן מוטציה. במקרה של ה. אומנסיס, יש לשמור על מכסי הלוחות סגורים, אך לא אטומים ותווסתים בטמפרטורת החדר למשך 7 ימים. הערכה חזותית לייצור מבנים מיניים. לערוך ניסויי קצב צמיחה כדי לקבוע אם השיבוש של הגן MAT הייתה השפעה על קצב הצמיחה של הפטריה נחקרת. צור תקעי אגר מכוסי mycelial מן הקצה הגדל באופן פעיל של תרבויות של זנים מוטציה וs wildtype על ידי החדרת הצד האחורי של קצה פיפטה גדול, סטרילי לתוך הגר. לחסן מדיום MEA טרי עם אטמי אגר אלה. ודא שלפחות שלושה שכפולים לכל סוג תרבות מיוצרים. לאחר 3 ימים של צמיחה ב 20 מעלות צלזיוס, למדוד את הצמיחה על שני קוטרים ניצבים. השווה את הנתונים מהזנים הפראיים והמוטנטיים.

Representative Results

הפרוטוקול המתואר לעיל הקל על הכנסת קודון עצירה מוקדמת לגן הזדווגות מהאסטומנט הלא-מודלי, H. omanensis. תהליך זה השתמש בגרסה של מערכת עריכת הגנום CRISPR-Cas9 ולכן אחד השלבים החשובים ביותר בפרוטוקול זה הוא העיצוב והסינוזה של sgRNA באיכות גבוהה. איור 1 מראה כיצד מולקולה זו תוכננה באופן כזה שהיא A) מתמקדת במיוחד בגן העניין ומראה דמיון מועט לאזורים אחרים בגנום וב’ מתקפלת כראוי כדי להיקשר עם חלבון Cas9. SGRNA חייב גם להיות מסוגל ביעילות לתקדרך את אזור היעד. היכולת של SGRNA למקד ולאפשר את המחשוף של אזור היעד נערכה במבחנה, מניב שני מוצרים בגודל הצפוי. לאחר טרנספורמציה מוצלחת התרחשה, חשוב להבטיח כי dDNA השתלב בגנום רק פעם אחת במקום הצפוי. איור 2 מדגים את העיצוב של פריימרים PCR המתמקדים באתרי הכניסה, בהם ניתן להשתמש כדי לסנן את הטרנספורמטורים הפוטנציאליים עבור אתר השילוב הנכון. על-ידי עיצוב פריימרים המקיפים את אתרי הכניסה של 5′ ו- 3 אינץ’, ההגדלה אפשרית רק אם ה- dDNA נוסף באזור הנכון. איור 4 ממחיש כי קודון עצירה מוקדמת הוכנס לתוך הגן MAT1-2-7 לתוך מסגרת הקריאה הנכונה, להבטיח כי הגן יהיה ל נחתך באופן דומה לזה של H. moniliformis. יתר על כן, ניתוח כתם דרומי הראה כי מבנה dDNA היה משולב רק באתר אחד בגנום. הצלחת הפרוטוקול אושרה בניתוח הפנוטיפיק של הזנים המוטנטים. במקרה של ניסוי השיבוש MAT1-2-7, פותחו שני זנים מוטנטים עצמאיים. בשני המבודדים, קצב הצמיחה הרדיאלי הצמחי הופחת באופן משמעותי, מה שמצביע על השפעה פליוטרופית של גן ההזדווגות החדשני(איור 5). יתרה מזאת, מבודדי המוטנטים לא היו מסוגלים להשלים מחזור מיני, ויצרו רק מבנים מיניים לא בוגרים שלא הנפקו נבגים מיניים (איור 5). זאת בניגוד לבידודי Wildtype, שהשלימו את כל המחזור המיני בתוך ימים ספורים של דגירה (איור 5). איור 1: בחירת מועמד מתאים ל-SGRNA.(A) sgRNA מתאים יהיה רק דמיון לאזור היעד של הגנום (במקרה זה המצוין על ידי רצף לוקוס MAT). (ב)sgRNA מתאים יהיה אנרגיה חופשית מינימלית זהה ומבנים משניים centroid, עם שלוש לולאות גזע וחמש טבעות בלולאת השלב העיקרי. יתר על כן, רוב המבנה יהיו הסתברויות מחייב גבוהות (המצוין בכתום כהה ואדום) בעוד הסתברויות איגוד נמוכות יותר יש לראות באזור protospacer (המצוין על ידי המשולשים השחורים). לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 2: עיצוב, ההגדלה והרכבה של ה-dDNA.זוגות פריימר הראשון והשני (PP1 ו PP2) משמשים כדי להגביר כ 800 bp במעלה הזרם (5′) ו 800 bp במורד הזרם (3′) של הגן של עניין. פריימר הפוך של PP1 ואת פריימר קדימה של PP2 כוללים אזורים של הומולוגיה לקלטת התנגדות hygromycin. צמד פריימר השלישי ממעיט בכל קלטת ההתנגדות להיגרומיצין. באופן צעד אחד, האמפליצ’ונים השונים נאספים עד שכל ה-dDNA, המורכב מאזור ה-5 אינץ’, קלטת ההתנגדות להיגרומיצין ואזור של 3 אינץ’. כאשר הפך לתא, dDNA צריך להתלכד מחדש באזור שבו האנזים Cas9 היה הורה לחתוך, ובכך להחליף את הגן של עניין עם קלטת התנגדות היגרומיצין. ניתן להשתמש ב- PP4 ו- PP5 כדי לקבוע אם dDNA הוכנס כראוי לגנום במיקום המתאים. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 3: סוגי התאים השונים החשובים במהלך פרוטוקול החילוץ של הפרוטופלסט.(א)Conidia משמשים כחומר ההתחלתי עבור הפרוטוקול. קונידיה אלה רשאים לנבט ולגדול עד שהם(ב)germlings צעירים. שלב הצמיחה האידיאלי של הנבטים הצעירים מסומן על ידי שני החצים השחורים. גדילים מסליאליים אחרים לראות על (B) הם בוגרים מדי עבור השפלה ותו לא צריך לשמש. השלב האחרון של הפרוטוקול הוא שחרור הפרוטופלסטים העגולים (C), המצוינים על ידי העיגולים השחורים המנוקדים. תאים אלה כבר אין קירות תא ולכן רגישים מאוד לשיבוש מכני. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 4: השילוב המוצלח של קודון עצירת TGA לתוך הגן MAT1-2-7 של H. omanensis.(א)הגן H. omanensis MAT1-2-7 באורך מלא, עם אתר היעד sgRNA המצוין על ידי החץ הירוק. (ב)תרשים מוגדל של אתר היעד sgRNA בתוך הגן H. omanensis MAT1-2-7. (ג)תרשים מוגדל של אזור של dDNA מראה את קודון העצירה מוקף זרועות הומולוגיות לגן MAT1-2-7 של H. omanensis. (ד) כרומטוגרמה רצף סנגר המציין את השילוב המוצלח של codon להפסיק לתוך הגן MAT1-2-7. שונה מוילסון ואח’ 202021. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. איור 5: ההבדלים הפנוטיים בין (א) סוג פראי מבודד לבין (ב) מוטנט מבודד.שלוש התמונות הראשונות בכל פאנל מראות את ההבדלים ביכולות המיניות של שני סוגי המבודדים. בעוד wildtype מבודד טופס ascomata בוגר במהלך רבייה מינית, להשלים עם ההתכחשות של נבגים מקצות הצוואר ascomatal, המוטנט מבודד טופס רק מבנים מיניים ילדותיים שלא מייצרים נבגים מיניים. התמונה הרביעית בכל פאנל מציגה את ההבדל בקצב הצמיחה ומורפולוגיה של שני סוגי בידוד. בעוד המבודד wildtype גדל הרבה יותר מהר עם יותר mycelia אוויר, המוטנט מראה איטי יותר והוא שקוע בתוך agar. שונה מוילסון ואח’ 202021. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה. תגובה (תגובה ריכוז אנזימים זמן השפלה א’ 1.250 מ”ג/מ”ל 180 דקות ב’ (ב’ 1.875 מ”ג/מ”ל 180 דקות ג’ (C) 2.500 מ”ג/מ”ל 150 דקות D (D) 3.750 מ”ג/מ”ל 150 דקות הי.א. 4.375 מ”ג/מ”ל 120 דקות ת’, ו 5,000 מ”ג/מ”ל 120 דקות טבלה 1: השפלה של פתרון הנבט/מיקליה עם אנזימים פירוקים מטריכודרמה הרזיאנום. ריכוזי האנזימים השונים מתאימים לתקופות דגירה שונות, עם ריכוזים נמוכים יותר הדורשים דגירה ארוכה יותר.

Discussion

הפרוטוקול לטרנספורמציה מוצלחת של H. omanensis ועריכה של הגן MAT1-2-7 הוכח על ידי החדרת codon עצירה מוקדמת במסגרת יחד עם גן להתנגדות hygromycin B21. זה הושג באמצעות גרסה מבוססת חלבון של מערכת עריכת הגנום CRISPR-Cas9. הניסוי כלל את שעתוק המבחנה של sgRNA, הרכבה מבוססת PCR של dDNA ואת הטרנספורמציה ההדדית של שתי חומצות גרעין אלה עם אנזים Cas9 זמין מסחרית לתוך פרוטופלסטיות שחולצו H. omanensis

שלא כמו פרוטוקולים אחרים המסתמכים על הזמינות של כלים מולקולריים רבים אחרים, הפרוטוקול המתואר לעיל יכול לשמש בהצלחה מינים שעבורם ארגז הכלים המולקולרי עדייןמוגבל למדי 21. הפרוטוקול מסתמך רק על מערכת טרנספורמציה מבוססת ועל הזמינות של נתוני NGS, רצוי רצף גנום שלם. בעוד מערכת טרנספורמציה יעילה עשויה לקחת קצת אופטימיזציה במין שעבורו זה לא זמין, ישנם פרוטוקולים רבים ושונים זמינים עבור מגוון מינים. יתר על כן, נתוני הגנום הופך יותר ויותר זמין אפילו המעורפל ביותר של מינים והוא הופך להיות קל יותר ליצור דה נובו אם זה לא קיים כבר.

בהינתן אורך הפרוטוקול, ישנם שלבים רבים שבהם ניתן להציג שינויים ובמידת הצורך בפתרון בעיות. הדבר נכון במיוחד לגבי הצעדים הנחשבים למינים ספציפיים. לדוגמה, ישנם שלבי דגירה רבים בפרוטוקול זה שיש לבצע בטמפרטורות ספציפיות ובמשך זמן מסוים כדי ליצור סוגי תאים חשובים לניסוי. צעדים אלה ידרשו אופטימיזציה ספציפית למינים. במידת האפשר, מיקרוגרפים של תאים מסוימים או שלבי צמיחה מסוימים סופקו כדי לסייע בהעברת פרוטוקול זה למין אחר(תחונה 1). הסוג והריכוז של אנזימים המשמשים כדי להשפיל את קירות התא של התאים פטרייתיים על מנת לשחרר את protoplasts יהיה גם ספציפי למינים של פטריות נחקר. בפרוטוקול זה, רק מקור אחד של אנזימים lysing מ משמש, בעוד שילובי אנזימים שונים נדרשים לחילוץ פרוטופלסטה מינים כמו Fusarium verticillioides33. שלב זה תלוי לחלוטין בהתהוות הכימית של קיר התא ולכן יהיה צורך לייעל על בסיס מין למינים.

שיטה זו משמעותית במיוחד עבור אלה החוקרים מינים שאינם מודל כפי שאין הסתמכות על מערכת ביטוי. שיטה פופולרית של הקמת מערכת עריכת הגנום CRISPR-Cas9 היא לבטא את חלבון Cas9, sgRNA, כמו גם dDNA מאחד או שניים פלסמידים שהופכים לתאים של בחירה. במקרה זה, Cas9 צריך לבוא לידי ביטוי על ידי יזם כי הוא מסוגל רמות גבוהות של ביטוי אורגניזם מסוים נחקר. יזמים כלליים פותחו לשימוש בפטריות נימה ובעוד הם אינם תואמים בכל המינים, הם מאפשרים ביטוי ברמה נמוכה, ניתן להשתמש בהצלחה כדי לבטא, למשל, גנים עמידות לאנטיביוטיקה. יזמים אלה, עם זאת, לעתים קרובות אינם מאפשרים רמות גבוהות של ביטוי ולכן לא ניתן להשתמש כדי לבטא את חלבון Cas9. שימוש בגרסה מבוססת חלבון של מערכת עריכת הגנום CRISPR-Cas9 מתגבר על מגבלה זו ומאפשר sgRNA ו dDNA להיות בשותף להפוך לתא עם אנזים Cas9 המיוצר כבר.

הפיתוח של מערכת מבוססת חלבון זו לשימוש H. omanensis הגיע לאחר ניסיונות כושלים רבים בעריכת הגנום באמצעות הגישה הקלאסית פיצול סמן, כמו גם מערכת CRISPR-Cas9 מבוססת פלסמיד. בעוד היעילות שונה ממין למינים, הגישה סמן מפוצל שימש בהצלחה עם 100% יעילות מינים מגוונים כמו אלטרנטהאלטרנריה34,35, ו C. nicotianae36. לעומת זאת, היעילות של מערכת זו בH. omanensis היה אפס, למרות יותר מ 80 אירועי טרנספורמציה ואינטגרציה עצמאיים. באופן דומה, מערכת CRISPR-Cas9 מבוססת פלסמיד שימשה בהצלחה עם יעילות גבוהה בטריכודרמה ריסיי (>93%)17 Penicillium chrysogenum 37 זאת, שוב, בניגוד לתועלת של מערכת זו בH. omanensis. ביטוי מספיק של חלבון Cas9 לא היה בר השגה ב H. omanensis למרות שניסה מספר יזמים פוטנציאליים, כולל שני יזמים ספציפיים למינים שחזו מגנים משק בית. לכן, לא היתה דרך כלל להשתמש במערכת זו. עם זאת, באמצעות הגרסה מבוססת החלבון של מערכת CRISPR-Cas9 הניבו שנאים עצמאיים רבים, ששניים מהם טיפטו את ה-dDNA המשולב במיקום הנכון. יתר על כן, ניסוי זה נוסה רק פעם אחת והצליח- ממחיש עוד יותר את הקלות שבה ניתן להשתמש במערכת זו.

יישומים עתידיים של פרוטוקול זה כוללים אופטימיזציה ושימוש מינים אחרים של Ceratocystidaceae. יש כבר שפע של נתוני NGS זמינים עבור מיניםאלה 30,38,39 מחקרים לגבי ספציפיות המארחשלהם 40, קצב צמיחה וvirulence41 נערכו. מחקרים אלה ניתן לחזק על ידי האפיון הפונקציונלי של הגנים שנחשבים להיות מעורבים בתהליכים אלה, מחקר אשר כעת יתאפשר בשל הזמינות של פרוטוקול טרנספורמציה עריכת הגנום.

לסיכום, חקירה יסודית של הגנים העומדים בראש תהליכים ביולוגיים חשובים במין שאינו מודל הופכת לנגישה יותר הודות לזמינות של פרוטוקולי עריכת גנום קלים לשימוש שאינם מסתמכים על קיומם של משאבים ביולוגיים נרחבים ועתרי כלים מולקולריים. לימוד מינים שאינם מודל הופך לקל יותר ויאפשר גילוי של מסלולים חדשניים סטיות מעניינות מהתהליכים הביולוגיים הסטנדרטיים שהתבהרו במין המודל.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

פרויקט זה נתמך על ידי אוניברסיטת פרטוריה, המחלקה למדע וטכנולוגיה (DST)/המרכז הלאומי למחקר (NRF) של מצוינות בביוטכנולוגיה של בריאות עץ (CTHB). הפרויקט נתמך בנוסף על ידי יו”ר DST/NRF SARChI של פרופ’ BD Wingfield בגנומיקה פטרייתית (מספר מענק: 98353) ותמ”א 108548 של ד”ר AM Wilson. בעלי המענק מכירים בכך שדעות, ממצאים ומסקנות או המלצות המובעות ביצירה זו הן של החוקרים, ושגופי המימון אינם מקבלים כל אחריות בעניין זה.

Materials

EcoRI-HF New England Biolabs, Ipswich, USA R3101S
EnGen Spy Cas9 NLS protein New England Biolabs, Ipswich, USA M0646T Used to assemble the RNP
Eppendorf 5810 R centrifuge Eppendorf, Hamberg, Germany
FastStart Taq DNA Polymerase Sigma, St Louis, USA 12032902001 Standard DNA polyermase
GeneJET Gel Extraction Kit ThermoFisher Scientific, Waltham, USA K0691
HindIII-HF New England Biolabs, Ipswich, USA R3104S
HiScribeTM T7 Quick High Yield RNA synthesis kit New England Biolabs, Ipswich, USA E2050S
Hygromycin B from Streptomyces hygroscopicus Sigma, St Louis, USA 10843555001
Infors HT Ecotron Shaking Incubator Infors AG, Bottmingen, Switzerland
LongAmp Taq DNA Polymerase New England Biolabs, Ipswich, USA M0323S Long-range, high-fidelity DNA polymerase
Malt extract agar, 2% (MEA) 20 g ME and 20 g agar in 1 l ddH20
Malt extract Sigma, St Louis, USA 70167-500G
Agar Sigma, St Louis, USA A5306
Malt Extract broth, 1% (MEB) Sigma, St Louis, USA 70167-500G 2 g ME in 200 ml ddH20
Malt Extract broth, 2% (MEB) Sigma, St Louis, USA 70167-500G 4 g ME in 200 ml ddH20
Miracloth Merck Millipore, New Jersey, USA 475855
Nylon membrane (positively charged) Sigma, St Louis, USA 11209299001
Osmotic control medium (OCM) 0.3% yeast extract, 20% sucrose, 0.3% casein hydrolysate
Casein Hydrolysate Sigma, St Louis, USA 22090
Sucrose Sigma, St Louis, USA 84097
Yeast extract Sigma, St Louis, USA Y1625
Osmotic control medium (OCM) agar Osmotic control medium (OCM) + 1% agar
Agar Sigma, St Louis, USA A5306
PCR DIG Labeling Mix Sigma, St Louis, USA 11585550910
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase ThermoFisher Scientific, Waltham, USA F-530XL High fidelity DNA polymerase
Plasmid pcb1004 N/A N/A From: Carroll et al., 1994
Presynthesized sgRNA Inqaba Biotec, Pretoria, South Africa Ordered as an synthesized dsDNA with specified sequence
Proteinase K Sigma, St Louis, USA P2308
PTC Solution 30% polyethylene glycol 8000 in STC buffer from above
Polyethylene glycol 8000 Sigma, St Louis, USA 1546605
RNase A ThermoFisher Scientific, Waltham, USA 12091021
RNAfold Webserver Institute for Theoretical Chemistry, University of Vienna N/A http://rna.tbi.univie.ac.at/cgi-bin/RNAWebSuite/RNAfold.cgi
RNAstructure Mathews Lab N/A https://rna.urmc.rochester.edu/RNAstructureWeb/Servers/Predict1/Predict1.html
Sorbitol, 1 M Sigma, St Louis, USA 1617000 182.17g sorbitol in 1 l ddH20
STC Buffer 20% sucrose, 50 mM Tris-HCl pH 8.00 and 50 mM CaCl2
Calcium chloride Sigma, St Louis, USA 429759
Tris-HCl pH 8.00 Sigma, St Louis, USA 10812846001
Sucrose Sigma, St Louis, USA 84097
Trichoderma harzianum lysing enzymes Sigma, St Louis, USA L1412
Zeiss Axioskop 2 Plus Ergonomic Trinocular Microscope Zeiss, Oberkochen, Germany
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Ekblom, R., Galindo, J. Applications of next generation sequencing in molecular ecology of non-model organisms. Heredity. 107, 1-15 (2011).
  2. Russell, J. J., et al. Non-model model organisms. BMC Biology. 15 (55), 1-31 (2017).
  3. Kück, U., Hoff, B. New tools for the genetic manipulation of filamentous fungi. Applied Microbiology and Biotechnology. 86, 51-62 (2010).
  4. Li, D., Tang, Y., Lin, J., Cai, W. Methods for genetic transformation of filamentous fungi. Microbial Cell Factories. 16 (168), 1-13 (2017).
  5. Lorito, M., Hayes, C. K., Di Pietro, A., Harman, G. E. Biolistic transformation of Trichoderma harzianum and Gliocladium virens using plasmid and genomic DNA. Current Biotechnology. 24, 349-356 (1993).
  6. Taylor, P., et al. Transformation of intact Aspergillus niger by electroporation. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 58 (12), 2224-2227 (2014).
  7. Dhawale, S. S., Paietta, J. V., Marzluf, G. A. A new, rapid and efficient transformation procedure for Neurospora. Current Genetics. 8, 77-79 (1984).
  8. Sayari, M., Van Der Nest, M. A., Steenkamp, E. T., Adegeye, O. O., Marincowitz, S. Agrobacterium-mediated transformation of Ceratocystis albifundus. Microbiological Research. 226, 55-64 (2019).
  9. Meyer, V. Genetic engineering of filamentous fungi- Progress, obstacles and future trends. Biotechnology Advances. 26, 177-185 (2008).
  10. You, B. J., Lee, M. H., Chung, K. R. Gene-specific disruption in the filamentous fungus Cercospora nicotianae using a split-marker approach. Archives of Microbiology. 191, 615-622 (2009).
  11. Gravelat, F. N., Askew, D. S., Sheppard, D. C. Targeted gene deletion in Aspergillus fumigatus using the hygromycin-resistance split-marker approach. Host-Fungus Interactions. 845, 119-130 (2012).
  12. Wang, Y., Diguistini, S., Bohlmann, J., Breuil, C. Agrobacterium-meditated gene disruption using split-marker in Grosmannia clavigera, a mountain pine beetle associated pathogen. Current Genetics. 56, 297-307 (2010).
  13. Wood, A. J., et al. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs. Science. 333, 307 (2011).
  14. Mahfouz, M. M., Piatek, A., Neal, C. Genome engineering via TALENs and CRISPR/Cas9 systems: Challenges and perspectives. Plant Biotechnology. 12, 1006-1014 (2014).
  15. Wang, H., La Russa, M., Qi, L. S. CRISPR/Cas9 in genome editing and beyond. Annual Review of Biochemistry. 85 (1), 227-264 (2016).
  16. Arazoe, T., et al. Tailor-made TALEN system for highly efficient targeted gene replacement in the rice blast fungus. Biotechnology and Bioengineering. 112 (7), 1335-1342 (2015).
  17. Liu, R., Chen, L., Jiang, Y., Zhou, Z., Zou, G. Efficient genome editing in filamentous fungus Trichoderma reesei using the CRISPR/Cas9 system. Cell Discovery. 1, 1-11 (2015).
  18. Jinek, M., Chylinski, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J. A., Charpentier, E. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-822 (2012).
  19. Gasiunas, G., Barrangou, R., Horvath, P., Siksnys, V. Cas9-crRNA ribonucleoprotein complex mediates specific DNA cleavage for adaptive immunity in bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (39), 2579-2586 (2012).
  20. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Cell. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  21. Wilson, A. M., Wilken, P. M., Van Der Nest, M. A., Wing, M. J., Wing, B. D. The novel Huntiella omanensis mating gene, MAT1-2-7, is essential for ascomatal maturation. Fungal Genetics and Biology. 137, 103335 (2020).
  22. Miao, J., et al. Characterization of an N-terminal non-core domain of RAG1 gene disrupted Syrian Hamster model generated by CRISPR Cas9. Viruses. 10 (243), 10050243 (2018).
  23. Roberts, B., et al. Systematic gene tagging using CRISPR/Cas9 in human stem cells to illuminate cell organization. Molecular Biology of the Cell. 28 (21), 2854-2874 (2016).
  24. Schneider, S., Kirchner, M., Kirchner, M., Schneider, S. CRISPR-Cas: From the bacterial adaptive immune system to a versatile tool for genome engineering. Angewandte Chemie International Edition. 54 (46), 13508-13514 (2015).
  25. Nødvig, C. S., Nielsen, J. B., Kogle, M. E., Mortensen, U. H. A CRISPR-Cas9 system for genetic engineering of filamentous fungi. PLoS ONE. 10 (7), 1-18 (2015).
  26. Wang, Q., Cobine, P. A., Coleman, J. J. Efficient genome editing in Fusarium oxysporum based on CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein complexes. Fungal Genetics and Biology. 117, 21-29 (2018).
  27. Nagy, G., et al. Development of a plasmid free CRISPR-Cas9 system for the genetic modification of Mucor circinelloides. Scientific Reports. 7 (16800), 1-10 (2017).
  28. Al-Subhi, A. M., Al-Adawi, A. O., Van Wyk, M., Deadman, M. L., Wingfield, M. J. Ceratocystis omanensis, a new species from diseased mango trees in Oman. Mycological Research. 110 (2), 237-245 (2006).
  29. Wilson, A. M., van der Nest, M. A., Wilken, P. M., Wingfield, M. J., Wingfield, B. D. Pheromone expression reveals putative mechanism of unisexuality in a saprobic ascomycete fungus. PLoS ONE. 13 (3), 0192517 (2018).
  30. van der Nest, M. A., et al. Draft genomes of Amanita jacksonii, Ceratocystis albifundus, Fusarium circinatum, Huntiella omanensis, Leptographium procerum, Rutstroemia sydowiana, and Sclerotinia echinophila. IMA Fungus. 5 (2), 472-485 (2014).
  31. Wilson, A. M., Godlonton, T., van der Nest, M. A., Wilken, P. M., Wingfield, M. J., Wingfield, B. D. Unisexual reproduction in Huntiella moniliformis. Fungal Genetics and Biology. 80, 1-9 (2015).
  32. Sambrook, J., Green, M. . Molecular cloning: A laboratory manual. , (2012).
  33. Ramamoorthy, V., Govindaraj, L., Dhanasekaran, M., Vetrivel, S., Kumar, K. K., Ebenezar, E. Combination of driselase and lysing enzyme in one molar potassium chloride is effective for the production of protoplasts from germinated conidia of Fusarium verticillioides. Journal of Microbiological Methods. , (2015).
  34. Lin, C., Yang, S. L., Wang, N., Chung, K. The FUS3 MAPK signaling pathway of the citrus pathogen Alternaria alternata functions independently or cooperatively with the fungal redox-responsive AP1 regulator for diverse developmental, physiological and pathogenic processes. Fungal Genetics and Biology. 47 (4), 381-391 (2010).
  35. Lin, C., Chung, K. Specialized and shared functions of the histidine kinase- and HOG1 MAP kinase-mediated signaling pathways in Alternaria alternata, a filamentous fungal pathogen of citrus. Fungal Genetics and Biology. 47 (10), 818-827 (2010).
  36. Choquer, M., et al. The CTB1 gene encoding a fungal polyketide synthase is required for cercosporin biosynthesis and fungal virulence of Cercospora nicotianae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 18 (5), 468-476 (2005).
  37. Pohl, C., Kiel, J. A. K. W., Driessen, A. J. M., Bovenberg, R. A. L., Nygård, Y. CRISPR/Cas9 based genome editing of Penicillium chrysogenum. ACS Synthetic Biology. 5 (7), 754-764 (2016).
  38. van der Nest, M. A. M. A., et al. Draft genome sequences of Diplodia sapinea, Ceratocystis manginecans and Ceratocystis moniliformis. IMA Fungus. 5 (1), 135-140 (2014).
  39. Wingfield, B. D., et al. Draft genome sequences for Ceratocystis fagacearum, C. harringtonii, Grosmannia penicillata, and Huntiella bhutanensis. IMA Fungus. 7 (2), 317-323 (2016).
  40. Fourie, A., Van Der Nest, M. A., De Vos, L., Wingfield, M. J., Wingfield, B. D., Barnes, I. QTL mapping of mycelial growth and aggressiveness to distinct hosts in Ceratocystis pathogens. Fungal Genetics and Biology. 131, 103242 (2019).
  41. Lee, D. H., Roux, J., Wingfield, B. D., Wingfield, M. J. Variation in growth rates and aggressiveness of naturally occurring self-fertile and self-sterile isolates of the wilt pathogen Ceratocystis albifundus. Plant Pathology. 64 (5), 1103-1109 (2015).

Tags

CRISPR-Cas9Genome EditingHuntiella OmanensisFilamentous AscomyceteNon-model FungiConidiaGermlingsProtoplastsTransformationRibonucleoproteinDonor DNAPTC Solution

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Wilson, A. M., Wingfield, B. D. CRISPR-Cas9-Mediated Genome Editing in the Filamentous Ascomycete Huntiella omanensis. J. Vis. Exp. (160), e61367, doi:10.3791/61367 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image