Här presenterar vi ett protokoll för att främja transgenens integration och produktion av grundaren transgena möss med hög effekt genom en enkel injektion av en lentiviral vektor i det perivitelline utrymmet i en befruktade äggcellen.
För nästan 40 år representerar pronukleär DNA injektion standarden metod att generera transgena möss med slumpmässiga integration av transgener. Ett sådant rutinmässigt förfarande används allmänt i hela världen och dess huvudsakliga begränsning bosatt i fattiga effekten av transgenens integration, vilket resulterar i en låg avkastning av grundaren djur. Endast några procent av djur födda efter implantation av injicerade befruktade oocyter har integrerat transgenens. Däremot lentiviral vektorer är kraftfulla verktyg för integrativ genöverföring och deras användning till transduce befruktade oocyter tillåter mycket effektiv produktion av grundaren transgena möss med en genomsnittlig avkastning över 70%. Dessutom någon mus stam kan användas för att producera transgena djur och penetrans av transgenens uttryck är extremt hög, över 80% med lentiviral medierad genmodifiering jämfört DNA Mikroskop. Storleken på den DNA-fragment som kan vara last av lentiviral vektorn är begränsad till 10 kb och representerar den största begränsningen av denna metod. Använda en enkel och lätt att utföra injektionsproceduren under den zona pellucida befruktade oocyter, kan mer än 50 grundare djur produceras i en enda session av Mikroskop. En sådan metod är mycket anpassade till utföra, direkt i grundare djur, snabb vinst och förlust av funktion studier eller till skärmen genomisk DNA-regioner för sin förmåga att styra och reglera gen uttryck i vivo.
Det banbrytande arbetet av Gordon et al. 1980 visade att efter implantation i pseudopregnant möss, en plasmid DNA injektion i den manliga pronuclei befruktade oocyter kan ge produktion av transgena djur som integrerade de plasmid DNA1. Demonstrationen att transgena däggdjur kan genereras hade en enorm inverkan på global life science, öppnar vägen till nya fält av forskning både för grundläggande vetenskaper och translationell biomedicinsk vetenskap. I de senaste fyra årtiondena blivit DNA Mikroskop en rutinmässig praxis. Trots ett enormt antal transgena möss har producerats, standardmetoden är inte fullt användbara för alla mus stammar och kräver tidskrävande backcrosses2,3. Dess tillämpning på andra arter förblir utmanande4 och övergripande transgenens integration avkastningen är begränsad till några procent av födda djur5. Dessutom representerar effekten av transgenens integration den begränsande faktorn som förklarar dålig totala avkastningen av pronukleär DNA injektion. I detta avseende integrativ virala vektorer är de mest effektiva verktygen till last och integrera transgener och därmed kunde ge nya sätt att avsevärt öka integrationen avkastning, den enda begränsningen är att transgenens storlek inte får överstiga 10 kb6 .
Lentiviral vektorer pseudo skrivit med omsluta proteinet av vesikulär stomatit Virus (VSV) är pantropic och mycket integrativ gen transfer verktyg och kan användas för att transduce befruktade oocyter7. Den zona pellucida kring oocyterna är en naturlig virus barriär och måste vidarebefordras för att tillåta transduktion med lentiviral vektorer. Transgena djur har genererats av transducing befruktade oocyter efter mikro-borrning eller borttagning av zona pellucida8,9. Injektion under de zona pellucida i perivitelline utrymmet tycks dock vara det enklaste sättet att transduce de befruktade äggen som inledningsvis beskrivs av Lois och kollegor7.
Perivitelline injektion av lentiviral vektorer tillåter hög avkastning i produktionen av transgena djur som är över 70% av födda djur. Sådan avkastning är över 10 gånger högre än den bästa avkastningen som kan uppnås med hjälp av standard pronuclei DNA injektion7,10,11. I detta sammanhang kommer att en enda session injektioner generera minst 50 transgena grundarna (F0). Det stora antalet grundarna är därför kompatibla med fenotypning av transgenens effekten direkt utförs på F0 möss utan att behöva generera transgena möss rader. Denna fördel kan för snabb screening av transgenens effekten och är speciellt anpassade att utföra i vivo vinst och förlust av funktion studier inom veckor. Dessutom kan regulatoriska DNA-element också snabbt kontrolleras för att mappa smakförstärkare och DNA motiv bunden av transkription faktorer11,12. Med pronukleär injektioner integrera transgener oftast multipla kopior i en unik locus. Med lentiviral vektorer sker integration i flera loci som ett enda exemplar per locus10,13. Multiplicityen av integrerade loci är därför sannolikt associerade till de mycket höga uttryck penetrans hos transgena grundarna, vilket gör den nya genererade modellen mer robust.
Ännu viktigare, när du använder pronukleär injektion av DNA, krävs visualisering av pronuclei under förfarandet absolut. Denna tekniska begränsning förhindrar användningen av befruktade oocyter med ursprung från en stor mängd mus stammar. Därför produktionen av transgena modell i en specifik stam för vilka pronuclei är osynliga kräver produktion av djur i en tillåtande stam följt av minst 10 på varandra följande backcrosses att överföra transgenens i önskad musen stam. Med lentiviral vector injektionerna, perivitelline utrymme är alltid synliga och injektionen kräver inte mycket specifika färdigheter. Exempel har nicka/SCID transgena möss som inte är lämpliga för pronuclei injektion erhållits med viral vektor injektioner14.
Här presenteras ett omfattande protokoll för att tillåta enkel produktion av transgena möss med lentiviral vector injektioner i perivitelline rymden av ett embryo med en cell i scenen. Transgenens uttryck kontrolleras med antingen allestädes närvarande eller cell specifika initiativtagare beskrivs i detalj.
PTrip ΔU3 lentiviral ryggraden användes i denna studie15. Denna vektor kan producera replikering defekta lentiviral vektorer där sekvensen U3 delvis har raderats för att ta bort U3 arrangören aktivitet och generera en egen inactivating vektor (SIN)16. Lentiviral vector bestånd producerades av övergående transfection HEK-293T celler med p8.91 inkapsling plasmid (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, pHCMV-G kodning av vesikulär stomatit virus (VSV) glykoprotein-G17, och den pTRIP ΔU3 rekombinant vektor. Förfarandet för detaljerad produktion tillhandahålls som kompletterande metoder.
Produktionen av hög titer lentiviral vector lager utförs på biosäkerhet nivå II villkor (BSL-2). Detta är sant för de flesta transgener utom onkogener som måste produceras i BSL-3. Produktion i BSL-2 villkor i de flesta fall är därför tillräcklig. Dessutom, kopplas användning och produktion oftast för de flesta nationella tillsynsmyndigheter som arbetar med genetiskt modifierade organismer (GMO). Begränsade mängder av replikering inkompetenta synd lentiviral vektorer (under 2 µg p24 kapsid protein) kan användas under BSL-1 förhållanden som beskrivs av byråns franska GMO i samförstånd med Europeiska unionens rekommendationer.
Perivitelline injektion av lentiviral vektorer i befruktade oocyter beskrivs här resulterat i produktionen av transgena embryon som gav mer än 70% av transgena embryon i förhållande till totala antalet insamlade embryon. Detta resultat överensstämmer med tidigare rapporter och exemplifierar specificiteten av förfarande2,7,10,11,12. När man jämför all…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Magali Dumont och Rolando Meloni för kritisk läsning av manuskriptet och iVector och Phenoparc ICM kärnor för tekniskt bistånd i lentiviral vector produktion och djur bostäder respektive. Detta arbete fick stöd av Institut Hospitalo-Universitaire de neurovetenskap Translationnelles de Paris, IHU-A-ICM, Investissements pris ANR-10-IAIHU-06. P.R. fick finansiering för den förening de Langue françaisen pour l’Etude du Diabète et des Maladies Métaboliques (ALFEDIAM) och en gemensam JDRF INSERM bevilja.
PMSG 50UI | Sigma | G4527 | |
hCG 5000UI | Sigma | CG5-1VL | |
NaCl | Sigma | 7982 | |
100 mm petri dish | Dutsher | 353003 | |
4 wells Nunc dish | Dutsher | 56469 | IVF dish |
M2 medium | Sigma | M7167 | |
M16 medium | Sigma | M7292 | |
0,22 µm Syringe filter | Dutsher | 146611 | |
Hyaluronidase Enzyme 30mg | Sigma | H4272 | mouse embryo tested |
Insulin serynge | VWR | 613-3867 | Terumo Myjector |
Curved forceps | Moria | 2183 | |
Curved scissors | Moria | MC26 | |
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
Borosilicate glass capillaries | Harvard apparatus | GC 100-10 | |
Horizontal micropipette puller | Narishige | PN-30 | |
Microforge | Narishige | MF-900 | |
Inverted microscope | Nikon | Transferman NK2 5188 | Hoffman modulation contrast illumination is required |
Micromanipulator | Eppendorf | Celltram air | |
Controler of holding pipet | Eppendorf | Femtojet | |
Mineral oil | Sigma | M8410 | mouse embryo tested |
Microinjector | Eppendorf | Femtojet | Can be used to inject DNA or viral vectors |
Dumont # 5 forceps | Moria | MC 40 | |
vannas micro scissors | Moria | 9600 | |
Isoflurane | centravet | ISO005 | ISO-VET 100% 250ml |
ocrygel | centravet | OCR002 | |
Povidone iodure | centravet | VET001 | vetedine 120ml |
Buprenorphine | centravet | BUP002 | Buprecare 0,3Mg/ml 10ml |
Tris-HCl | Sigma | T5941 | Trizma hydrochloride |
EDTA | Sigma | E9884 | |
SDS | Sigma | 436143 | |
NaCl | Sigma | S7653 | powder |
proteinase K | Sigma | P2308 | |
oneTaq kit | NEB | M0480L | |
Primers | Eurogentec | ||
Strip of 8 PCR tube | 4titude | 4ti-0781 | |
96 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4375786 | Veriti |
Genomic DNA mini kit | invitrogen | K1820-02 | |
Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000C | |
qPCR Master mix | Roche | 4887352001 | SYBR Green |
Multiwell plate 384 | Roche | 5217555001 | |
qPCR instrument 384 well | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 |