Summary

レンチ ウイルス媒介トランスジェニック マウスの生産: シンプルで高効率な創設者の直接の研究法

Published: October 07, 2018
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Summary

ここでは、受精卵母細胞の囲卵腔のレンチウイルスベクターの単純な注射によって transgene の統合および創設者トランスジェニック マウスに高効率の生産を促進するためにプロトコルを提案する.

Abstract

ほぼ 40 年間は、前核 DNA 注入はトランスジェニック マウスに遺伝子のランダムな統合を生成する標準的な方法を表します。このようなルーチンの手順が世界中で広く利用されて、transgene の統合の創設者動物の低収量の結果の悪い効果の主な制限が存在します。注入された受精卵の着床後に生まれた動物の数パーセントしか遺伝子を統合しています。対照的に、レンチウイルスベクターは統合的な遺伝子導入のための強力なツールをヘッジホッグ受精卵の使用により、創設者の高効率生産 70% 以上の平均収量を持つトランスジェニック マウス。さらに、遺伝子組換え動物を生成する任意のマウスの緊張を使用ことができますおよび遺伝子発現の浸透度がきわめて高く、DNA マイクロインジェクションに比べてレンチウイルスベクターを介した遺伝子導入で 80% 以上。レンチウイルスベクターによって貨物をすることができます DNA のフラグメントのサイズは 10 kb に制限されている、このメソッドの主要な制限を表します。シンプルで簡単に受精卵の透明帯の下に注入の手順を実行を使用して、50 以上の創設者動物はマイクロインジェクションの単一のセッションで生成できます。このようなメソッドは、創設者動物、急速な利得と損失関数学または画面ゲノム DNA 領域の制御および遺伝子発現生体内で調整する機能のために直接実行する高い適応です。

Introduction

1980 年にゴードンの先駆的な仕事を示した偽妊娠マウスに着床した受精卵前核の男性のにプラスミド DNA 注入は統合トランスジェニック動物の生産をもたらすことができる、プラスミド DNA の1。トランスジェニック哺乳類が生成されることを実証では、両方の基礎科学と医療薬学研究の新規分野への道を開く、ライフ サイエンスの世界に大きな影響を与えた。過去 4 年の間、DNA マイクロインジェクション ルーチンの練習となっています。トランスジェニック マウスの膨大な数が生産されている、標準的な方法すべてのマウス系統の完全に使用可能ではないと時間のかかる戻交配2,3が必要です。他の種への応用のまま挑戦4全体の transgene の統合収量生まれた動物5の数の割合に制限されます。また、transgene の統合の効果は、前核 DNA インジェクションの貧しい全体的な利回りを説明する制限要因を表します。この点で、統合ウイルスベクター貨物に最も効率的なツールし遺伝子を統合し、こうして大幅統合収穫、遺伝子サイズ 10 kb6 を超えることのできないという唯一の制限を増加する新しい手段を提供できます。.

レンチウイルスベクター擬似エンベロープ蛋白の水疱性口内炎ウイルス (VSV) 型指定された pantropic および高度統合遺伝子伝達ツール、受精卵7を変換する使用ことができます。卵子の周囲の透明帯自然ウイルス障害とレンチ ウイルスのベクトルを伝達できるように渡される必要があります。トランスジェニック動物はマイクロ ドリルや透明帯8,9の削除後変換受精卵母細胞によって生成されています。ただし、囲卵腔に透明帯の下に注入はロイスと同僚の7で最初に定義されている受精卵を変換する最も簡単な方法のように見えます。

レンチウイルスベクターの囲卵腔注入では、生まれた動物の 70% 以上は、トランスジェニック動物の生産に高収率をことができます。このような利回りは標準的な前核DNA 注入7,10,11を使用して達成することができます最高の収量より 10 倍以上高い。この文脈では、注射の 1 つのセッションは少なくとも 50 トランスジェニック創設者 (F0) を生成します。創設者の多数は、したがって、トランスジェニック マウスの行を生成することがなく F0 マウスに対して直接遺伝子効果の表現と互換性があります。この利点は transgene 効果の迅速なスクリーニングを可能、週間以内に体内の利得と損失関数の研究を実行に特化。また、エンハンサーと転写因子11,12によってバインドされている DNA モチーフをマップする調節 DNA 配列することができます急速に上映されるも。前核の注射で遺伝子は通常ユニークな軌跡の複数コピーを統合します。レンチ ウイルスのベクトル統合は軌跡10,13あたり単一コピーとして多遺伝子座で発生します。したがって、統合遺伝子座の多様性より堅牢な新しい生成モデルを作るトランスジェニック創設者にみられる非常に高い式浸透に関連付けられている可能性が最も高いです。

重要なは、DNA の前核の注入を使用して、プロシージャの間に前核の可視化は絶対に必要があります。この技術的な制限は、多種多様なマウス系統から受精卵の使用を防止します。したがって、特定のトランスジェニック モデルの生産目的のマウスの遺伝子を転送する少なくとも 10 連続戻交配続いて寛容ひずみにおける動物の生産を要求するどの前核が表示されないためにのひずみひずみ。レンチウイルスベクター注射囲卵腔が表示常に、注射は非常に特定のスキルを必要はありません。例として、前核注入に適さない NOD/SCID トランスジェニック マウス ウイルスベクター注射14得られています。

ここでは、包括的なプロトコルが 1 つのセル段階の胚の囲卵腔注射レンチウイルスベクターを用いた遺伝子改変マウスの簡単な生産を許可するように表示されます。遺伝子発現のいずれかで制御ユビキタスまたはセル特定のプロモーターで詳しく説明します。

PTrip ΔU3 レンチ ウイルスのバックボーンは、この研究は15で使用されました。このベクター U3 シーケンスを U3 プロモーター活性を外し、自己不活化ベクトル (罪)16を生成する部分的に削除されているレプリケーション欠陥レンチウイルスベクターを作り出すことができます。P8.91 カプセル化プラスミド (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6、水胞性口炎ウイルス (VSV) 糖 G17、および pTRIP ΔU3 のエンコーディング pHCMV G と HEK 293 t 細胞のトランスフェクションによって生産されたレンチウイルスベクター株式組換えのベクトル。詳細な運用手順は、補足的なメソッドとして提供されます。

高価レンチウイルスベクターの在庫の生産、バイオ セーフティ レベル II 条件 (BSL-2) の下で実行されます。これは BSL 3 で生産されなければならない遺伝子を除いてほとんど transgenes に当てはまります。したがって、ほとんどの場合のための BSL 2 条件での生産は十分です。さらに、使用と生産は、遺伝子組み換え作物 (GMO) を扱うほとんどの国の規制当局の切断されます通常。(P24 キャプシド蛋白質の 2 μ g) の下に複製無能な罪レンチウイルスベクターの限られた量は、欧州連合推奨事項に従ってフランス GMO 代理店によって前述の BSL 1 条件下で使用できます。

Protocol

動物の仕事を含むすべての手順は、倫理的な承認を受けたし、フランス研究番号 APAFIS #5094 20 16032916219274 v6 の下教育省と 05311.02 によって承認されています。PHENOPARC は、フランス農水省認定番号 B75 の下で認定されている ICM 動物施設 13 19。総合的なプロトコルでは、図1 にまとめられている正確な時間枠内で各手順を実行する必要があります。 1. 動物…

Representative Results

トランスジェニック動物は、ここで提示されたプロトコルを使用して生成されました。代表の結果両方のユビキタスと細胞タイプ特定の遺伝子発現を示します。 導入遺伝子の発現 ユビキタスのプロモーターは、持続的かつ効率的な方法で遺伝子を表現する基本的?…

Discussion

レンチウイルスベクターここで説明した受精卵母細胞の囲卵腔注入は、収集された胚の合計数を基準にして遺伝子胚の 70% 以上が得られた形質転換の胚の生産で起因しました。この結果、以前のレポートに一貫した手順2,7,1011,12の特異性を例証します。表 1

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

レンチ ウイルスのベクトル生産および動物それぞれ住宅での技術支援の原稿と iVector Phenoparc ICM コアの重要な読書、マガリ ・ デュモンとローランド メローニに感謝します。この作品は、Institut Hospitalo ユニヴェルシテール ・ デ ・神経科学 Translationnelles デによって支えられたパリ、Investissements d’Avenir ANR-10-IAIHU-06 IHU-A-ICM。広報協会・ デ ・ ラング ・ フランセーズのための資金を受け取った注ぐ流動デュ Diabète et des 病気 Métaboliques (ALFEDIAM) と共同 JDRF INSERM 付与/。

Materials

PMSG 50UI Sigma G4527
hCG 5000UI Sigma CG5-1VL
NaCl Sigma 7982
100 mm petri dish Dutsher 353003
4 wells Nunc dish Dutsher 56469 IVF dish
M2 medium Sigma M7167
M16 medium Sigma M7292
0,22 µm Syringe filter Dutsher 146611
Hyaluronidase Enzyme 30mg Sigma H4272 mouse embryo tested
Insulin serynge VWR 613-3867 Terumo Myjector
Curved forceps Moria 2183
Curved scissors Moria MC26
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma A5177-5EA
Borosilicate glass capillaries Harvard apparatus GC 100-10
Horizontal micropipette puller Narishige PN-30
Microforge Narishige MF-900
Inverted microscope Nikon Transferman NK2 5188 Hoffman modulation contrast illumination is required
Micromanipulator Eppendorf Celltram air
Controler of holding pipet Eppendorf Femtojet
Mineral oil Sigma M8410 mouse embryo tested
Microinjector Eppendorf Femtojet Can be used to inject DNA or viral vectors
Dumont # 5 forceps Moria MC 40
vannas micro scissors Moria 9600
Isoflurane centravet ISO005 ISO-VET 100% 250ml
ocrygel centravet OCR002
Povidone iodure centravet VET001 vetedine 120ml
Buprenorphine centravet BUP002 Buprecare 0,3Mg/ml 10ml
Tris-HCl Sigma T5941 Trizma hydrochloride
EDTA Sigma E9884
SDS Sigma 436143
NaCl Sigma S7653 powder
proteinase K Sigma P2308 
oneTaq kit NEB M0480L
Primers Eurogentec
Strip of 8 PCR tube 4titude 4ti-0781
96 well thermal cycler Applied Biosystems 4375786 Veriti
Genomic DNA mini kit invitrogen K1820-02
Nanodrop 2000 Thermo Scientific ND-2000C 
qPCR Master mix Roche 4887352001 SYBR Green 
Multiwell plate 384 Roche 5217555001
qPCR instrument 384 well Roche 5015243001 LightCycler 480

Referências

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Dussaud, S., Pardanaud-Glavieux, C., Sauty-Colace, C., Ravassard, P. Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders. J. Vis. Exp. (140), e57609, doi:10.3791/57609 (2018).

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