Particulas de Lentivirus mediada produção de camundongos transgênicos: um método simples e altamente eficiente para estudo direto dos fundadores

O trabalho pioneiro de Gordon et al . em 1980 mostrou que, após a implantação em ratos pseudopregnant, a injeção de DNA de plasmídeo para o sexo masculino pró-núcleos de oócitos fertilizados pode render a produção de animais transgénicos que integrado a Plasmideo DNA¹. A demonstração de que os mamíferos transgênicos podem ser gerados teve um enorme impacto sobre ciências da vida globais, abrindo o caminho para novos campos de pesquisa, tanto para as ciências básicas e ciências biomédicas translacionais. Nas últimas quatro décadas, a microinjeção de DNA tornou-se uma prática de rotina. Embora um enorme número de ratos transgênicos foram produzido, o método padrão não é totalmente utilizável para todas as estirpes de rato e requer demorado retrocruzamentos^2,3. Sua aplicação a outras espécies permanece desafiador⁴ e o rendimento global de integração do transgene é limitado a alguns porcentagem de animais nascido⁵. Além disso, a eficácia da integração do transgene representa o fator limitante que explica o pobre rendimento total da injeção de DNA pró-nuclear. A este respeito, Integrativa vetores virais são as ferramentas mais eficientes para carga e integram transgenes em assim poderiam fornecer novos meios para aumentar significativamente o rendimento de integração, a única limitação é que o tamanho do transgene que não pode exceder 10 kb⁶ .

Particulas de Lentivirus vetores pseudo digitados com a proteína do envelope do vírus da estomatite Vesicular (VSV) são ferramentas de transferência do gene pantropic e altamente integrativa e podem ser usados para transduce oócitos fertilizados⁷. A zona pelúcida envolvendo oócitos é uma barreira natural de vírus e precisa ser passado para permitir a transdução com os vetores de Lentivirus. Animais transgénicos foram gerados pelo transducing oócitos fertilizados após micro perfuração ou remoção da zona pelúcida^8,9. No entanto, injeção sob a zona pelúcida no espaço perivitelline parece ser o método mais simples para transduce os ovos fertilizados como inicialmente descrito por Lois e colegas⁷.

A injeção de perivitelline de Lentivirus vetores permite altos rendimentos na produção de animais transgénicos que estão acima de 70% dos animais nascidos. Tal rendimento é mais 10-fold maior do que o melhor rendimento que pode ser conseguido usando padrão pró-núcleos DNA injeção^7,10,11. Neste contexto, uma única sessão de injeções irá gerar pelo menos 50 fundadores transgénicos (F0). O grande número de fundadores é, portanto, compatível com fenotipagem do transgene efeito diretamente realizada em F0 ratos sem a necessidade de gerar linhas de rato transgénico. Esta vantagem permite a seleção rápida do efeito do transgene e é especificamente adaptada para executar na vivo ganho e perda de estudos de função dentro de semanas. Além disso, elementos reguladores do DNA podem também ser rapidamente analisados para mapear enhancers e motivos de DNA vinculados por fatores de transcrição^11,12. Com injeções pró-nuclear, transgenes integrar normalmente como várias cópias em um único locus. Com vetores de Lentivirus, integração ocorre em múltiplos loci como uma única cópia por locus^10,13. Portanto, a multiplicidade dos loci integrado é provavelmente associada a penetrância de expressão muito alta observada em fundadores transgénicos, que faz com que o novo modelo gerado mais robusto.

Importante, quando usando injeção pró-nuclear do ADN, visualização dos pró-núcleos durante o procedimento é absolutamente necessária. Essa limitação técnica impede o uso de oócitos fertilizados, provenientes de uma grande variedade de estirpes de rato. Portanto, a produção de um modelo transgênico em uma determinada tensão para qual pró-núcleos são invisíveis exige a produção de animais em uma cepa permissiva, seguido pelo menos 10 sucessivos retrocruzamentos para transferir o transgene no mouse desejado estirpe. Com as injeções de vetor de Lentivirus, perivitelline espaço é sempre visível e a injeção não requer habilidades altamente específicas. Por exemplo, ratos transgénicos de NOD/SCID que não são apropriados para injeção de pró-núcleos foram obtidos com o vector viral injeções¹⁴.

Aqui, apresenta-se um protocolo abrangente para permitir que a simples produção de camundongos transgênicos usando injeções de vetor de Lentivirus no espaço perivitelline de um embrião de fase de uma célula. Expressão do transgene controlada com qualquer onipresente ou promotores específicos de célula é descrito em detalhes.

O backbone de Lentivirus de ΔU3 de pTrip foi usado no presente estudo¹⁵. Esse vetor permite produzir vetores de Lentivirus defeituoso replicação, no qual a sequência de U3 foi parcialmente excluída para remover a atividade de promotor U3 e gerar um self inactivating vector (SIN)¹⁶. Estoques de vetor de Lentivirus foram produzidos por transfecção transiente de células HEK-293T com o p8.91 encapsulamento do plasmídeo (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)⁶, a codificação a estomatite vesicular (VSV) de vírus glicoproteína-G¹⁷e o ΔU3 de pTRIP pHCMV-G vector recombinante. O processo de produção detalhado é fornecido como métodos complementares.

Produção das unidades populacionais de vetor de Lentivirus de alta concentração é realizada em condições de biossegurança nível II (BSL-2). Isto é verdade para a maioria dos transgenes exceto oncogenes que têm de ser produzidos em BSL-3. Portanto, a produção em condições de BSL-2 para a maioria dos casos é suficiente. Além disso, o uso e a produção são geralmente desconectados para a maioria das agências reguladoras nacionais, lidando com organismos geneticamente modificados (OGM). Quantidades limitadas de replicação incompetente SIN Lentivirus vetores (abaixo de 2 µ g da proteína do capsídeo p24) podem ser usadas sob condições de BSL-1 conforme descrito pela agência francesa OGM, de acordo com as recomendações da União Europeia.