慢病毒载体介导的转基因小鼠生产: 一种简单高效的创始人直接研究方法

戈登等在1980年的开创性工作表明, 在 pseudopregnant 小鼠植入后, 将质粒 DNA 注入受精卵母细胞的雄性pronuclei , 可以产生转基因动物的生产, 整合了质粒 DNA¹。转基因哺乳动物的形成对全球生命科学产生了巨大的影响, 为基础科学和转化生物医学科学开辟了新的研究领域。在过去的四年里, DNA 微注射已经成为一种常规的做法。虽然已经生产了大量的转基因小鼠, 但标准方法对所有的老鼠菌株都没有充分的用处, 需要耗费时间 backcrosses^2,3。它对其他物种的应用仍然具有挑战性⁴ , 转基因综合产量仅限于出生动物的少数比例⁵。此外, 转基因整合的功效是解释显微 DNA 注射液整体产量差的限制因素。在这方面, 集成的病毒载体是最有效的工具, 以货物和集成转基因, 从而可以提供新的手段, 以显著提高整合产量, 唯一的限制是, 转基因大小不能超过 10 kb⁶.

慢病毒载体载体伪类型与囊性口炎病毒 (VSV) 包络蛋白是以泛热带和高度整合的基因转移工具, 可用于传感器受精卵母细胞⁷。卵母细胞周围的透明透明是一种天然的病毒屏障, 需要通过它来允许慢病毒载体载体的转导。转基因动物是由传感受精卵母细胞在微钻孔或清除透明透明^8,9产生的。然而, 在 perivitelline 空间的透明透明下注射似乎是最简单的方法, 传感器的受精卵, 最初描述的露易丝和同事⁷。

perivitelline 注射慢病毒载体载体, 可使转基因动物的产量高出70% 以上的出生动物。这种产量超过10倍以上的最佳产量, 可以达到使用标准pronuclei DNA 注射^7,10,11。在这种情况下, 单一的注射疗程将产生至少50个转基因创始人 (F0)。因此, 大量的创始人是兼容分型的转基因效果直接执行对 F0 小鼠不需要产生转基因鼠标线。这种优势允许快速筛选的转基因效果, 并特别适应于执行在体内增益和丧失功能研究在几周之内。此外, 调控 DNA 元素也可以快速筛选, 以绘制促进剂和 DNA 图案绑定的转录因子^11,12。随着显微注射, 转基因通常集成为多个副本在一个独特的轨迹。使用慢病毒载体向量, 集成在多个位点中作为每个轨迹^10、13的单个拷贝出现。因此, 综合基因座的多样性很可能与转基因创始人所观察到的极高表达显性有关, 这使得新生成的模型更加健壮。

重要的是, 当使用显微注射 DNA 时, pronuclei过程中的可视化是绝对必要的。这一技术限制防止了受精卵母细胞的使用来自于大量的小鼠菌株。因此, 在特定菌株中生产一种pronuclei是不可见的转基因模型, 需要在允许的应变下生产动物, 随后至少有10个连续 backcrosses 在所需的小鼠中转移转基因。应变。通过慢病毒载体矢量注射, perivitelline 空间始终可见, 注射不需要高度特异的技能。以¹⁴的病毒载体注射液为例, 对不适合pronuclei注射液的转基因小鼠进行了点头/免疫治疗。

在这里, 提出了一个全面的协议, 以允许简单生产的转基因小鼠使用慢病毒载体载体注射在 perivitelline 空间的一个细胞阶段胚胎。本文详细介绍了用无处不在或细胞特异促进剂控制的转基因表达。

pTrip ΔU3 慢病毒载体骨干在本研究中使用¹⁵。这个向量允许产生复制缺陷的慢病毒载体向量, 其中 U3 序列被部分删除以移除 U3 启动子活动并生成自失活向量 (SIN)¹⁶。慢病毒载体载体是通过对 HEK-293T 细胞的瞬态转染与 p8.91 封装质粒 (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)⁶, pHCMV g 编码的水泡性口炎病毒 (VSV) 糖蛋白-g¹⁷, pTRIP ΔU3重组载体。详细的生产过程作为补充方法提供。

在生物安全二级条件下 (BSL-2) 进行高效价慢病毒载体载体的生产。对于大多数转基因来说, 这是正确的, 除了必须在 BSL-3 中产生的癌基因。因此, 大多数情况下, 生产 BSL-2 条件是足够的。此外, 大多数国家管理机构处理转基因生物 (转基因) 的使用和生产通常是脱节的。有限数量的复制无能的罪慢病毒载体载体 (低于2µg 的 p24 衣壳蛋白) 可在 BSL-1 条件下使用, 如法国转基因机构与欧洲联盟的建议所述。