Questo articolo viene illustrato come del hindbrain embrionali del mouse può essere utilizzato come modello per lo studio della neurogenesi inerente allo sviluppo sia dell’intero organo e tessuto sezione preparati.
Il proencefalo di embrione di topo è il sistema più comunemente impiegato per lo studio della neurogenesi dei mammiferi durante lo sviluppo. Tuttavia, il neuroepithelium altamente piegato del forebrain non è assoggettabile a wholemount analisi per esaminare i modelli di organo-wide neurogenesi. Inoltre, i meccanismi della neurogenesi del forebrain la definizione non sono necessariamente predittivi della neurogenesi in altre parti del cervello; ad esempio, a causa della presenza dei sottotipi specifici del forebrain progenitrici. Il hindbrain del mouse fornisce un modello alternativo per lo studio della neurogenesi embrionale che è favorevole alla wholemount analisi, così come sezioni di tessuto per osservare la distribuzione spazio-temporale e il comportamento dei progenitori neurali. Inoltre, che facilmente viene sezionato per altre applicazioni a valle, quali analisi di isolamento o biologia molecolare delle cellule. Come il hindbrain del mouse può essere analizzato facilmente nel vasto numero di cella lignaggio reporter e ceppi di topi mutanti che si sono resi disponibili, offre un potente modello per lo studio dei meccanismi cellulari e molecolari della neurogenesi inerente allo sviluppo in un mammifero organismo. Qui, presentiamo un metodo semplice e rapido per utilizzare il hindbrain di embrione di topo per analizzare il comportamento delle cellule (NPC) progenitrici neurali dei mammiferi in preparazioni wholemount e sezioni di tessuto.
Durante lo sviluppo embrionale dei mammiferi, NPC dividono nelle subventricolare (SVZ) aree di espansione neuroepithelium e ventricolare (VZ) per generare nuovi neuroni in un processo chiamato ‘neurogenesi’. La generazione di nuovi neuroni e loro precursori NPC è stata studiata estesamente nel proencefalo1, mentre di meno è conosciuto circa questo processo in altre regioni.
Proencefalo è una struttura complessa e intricata piegata che è in gran parte ha studiata con i metodi istologici dopo il taglio del tessuto, che rende i modelli di neurogenesi comprensione attraverso l’intero organo impegnativo. Inoltre, studi di neurogenesi del forebrain non sono necessariamente predittivi del comportamento neurogeno in altre regioni del cervello o del midollo spinale. Ad esempio, segnalazione cues può suscitare le risposte diverse in regioni distinte del CNS, come osservato nel caso di fattore neurotrofico ciliare e fattore inibitorio di leucemia, che promuovono auto-rinnovamento di NPC nel laterale gangliare Eminenza, ma in auto differenziazione dei progenitori di midollo spinale2. Inoltre, una sottoclasse di NPC che popolano il proencefalo in via di sviluppo e contribuire significativamente all’espansione della corteccia cerebrale1 sono assenti del hindbrain e del midollo spinale3. Inversamente, è concepibile che il midollo spinale e hindbrain contengano alternativi sottotipi NPC non presenti nella corteccia.
Il hindbrain di embrione di topo è la regione più antica evolutiva del cervello dei mammiferi e genera il cervelletto e il tronco cerebrale. Nonostante la sua conservazione in specie, relativamente piccolo è conosciuto circa neurogenesi hindbrain, tra cui sottotipi NPC o loro regolazione. La maggior parte della ricerca del hindbrain nel topo si è concentrata sul processo di segmentazione del tessuto, guidata da geni di Hox4e la campitura di neuroni post-mitotici5. Inoltre, il hindbrain è stato utilizzato come modello per studiare i meccanismi di angiogenesi inerente allo sviluppo6.
In contrasto con il hindbrain del mouse, del hindbrain di zebrafish è stato usato estesamente per seguire NPC differenziazione e progressione di lignaggio in un organismo vertebrato modello (ad esempio,7,8). Il hindbrain pulcino è stato impiegato anche per studiare la neurogenesi durante lo sviluppo dei vertebrati (per esempio,9,10). Simile al zebrafish hindbrain11, il hindbrain pulcino può essere dal vivo imaged per studiare il comportamento NPC e regolamento nel tempo12. Analoga osservazione longitudinale da formazione immagine dal vivo non è attualmente possibile negli organismi dei mammiferi, perché si sviluppano nell’utero. Inoltre, mirata manipolazione attraverso tecniche come l’elettroporazione può essere facilmente applicato a embrioni di zebrafish dissipati o pulcino embrioni in ovo (ad es.,13), ma tali tecniche sono anche più impegnativo in utero.
Tuttavia, il hindbrain di embrione di topo è squisitamente adatto per definire i meccanismi molecolari e cellulari che regolano la neurogenesi. In primo luogo, analisi del hindbrain mouse fornirà, in molti casi, informazioni più pertinenti agli sviluppi di esseri umani di quella ottenuta attraverso lo studio di vertebrati inferiori. Mette inoltre a disposizione un vasto numero di ceppi di topi geneticamente modificati che può essere usato per destino Mappatura murino NPC o alterare meccanismi regolatori con alleli del mutante condizionali o costitutivi dei geni rilevanti. Infine, recentemente è stato dimostrato che microinjection del hindbrain ventricolare progenitori ex vivo permette almeno un breve esame del hindbrain NPC cinetica14. Ancora, allo stato attuale, pochissimo è conosciuto circa l’organizzazione spazio-temporale e il comportamento del hindbrain NPC in un contesto di organo intero.
Qui, dimostriamo un metodo semplice e rapido per utilizzare il hindbrain come un potente modello per analizzare il comportamento dei mammiferi di NPC in preparazioni wholemount e sezioni di tessuto. Forniamo ulteriori protocolli per utilizzare immunolabeling per lo studio di parametri differenti neurogenesi e processo hindbrain campioni ulteriormente per applicazioni molecolari a valle come trascrittasi inversa quantitativa (qRT)-PCR.
Questo protocollo viene descritto come utilizzare il hindbrain embrionali del mouse come un modello per studiare i meccanismi della neurogenesi inerente allo sviluppo. Utilizzando una varietà di metodi diversi immunolabeling, possono essere fruiti hindbrain NPC e il loro numero quantificato in sezioni di tessuto o organo wholemounts. La facilità di dissezione e anatomia piatto assicura che il hindbrain può essere imaged in una preparazione di ‘libro aperto’ per raccogliere informazioni sui modelli di livello di organo neurogenesi.
Più ulteriormente indichiamo che NPC morfologia e ciclo cellulare relativi NPC posizionamento possono essere facilmente visualizzati in galleggiante- o cryosections del hindbrain. Entrambi i comportamenti possono essere sfruttati per definire nuove popolazioni di cellule progenitrici, come in precedenza è stata eseguita nel telencefalo dei mammiferi20. Ad esempio, primi formata Sox2+ neuroepithelia e glia radiale apicale di Pax6+ sono presenti nel hindbrain21,22, ma manca il hindbrain Tbr2+ basali progenitori3 .
Il protocollo descritto qui può anche essere adattato per osservare il comportamento di specifiche sottopopolazioni di NPC di etichettatura fluorescente per formazione immagine dal vivo e/o l’analisi di lignaggio in tessuti fissi. Ciò può essere ottenuto, ad esempio, studiando hindbrains da topi portatori di tamoxifen-inducible transgene Sox1-iCreERT2 e il reporter Rosa26tdTomato 23.
Oltre a migliorare la conoscenza della neurogenesi murina, studiando il hindbrain può delucidare largamente pertinenti meccanismi neurogeni che sono condivise tra specie, perché il hindbrain è una regione altamente conservata del cervello che dovrebbe essere più simile tra le specie di vertebrati rispetto del forebrain.
Come nella neurogenesi hindbrain avviene sopra una finestra di tempo comparativamente più breve rispetto del forebrain neurogenesi23, è importante considerare la necessità di confrontare adeguatamente in scena gli embrioni. Di conseguenza, bias sperimentale è evitato da conteggio e registrazione del numero di coppie di somite in un embrione prima del suo hindbrain di isolamento. Il tessuto del hindbrain stesso è fragile e forcipe dovrebbero pertanto essere gestito con attenzione quando separando il tessuto del hindbrain dal mesenchima testa e meningi; un paio di ‘pratica corre’ quindi potrebbe essere consigliabile prima tentativo di dissezione di embrioni preziosi. Inoltre, hindbrains dovrebbe essere trasferito da una provetta a altra utilizzando una pipetta di Pasteur wide-bore, piuttosto che con il forcipe per evitare danni (apertura della pipetta può essere ampliata con il taglio della punta con forbici pulite). Infine, anche se raro, nella misura di EdU/BrdU incorporazione in fase S NPC può essere variabile, in particolare durante gli impulsi brevi (cioè, 1 h). Per migliorare l’etichettatura, garantire che EdU/BrdU è dissolto correttamente prima di caricare la soluzione nella siringa e iniettare con cura nella cavità peritoneale. Iniezioni di povere, come quelli realizzati per via sottocutanea da incidente, verranno causare perdere o intrappolando la soluzione EdU/BrdU e impedire di entrare la circolazione.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Vasiliki Chantzara per lo svolgimento di accoppiamenti temporizzati e il personale dell’unità risorse biologiche presso la UCL Institute of Ophthalmology per allevamento del mouse. Questo studio è stato supportato da un Wellcome Trust Investigator Award 095623/Z/11/Z a CR.
Round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) | VWR | 211-2120 | Also available from other commercial suppliers |
Plastic cell culture dish, 60 mm | Thermo Fisher | 150288 | Also available from other commercial suppliers |
Cell culture plates, 12-well | Thermo Fisher | 150628 | Also available from other commercial suppliers |
Pasteur pipettes | Copan | 200C | Also available from other commercial suppliers |
Dumont Watchmaker forceps, no. 5 | FST | 91150-20 | |
Dumont Watchmaker forceps, no. 55 | FST | 11295-51 | |
29G needle/syringe | BD | BD Micro-Fine +1ml | |
Anti-phospho-histone H3 primary antibody | Millipore | 06-570 | Goat, dilution 1:400 |
Anti-BrdU primary antibody | Abcam | ab6326 | Rat, dilution 1:400 |
Anti-Ki67 primary antibody | BD Biosciences | 550609 | Mouse, dilution 1:400 |
Anti-RC2 primary antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | RC2 | Mouse (IgM), dilution 1:400 |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11029 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rabbit secondary antibody | Thermo Fisher | A11037 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse IgM secondary antibody | Thermo Fisher | A21042 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody | Thermo Fisher | A11001 | Dilution 1:200 |
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rat secondary antibody | Thermo Fisher | A11007 | Dilution 1:200 |
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Sigma | D9542 | Use at 10 μg per mL |
5-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU) | Sigma | 900584 | |
5-bromo-2´-deoxyuridine (BrdU) | Sigma | B5002 | |
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit | Thermo Fisher | C10086 | |
Heat-inactivated goat serum | Sigma | G9023 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
DAKO protein-block serum free | Agilent | X0909 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | Also available from other commercial suppliers |
Phosphate buffer saline | Sigma | P4417 | Also available from other commercial suppliers |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Also available from other commercial suppliers |
Sodium tetraborate | Sigma | B9876 | Also available from other commercial suppliers |
Sucrose | Sigma | S0389 | Also available from other commercial suppliers |
Agarose | Sigma | A9539 | Also available from other commercial suppliers |
Super PAP pen liquid blocker | Ted Pella, Inc. | 22309 | |
SlowFade Antifade Kit | Thermo Fisher | S-2828 | |
Glycerol | Fisher Scientific | 10337700 | |
Mowiol | Millipore | 475904 | |
OCT | Scigen | 4583 | Also available from other commercial suppliers |
Isopentane | Sigma | M32631 | Also available from other commercial suppliers |
Methanol | Thermo Fisher | 10675112 | Also available from other commercial suppliers |
Hydrochloric acid | Thermo Fisher | 10316380 | Also available from other commercial suppliers |
Microscope slides | VWR | 631-0912 | |
Superfrost microscope slides | VWR | 631-0108 | |
Thermometer | VWR | 620-0858 | |
Cover glass | VWR | 631-0137 | |
Stereo Microscope, Leica MZ16 | Leica | not applicable | |
Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | not applicable |