Задний мозг мыши как модель для изучения эмбриональных нейрогенез

Все животные работа была проведена в соответствии с UK Home Office и местные этические принципы. 1. изложение шагов и времени Выполнять приурочен вязки взрослых мышей от штамм подходит для ответа на биологические вопрос расследуется для получения эмбриональных день (e) 9,5 e13.5 беременности; требуется 12-15 дней. При необходимости, подготовить 5-бром-2′-дезоксиуридина (BrdU) / 5-ethynyl-2′-дезоксиуридина (EdU) решения и выполнения инъекции (протокол раздел 2); требует ~ 1 час в день до или в день эмбриона изоляции, в зависимости от желаемой длины EdU/BrdU маркировки. Выполнения диссекции эмбриона изоляции и задний мозг (протокол раздел 3); требует ~ 10 мин/эмбриона. Выполнить wholemount иммунофлюоресценции маркировки (протокол раздел 4); требует 3 дней. Раздел с помощью vibratome и выполнять плавающей секции иммунофлюоресценции маркировки (протокол раздел 4): требует 2 дней. Раздел с помощью криостат и выполнять иммунофлюоресценции маркировки cryosections (протокол раздел 5); требует 2 дней. 2. придать беременных женщин мышь с BrdU или Эду (опционально) Растворите BrdU или EdU в стерильных фосфатный буфер (PBS) до концентрации 10 мг/мл и 1 мг/мл, соответственно.Предупреждение: BrdU и EdU токсичны; надевайте соответствующую защиту. Весят беременных мыши и вычислить объем BrdU или EdU решения, которое должно осуществляться для достижения 100 мг/кг BrdU или 5 мг/кг EdU. Внедрять решение BrdU или EdU через внутрибрюшинного маршрут либо 1 ч или 1 день до получения эмбрионов, в зависимости от необходимой длины маркировки.Примечание: Маркировки для 1 h визуализирует задний мозг клеток в S-фазе. Маркировка на 1 день визуализирует потомства задний мозг РНУ. 3. Вскрытие Hindbrains от e9.5 – e13.5 мышь эмбрионов Усыпить приурочен беременные женщины мыши, с помощью этически утвержденной процедуры на стадии требуется гестационного (например, шейки матки дислокации). С помощью острых ножниц, разрезали брюшной полости и тщательно акцизных матки. Место подакцизным матки, содержащего эмбрионы в 60 мм пластиковая блюдо, содержащий 20 мл ледяной PBS.Примечание: Асептической техники не требуется. Выполните все дальнейшие рассечение, с использованием рассечения микроскопа. С помощью часовщик щипцы номер 5, разорвать мышцы матки стены, чтобы разоблачить эмбрионы, выпуск каждого эмбриона путем разрыва пуповины и удалить желточного мешка. Используя широкий родила открытия стерильные пипетки Пастера, передача каждого эмбриона в чистые пластиковые блюдо с ледяной PBS. С помощью часовщик щипцы номер 55, разорвать голову (Рисунок 1E). При необходимости сохраните небольшой кусок ткани (например, ¼ желточного мешка или примерно 2 мм кончик хвоста) для геномной ДНК изоляции и последующих генотипирования. С помощью часовщик щипцы номер 55, акцизных ткани, содержащие задний мозг параллельно и немедленно ниже neuroepithelium задний мозг, чтобы отделить его от лица и переднего ткани (Рисунок 1F). Установите задний мозг и спинной стороне хвостового ткани головы вверх и идентифицировать 4й желудочек, которая покрыта тонким слоем ткани (плиты крыши). Тщательно проколоть пластину крыши с помощью часовщик щипцы номер 55 (рис. 1 g) и очистить от избыточной ткани с щипцами, рострально двигаясь вдоль средней линии над мозга, а затем каудально над задней задний мозг и спинной мозг (Рисунок 1 g ); задний мозг теперь должна быть доступна в открытой книге подготовка (Рисунок 1 H). Подготовка hindbrains wholemount immunolabeling (вариант 1). С помощью часовщик щипцы номер 55, тщательно дразнить прочь оставшихся головы мезенхимы и любой мозговых оболочек, придает сетчаточных стороне задний мозг, используя пинцет (Рисунок 1I). Удаление мозга и спинного тканей (Рисунок 1J) оставить только задний мозг ткани (рис. 1 K).Примечание: Этот шаг процедуры не следует e9.5 или e10.5, потому что попытка сделать это будет скорее всего ущерба задний мозг neuroepithelium; Кроме того удаление мозговых оболочек не является существенным, потому что neuroepithelium задний мозг достаточно тонкий на данном этапе, чтобы позволить эффективного проникновения антител для immunolabeling. Этот шаг следует, однако, следовать от e11.5 года, когда консолидирует менингеальные ткани, активизировать проникновение антитела в задний мозг neuroepithelium. Диссекция является простым, при выполнении в ледяной PBS (использование чистой PBS для каждого задний мозг). Подготовка hindbrains к vibratome и cryosectioning (вариант 2) С помощью часовщик щипцы номер 55, удалите мозга и спинного тканей (Рисунок 1J).Примечание: Нет необходимости снимать мезенхимы и мозговых оболочек hindbrains предназначен для разрезания (как показано на рисунке 1I). Передачи hindbrains из пластиковых блюдо круглодонные 2 мл пробирок с помощью пипетки Пастера, аспирационная все PBS и исправить втечение 2 ч при температуре 4° C с нежно агитации в свежей талой формальдегида 4% w/v, растворенных в PBS.Предупреждение: Формальдегид токсичных; надевайте соответствующую защиту. Промывайте hindbrains 3 x раз с PBS. Хранить при 4 ° C в PBS, если immunolabeling будут начинаться в течение 2-3 дней или заменить PBS methanol/50% PBS 50% за 5 мин до перехода на 100% метанола для более длительного хранения при-20° C. 4. Wholemount иммунофлюоресценции Если требуется, увлажняет hindbrains в последовательно уменьшается разведений метанола в PBS (например, метанол 75%, 50% метанола, 25% метанола) при комнатной температуре (RT) за 5 мин и затем перенести на PBS.Примечание: Адаптированная серия метанола требуется мягко увлажняет hindbrains и обеспечить сохранение надлежащего ткани. Разрушения hindbrains за 30 мин при температуре 4 ° C в PBS, содержащие 0,1% тритон X-100 (PBT) с нежным агитации. Инкубируйте hindbrains за 1 час при 4 ° C в ПБТ, содержащие 10% тепло инактивированная козьего сыворотки с нежным агитации.Примечание: Использование сыворотки от видов хост, что вторичные антитела были подняты в. Для первичного антитела, поднятые в козла, инкубировать в сыворотке свободно белка блока, например 5% бычьего сывороточного альбумина в подходящей альтернативой коммерческим или PBS (см. Таблицу материалы). Это позволит уменьшить неспецифичный пятнать, часто наблюдается при использовании первичного антитела, поднятые в козла. Инкубировать hindbrains на ночь при 4 ° C в ПБТ, содержащей 1% тепло инактивированная сыворотки и первичных антител с нежным агитации (например, кролик анти фосфористой гистонов H3 [pHH3] разводят 1: 400).Примечание: Для первичного антитела, поднятые в козла, используйте PBT без сыворотки. Мыть hindbrains на 4 ° C 5 x с PBT за 1 час. Инкубируйте hindbrains на ночь при 4 ° C в ПБТ, содержащие соответствующие конъюгированных Флюорофор вторичные антитела (например, коза анти кролик Alexa Fluor 488) при 1: 200 в ПБТ, направлены против основного антитела, которые используются. Держите hindbrains в темноте здесь на защитить флуорофоров от Фотообесцвечивание.Примечание: Для первичного антитела, поднятые в козла, используйте анти коза Fab фрагментов вторичных антител для уменьшения неспецифичный пятнать. Мыть hindbrains на 4 ° C 5 x с PBT за 1 час. Постфиксная hindbrains в 4% формальдегида в PBS для 15 мин на RT для долгосрочного сохранения антитела связывая. Кратко промывайте дважды в PBS. Покрытие стекла микроскопа с двумя слоями черной изоленты и акцизных небольшой площади из слоистых ленты для создания кармана, достаточно большой, чтобы держать один задний мозг. Перевод каждого задний мозг в карман с пипетка Пастера, удалить лишнюю жидкость и добавить соответствующие antifade реагента в карман перед покрывая его медленно с стекла coverslip, чтобы избежать захвата воздушных пузырей под coverslip. Уплотнение coverslip и прикрепить его к слайду с тонким слоем лака. Сохранить слайд на 4 ° C в темноте до захвата изображений (протокол раздел 7). 5. Vibratome секционирование и плавающей секции иммунофлуоресценции При необходимости, увлажняет hindbrains от метанола, как описано в пункте 4.1. Внедрение hindbrains в расплавленном 3% w/v агарозы подготовлен в дистиллированной воде.Примечание: Разрешить расплавленной агарозы остыть до приблизительно 55° C кратко перед встраивания для предотвращения повреждения тепла задний мозг. Вырежьте поперечный задний мозг секции толщиной 70 мкм, с помощью vibratome. Перевод каждого свежесрезанных секции с кистью в одну скважину 24-ну пластины, содержащие ледяной PBS. Этикетке плавающей секции, как описано в шагах 4.2-4,7, но изменять шаги следующим: Вымойте плавающей секции на 4 ° C 3 x с PBT 15 мин каждая, уменьшить время инкубации для вторичных антител к 2 h, и инкубировать в вторичное антитело на RT. При необходимости после маркировки с антитела для другие epitopes, как описано в шаге 5.4, обнаружить Эду+ ядер с помощью EdU маркировки комплект согласно инструкциям производителя. Инкубируйте плавающей секции в реакции коктейль на 30 минут при 37 ° C в темноте. Задний мозг мыть разделы на 4 ° C 3 x 15 мин с PBT. При необходимости после маркировки для другие epitopes, как описано в шаге 5.4, обнаружить следующим BrdU+ ядер. Инкубируйте плавающей секции в 2 N соляной кислоты при 37 ° C на 30 мин в темноте. Инкубируйте плавающей секции в 0,1 М Борат натрия буфер рН 8,5 дважды за 5 мин на RT в темноте, чтобы нейтрализовать соляную кислоту. Вымойте плавающей секции 3 x кратко в PBS на 4 ° C. Выполните иммунофлюоресценции, обозначать BrdU как описано в пункте 5.4. Инкубируйте плавающей секции для 2 мин на RT в 10 мкг/мл 4′, 6-diamidino-2-phenylindole дигидрохлорид (DAPI) в PBS в изображение клеточных ядер. Постфиксная плавающей секции в 4% формальдегида для 15 мин на RT. Вымойте плавающей секции кратко в PBS. Тщательно передачи плавающей секции стекло микроскопа с помощью кисти. Вытереть излишки PBS вокруг раздела с помощью промокательной бумаги или ткани. Смонтируйте разделы, с помощью 80% глицерина в PBS и крышку медленно с coverslip стекла во избежание захвата воздушных пузырьков. Сохранить слайд на 4 ° C в темноте до захвата изображений (шаг 7). 6. криостата секционирование и Cryosection иммунофлюоресценции маркировки При необходимости, увлажняет hindbrains от метанола, как описано в пункте 4.1. Инкубируйте hindbrains в 30% w/v сахарозы в ФБР в cryoprotect hindbrains до замораживания.Примечание: Hindbrains готовы для замораживания, когда они потоплены на дно трубки, которая обычно занимает ≤ 2 h для e9.5 10,5 hindbrains и 3-6 ч для hindbrains e11.5 13,5. Погрузите hindbrains оптических резки температуры смеси (OCT) и быстро заморозить путем передачи формы, содержащие hindbrains в OCT изопентан, охлаждается до-40 ° C до-50 ° C на сухой лед.Примечание: Замороженные, встроенный hindbrains может храниться при-20 ° C краткосрочной и долгосрочной перспективе-80 ° C до секционирование. Вырежьте поперечный задний мозг секции толщиной до 10 мкм с помощью криостат и передачи электростатически клей Микроскоп слайды.Примечание: Cryosections задний мозг может храниться при-20 ° C краткосрочной и долгосрочной перспективе-80 ° C до маркировки. Инкубируйте слайды в РТ за 15 мин высохнуть разделы слайды. Мыть cryosections с PBS растворить OCT и Марк гидрофобный барьер вокруг cryosections с помощью пера PAP. Повторите шаги 5.4-5.8. Повторите шаг 5.10 использование поливинилового спиртовой основе монтажа средних вместо глицерина. 7. изображение приобретение Примеры изображений с помощью epifluorescent или Конфокальный микроскоп лазерное сканирование с линзы подходят для водного медиа монтируется слайды и светофильтры подходят для флуорофоров, используемые для immunolabeling. Для изображения весь задний мозг или задний мозг секции, используйте объектив для 10 крат (например, Рисунок 2B); чтобы визуализировать hindbrains областей для количественной оценки, используйте 40 кратном (например, Рисунок 2D), а также визуализировать отдельных ячеек, используйте объектив с 63 x увеличением (например, рис. 2 c). 8. альтернативные методы После шаг 3,8 гомогенизировать нефиксированных hindbrains для производства одноклеточного подвеска для проточной цитометрии приложения15. После шаг 3,8 гомогенизировать нефиксированных hindbrains чтобы извлечь РНК из одной ячейки суспензий для RT-ПЦР (например, 16).Примечание: Убедитесь, что все реагенты и оборудование находятся стерильные и РНКазы бесплатно на протяжении для предотвращения деградации РНК. После шаг 3,8 гомогенизировать нефиксированных hindbrains изолировать НПС и распространять их в vitro как neurospheres для анализа задний мозг NPC поведение17.Примечание: Убедитесь, что все реагенты и оборудование находятся стерильные для предотвращения загрязнения бактериальное/грибковых культур нейросферы.