萌芽期の神経を研究するためのモデルとしてのマウス脳

すべての動物の仕事は英国ホーム オフィスおよびローカル倫理指針に従って行われました。 1. 手順とタイミングの概要 日 (e) 9.5 e13.5 妊娠; を入手するための調査の下で生物学的質問に答える適切な緊張から成体マウスのわれわれのタイムアウトを実行します。12-15 日が必要です。 必要に応じて、準備 5-ブロモ-2′-デオキシウリジン (BrdU)/5-エチニル-2′-デオキシウリジン (EdU) ソリューション注入 (プロトコル セクション 2); を実行し、必要とする ~ 1 h 前に、の日にまたは胚分離、エドゥ/brdu 細胞標識の所望の長さに応じての日。 胚単離と菱脳解剖 (プロトコル セクション 3); を実行します。必要があります 〜 10 分/胚。 Wholemount 蛍光分類の (プロトコル セクション 4); を実行します。3 日間が必要です。 フローティング セクション蛍光分類の (プロトコル セクション 4) を行い、vibratome を使用してセクション: 2 日間が必要です。 クライオスタットを使用してセクションし、凍結切片 (プロトコル セクション 5) の蛍光標識を実行2 日間が必要です。 2. BrdU とエドゥ (オプション) 妊娠中の雌マウスを注入します。 それぞれ BrdU または EdU を滅菌リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 10 mg/mL と 1 mg/mL の濃度で溶解します。注意: BrdU とエドゥが毒性適切な保護具を着用します。 妊娠マウスの重量を量るし、BrdU の 100 mg/kg に達するに投与されるべきである BrdU または EdU のソリューションの体積を計算または 5 mg/kg エドゥ。 ラベルの必要な長さに応じて、胚を収集する前にいずれかの 1 時間または 1 日腹腔内のルートを通じて BrdU または EdU の溶液を注入します。注: 1 h のラベル S 期に脳細胞を可視化します。1 日のために分類後脳 Npc の子孫を可視化します。 3. e9.5 – e13.5 マウス胚からの Hindbrains の郭清 (例えば、頚部転位) 必要な妊娠段階で倫理的に承認された手順を使用してタイミング妊娠雌マウスを安楽死させます。鋭いはさみを使用して腹腔内を開いてカットし、慎重に子宮を切除します。20 mL の氷冷 PBS を含む 60 mm プラスチックの皿に胚を含む切除した子宮を配置します。注: 無菌技術は必要ありません。 解剖顕微鏡を用いたさらに郭清のすべてを実行します。鉗子数 5 の時計を使用して、胚を公開、臍帯を切断してそれぞれの胚を解放および卵黄嚢を削除する子宮の筋肉の壁を引き裂きます。 滅菌パスツール ピペットを使用すると、ワイド穴の開くと、氷冷 PBS のきれいなプラスチック皿にそれぞれの胚を転送します。 時計鉗子数 55 を使用すると、(図 1E) 頭を断ちます。 必要に応じて、組織 (例えば卵黄嚢または約 2 mm 尾部先端の 1/4) ゲノムの DNA の隔離およびそれに続く遺伝子型解析のための小さな部分を保持します。 時計鉗子数 55 を使用して、菱脳とすぐに顔面と脳組織 (図 1 階) と区別するため後脳神経上皮下に並列を含む組織を切除します。 菱脳と尾側頭部組織の背側を (屋根板) の薄い組織層によって覆われている 4th心室を識別します。慎重に時計鉗子番号 55 (図 1) を使用して屋根に穴を開けるし、鉗子、中脳の正中線に沿って吻方移動で離れた余分な組織を剥離し、後部後脳と脊髄 (図 1 を尾側);菱脳は、開かれた本準備 (図 1 H) で今公開ください。 Wholemount 反応 (オプション 1) の hindbrains を準備します。 離れて残り頭間充織と鉗子 (図 1I) による菱脳の軟膜の側に接続されている任意の髄膜をいじめる鉗子数 55 の時計を使用して、慎重に。菱脳組織 (図 1 K) だけを残して中脳、脊髄組織 (図 1 j) を削除します。注: のこの手順をたどることが e9.5 または e10.5、そうしようと、菱脳神経上皮; に損傷を与える可能性が高いのでさらに、髄膜を削除する必要はありません後脳神経上皮は反応のための抗体の効率的な浸透を許可するようにこの段階で十分に薄いので。この手順は、必要があります、しかし、e11.5 以降から後脳神経上皮侵入抗体を強化する、硬膜の組織を統合する際に従います。郭清は、氷冷 PBS (各脳の使用きれいな PBS) で実行すると最も簡単です。 Hindbrains vibratome と cryosectioning (オプション 2) を備える 時計鉗子数 55 を使用して、中脳、脊髄組織 (図 1 j) を削除します。注: 間充織と髄膜の区分 (図 1Iで示すように) のためのもの hindbrains を削除する必要はありません。 プラスチックの皿から hindbrains を 2 mL の丸底チューブ パスツール ピペットを使用して転送、すべての PBS を吸引し、PBS に溶解したて解凍 4 %w/v ホルムアルデヒドの穏やかな撹拌 4 ° C で 2 時間修正します。注意: ホルムアルデヒドは有毒である;適切な保護具を着用します。 PBS の hindbrains 3 倍をすすいでください。反応、2-3 日以内に開始または-20° c.で長期保管のため 100% メタノールに転送する前に 5 分間 50% methanol/50% PBS と PBS を置き換えると、PBS で 4 ° C で保存します。 4. Wholemount 蛍光抗体法 必要な場合は、連続 5 分間室温 (RT) で (例えば75% メタノール、メタノール 50%、25% メタノール) PBS でメタノールの希釈液を減少させる hindbrains を水分補給し、PBS に転送。注: メタノールの一連の階級は優しく hindbrains を水分補給し、適切な組織保全の確保に必要です。 0.1% を含む PBS で 4 ° C で 30 分の hindbrains を permeabilize 穏やかな攪拌とトリトン X-100 (PBT)。 Hindbrains 穏やかな攪拌を 10% 熱不活化ヤギ血清を含む PBT で 4 ° C で 1 時間インキュベートします。注: は、二次抗体を上げた宿主動物種由来の血清を使用します。ヤギ、一次抗体を血清フリー孵化用蛋白質ブロック、たとえば PBS または適切な商業代替 5% ウシ血清アルブミン (材料の表を参照してください)。これは、非特定のヤギで発生した一次抗体を使用する場合に頻繁に観察された染色が低減されます。 一晩で 4 ° C 1% 熱非動化血清と穏やかな攪拌と一次抗体を含む PBT hindbrains を孵化させなさい (例えばウサギ抗リン ヒストン H3 [pHH3] 希釈 1: 400)。注: ヤギの一次抗体、血清なし PBT を使用します。 4 ° c 5、hindbrains を洗う 1 h の PBT と x。 一晩で PBT を含む適切な蛍光標識二次抗体 (例えばヤギ抗うさぎ Alexa Fluor 488) PBT 使用一次抗体に対してターゲットで 1: 200 で 4 ° C hindbrains を孵化させなさい。退色から蛍光物質を保護するために、ここから暗闇の中で hindbrains を維持します。注: ヤギの一次抗体、非特定の染色を抑えるアンチ山羊二次抗体の Fab 断片を使用します。 4 ° c 5、hindbrains を洗う 1 h の PBT と x。 抗体の結合の長期保全のため常温 15 分 PBS で 4% ホルムアルデヒドに hindbrains を後置します。簡単に PBS で 2 回すすいでください。 黒の絶縁テープの 2 つの層とガラス顕微鏡スライドをカバーし、1 つの脳を保持するために十分な大きさのポケットを作成する層状テープから小さな正方形の消費税します。 パスツール ピペットでポケットにそれぞれ脳を転送、余分な液体を除去し、coverslip の下でトラップ空気泡を避けるためにガラス基板にゆっくりとそれをカバーする前にポケットに適切な antifade 試薬を追加します。Coverslip のシールやマニキュアの薄い層を使用してスライドに貼付。暗闇の中で画像の取得 (プロトコル セクション 7) まで 4 ° C でスライドを格納します。 5. Vibratome 区分およびセクション蛍光をフローティング 必要な場合は、手順 4.1 で説明したメタノールから hindbrains を水分補給します。 溶融 3% の w/v agarose 蒸留水の準備に hindbrains を埋め込みます。注: は、後脳の熱損傷を防ぐへの埋め込み前に簡潔におよそ 55 ° C に冷却する溶解アガロースを許可します。 横菱脳のセクションを vibratome を使用して 70 μ m の厚さにカットします。各転送は新鮮な氷冷 PBS を含む 24 ウェル プレートの 1 つのウェルに絵筆を持つセクションをカットしました。 フローティングのセクション 4.2 4.7 の手順で説明するようにラベルを付けるが、次のように手順を変更: セクション浮動の 4 ° C で PBT と 3 x 15 分 2 h に二次抗体の孵化時間を短縮し、二次抗体室温で孵化させなさい洗浄 必要に応じて、ステップ 5.4 で説明したように、他のエピトープに対する抗体のラベル付け後、ラベリング キット製造元の指示に従ってエドゥを用いたエドゥ+核を検出します。暗闇の中で 37 ° C で 30 分間カクテルの反応でフローティングのセクションを孵化させなさい。洗浄後脳は 4 ° C で 15 分 PBT と 3 x をセクションします。 必要に応じて、ステップ 5.4 で説明したように、他のエピトープのラベル付け後、とおり BrdU+核を検出します。 暗闇の中で 30 分の 37 ° C で 2 N 塩酸で浮動セクションを孵化させなさい。 0.1 M ナトリウム ホウ酸バッファー pH 8.5 5 分各 RT で塩酸を中和するために暗闇の中での 2 回の浮動セクションを孵化させなさい。 フローティングのセクション 3 簡単に x PBS で 4 ° C でを洗う 蛍光 BrdU ステップ 5.4 で説明するようにラベル付けを実行します。 フローティングのセクション 10 μ g/mL 4′, 6-diamidino-2-phenylindole 二塩酸塩 (DAPI) 細胞核対比染色に PBS での RT で 2 分間、インキュベートします。 室温 15 分 4% のホルムアルデヒドのフローティングのセクションを後置します。 簡単に PBS の浮動セクションを洗います。慎重に絵筆を使ってガラス顕微鏡スライドにフローティングのセクションを転送します。あぶらとり紙やティッシュを使用してセクションの周り余分な PBS をモップでふきます。 PBS とカバーの 80% グリセロールを使用するゆっくりとガラス基板とトラップの空気の泡を避けるためにセクションをマウントします。暗闇の中で画像の取得 (ステップ 7) まで 4 ° C でスライドを格納します。 6. クライオスタット切片と Cryosection 蛍光ラベリング 必要な場合は、手順 4.1 で説明したメタノールから hindbrains を水分補給します。 Hindbrains cryoprotect hindbrains 凍結前に PBS で 30 w/v ショ糖で孵化させなさい。注: Hindbrains、彼らは通常 ≤ 2 h は、管の底に沈んでいるときにフリーズの準備ができて e9.5 10.5 hindbrains と e11.5 13.5 hindbrains の 3-6 時間。 光切断温度化合物の hindbrains (OCT) が水没し、イソペンタン-40 ° C とドライアイスで-50 ° C の間に冷却する 10 月の hindbrains を含む鋳型を転送することによってすぐにフリーズします。注: 短期的に-20 ° C と区分まで-80 ° C 長期冷凍、組み込み hindbrains を格納できます。 クライオスタットと静電剥離防止用スライドへの転送を使用して 10 μ m の厚さに横菱脳のセクションをカットします。注: 菱脳の凍結切片は-20 ° C 短期およびラベリングまで長期的に-80 ° C で保存できます。 常温 15 分スライドするセクションを乾燥するスライドを孵化させなさい。PBS の凍結切片を洗うディゾルブ 10 月とマーク PAP ペンを使って凍結切片のまわりで障壁を疎水性にします。5.4 5.8 の手順を繰り返します。 5.10 グリセリンの代わりにポリビニル アルコール ベース マウント媒体を使用して手順を繰り返します。 7. 画像の取得 画像のサンプルは、epifluorescent または水性メディア マウント スライドと反応に使用される蛍光物質に適した光学フィルターに適したレンズを搭載した共焦点レーザー走査顕微鏡を使用します。 全体の脳や脳セクションをイメージするには、(例えば図 2 b); 10 倍の倍率のレンズを使用します。定量化のための hindbrains 領域を視覚化するには、倍の倍率 (例図 2 D) 個々 の細胞を可視化する、(例えば図 2) 63 x 倍率とレンズを使用する 40 を使用します。 8. 代替方法 次のステップは、3.8、フローサイトメトリーアプリケーション15の単一細胞懸濁液を生成する固定されていない hindbrains をホモジナイズしてください。 次のステップは、3.8、固定されていない hindbrains RT qPCR (例えば、 16) の単一細胞懸濁液から RNA を抽出するホモジナイズしてください。注: すべての試薬および機器は、維持滅菌と RNase フリーで RNA の分解を防ぐために。 次のステップは、3.8、Npc を分離し、体外の菱脳 NPC 動作17の分析のための神経幹細胞としてそれらを広めるに固定されていない hindbrains をホモジナイズしてください。注: すべての試薬および機器は、維持 neurosphere 文化の細菌/真菌の汚染を防ぐために滅菌します。