Die Maus Hinterhirn als Modell für die Erforschung embryonaler Neurogenese

Alle tierische Arbeit wurde nach UK Home Office und lokalen ethischen Richtlinien durchgeführt. 1. Zusammenfassung der Schritte und Timing Führen Sie zeitgesteuerte Paarungen erwachsener Mäuse aus einem Stamm geeignet, die biologische Frage untersuchten embryonalen Tag (e) 9,5-e13.5 Schwangerschaften zu erhalten; 12-15 Tage erfordert. Bereiten Sie optional, 5-Bromo-2′-Deoxyuridine (BrdU) / 5-Ethynyl-2′-Deoxyuridine (EdU) Lösung, und führen Sie Injektion (Protokoll Abschnitt 2); erfordert ~ 1 h am Vortag oder am Tag der Embryo isoliert, abhängig von der gewünschten Länge der EdU/BrdU Beschriftung. Führen Sie Embryo isoliert und Hinterhirn Dissektion (Protokoll Abschnitt 3); erfordert ~ 10 min/Embryo. Führen Sie Wholemount Immunfluoreszenz Kennzeichnung (Protokoll Abschnitt 4); 3 Tage benötigt. Abschnitt mit einer Vibratome und schwimmenden Abschnitt Immunfluoreszenz Kennzeichnung (Protokoll Abschnitt 4) durchführen: dauert 2 Tage. Abschnitt mit einem Kryostaten und führen Immunfluoreszenz Kennzeichnung von Cryosections (Protokoll Abschnitt 5); 2 Tage benötigt. 2. Spritzen Sie schwangere weibliche Maus mit BrdU oder EdU (Optional) Lösen Sie auf, BrdU oder EdU in sterilen Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zu einer Konzentration von 10 mg/mL und 1 mg/mL, beziehungsweise.Achtung: BrdU und EdU sind giftig; angemessenen Schutz zu tragen. Wiegen die schwangere Maus und berechnen Sie das Volumen der BrdU oder EdU-Lösung, die verabreicht werden sollten, um 100 mg/kg BrdU zu erreichen bzw. 5 mg/kg EdU. BrdU oder EdU-Lösung durch die intraperitoneale Route entweder 1 h oder 1 Tag vor dem Sammeln der Embryonen, abhängig von der erforderlichen Länge der Beschriftung zu injizieren.Hinweis: Kennzeichnung für 1 h Hinterhirn Zellen in der S-Phase visualisiert. Kennzeichnung für 1 Tag visualisiert die Nachkommen von Hinterhirn NPCs. 3. Zerlegung des Hindbrains aus e9.5 – e13.5-Maus-Embryonen Einschläfern Sie eine zeitlich-schwangeren weiblichen Maus mit einem ethisch genehmigten Verfahren in der erforderlichen Schwangerschafts Stadium (z.B. zervikale Dislokation). Mit einer scharfen Schere aufschneiden der Bauchhöhle und sorgfältig Verbrauchsteuern die Gebärmutter. Legen Sie die ausgeschnittene Gebärmutter mit den Embryonen in einer 60 mm Plastikschale mit 20 mL eiskaltem PBS.Hinweis: Aseptischer Technik ist nicht erforderlich. Führen Sie alle weiteren Dissektion mit einem sezierenden Mikroskop. Verwendung von Uhrmacher Pinzette Nummer 5, reißen Sie die uterine Muskelwand zu entlarven die Embryonen, lösen Sie jedes Embryo durch die Nabelschnur durchtrennen und Entfernen der Dottersack. Mit einer sterilen Pasteurpipette mit Wide-Bohrung öffnen jedes Embryo übertragen Sie in eine saubere Kunststoff Schale mit eiskaltem PBS. Trennen Sie Uhrmacher Pinzette Nummer 55 verwenden, den Kopf (Abbildung 1E). Ein kleines Stück des Gewebes (z. B.¼ der einen Dottersack oder ca. 2 mm Schwanzspitze) für genomische DNA-Isolierung und anschließende Genotypisierung optional zu behalten. Mit Uhrmacher Pinzette Nummer 55, Verbrauchsteuern des Gewebes mit dem Hinterhirn parallel und gleich unter dem Hinterhirn Neuroepithelium es Gesichts- und Vorderhirn Gewebe (Abb. 1F) getrennt. Positionieren Sie das Hinterhirn und kaudalen Kopf Gewebe Rückenseite oben und identifizieren Sie die 4th Ventrikel, die durch eine dünne Gewebeschicht (Dach Platte) abgedeckt ist. Sorgfältig die Dach-Platte mit Uhrmacher Pinzette Nummer 55 (Abbildung 1) durchbohren und schälen entfernt überschüssiges Gewebe mit der Pinzette, das Mittelhirn, Rostral entlang der Mittellinie überfahren und dann kaudal über den hinteren Hinterhirn und des Rückenmarks (Abbildung 1 ); Das Hinterhirn sollten jetzt in ein offenes Buch-Vorbereitung (Abbildung 1 H) ausgesetzt werden. Bereiten Sie Hindbrains für Wholemount Immunolabeling (Option 1). Necken Sie mit Uhrmacher Pinzette Nummer 55, sorgfältig entfernt restlichen Kopf Mesenchym und jede Hirnhaut pial seitlich von dem Hinterhirn mit Pinzette (Abbildung 1I) befestigt. Entfernen Sie das Mittelhirn und Rückenmark Gewebe (Abbildung 1J) um nur das Hinterhirn Gewebe (Abbildung 1 K) zu verlassen.Hinweis: Dieser Schritt des Verfahrens sollte nicht bei e9.5 oder e10.5, zurückgegriffen werden, da Versuch, dazu wahrscheinlich das Hinterhirn Neuroepithelium beschädigen würde. Entfernen der Hirnhäute ist übrigens nicht erforderlich, weil das Hinterhirn Neuroepithelium zum jetzigen Zeitpunkt effiziente Eindringen von Antikörpern für Immunolabeling ausreichend dünn ist. Dieser Schritt sollte jedoch, von e11.5 ab, verfolgt werden, wenn die meningealen Gewebe festigt um Antikörper Eindringen in das Hinterhirn Neuroepithelium zu verbessern. Dissektion ist am einfachsten, wenn Sie in eiskaltem PBS (Nutzung sauber PBS für jedes Hinterhirn) durchgeführt. Hindbrains für Vibratome und Kryoschneiden (Option 2) vorbereiten Mit Uhrmacher Pinzette Nummer 55, entfernen Sie das Mittelhirn und Rückenmark Gewebe (Abbildung 1J).Hinweis: Es ist nicht notwendig, Mesenchym und Hirnhäuten des Hindbrains für den Schnitt (siehe Abbildung 1I) zu entfernen. Hindbrains aus der Plastikschale auf Runde Talsohle 2 mL Röhrchen mit einer Pasteurpipette übertragen, aspirieren Sie alle PBS und fix für 2 h bei 4° C mit sanft-Agitation in frisch aufgetauten 4 % w/V Formaldehyd in PBS aufgelöst.Achtung: Formaldehyd ist giftig; angemessenen Schutz zu tragen. Waschen Sie Hindbrains 3 X mal mit PBS. Bei 4 ° C mit PBS-Puffer zu speichern, wenn Immunolabeling wird innerhalb von 2-3 Tagen beginnen oder PBS mit 50 % methanol/50% PBS für 5 min ersetzen vor der Übertragung zu 100 % Methanol für eine längere Lagerung bei-20° C. 4. Wholemount Immunfluoreszenz Bei Bedarf, rehydrieren Hindbrains in abnehmender seriell Verdünnungen von Methanol mit PBS-Puffer (z. B.75 % Methanol, 50 % Methanol, 25 % Methanol) bei Raumtemperatur (RT) für 5 min und dann übertragen auf PBS.Hinweis: Eine abgestufte Reihe von Methanol ist erforderlich, um sanft rehydrieren Hindbrains und richtige Gewebe Erhaltung zu gewährleisten. Permeabilize Hindbrains für 30 min bei 4 ° C in PBS mit 0,1 % Triton x-100 (PBT) mit sanften Agitation. Inkubieren Sie Hindbrains für 1 h bei 4 ° C im PBT mit 10 % Hitze-inaktivierten Ziegenserum unter schonenden rühren.Hinweis: Verwenden Sie Serum aus der Wirtsarten, denen die sekundäre Antikörper in erhoben wurden. Für Primärantikörper angehoben Ziege, brüten in serumfreien Protein blockieren, zum Beispiel 5 % Rinderserumalbumin in PBS oder eine kommerzielle Alternative (siehe Tabelle der Materialien). Dadurch verringert sich unspezifische Färbung häufig zu beobachten, wenn Sie Primärantikörper angehoben Ziege verwenden. Hindbrains über Nacht bei 4 ° C im PBT mit 1 % Hitze-inaktivierten Serum und primären Antikörper mit sanften Agitation inkubieren (z.B., Kaninchen-Anti-Phospho-Histon H3 [pHH3] verdünnt 1: 400).Hinweis: Für Primärantikörper angehoben Ziege, nutzen Sie PBT ohne Serum. Waschen Sie die Hindbrains bei 4 ° C 5 X mit PBT für 1 h. Inkubieren Sie Hindbrains über Nacht bei 4 ° C im PBT mit entsprechenden Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper (z.B. Ziege Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488) bei 1: 200 in PBT gezielt gegen die primäre Antikörper verwendet. Halten Sie Hindbrains in der Dunkelheit von hier aus auf Immunofluoreszenz Fluorophore schützen.Hinweis: Für Primärantikörper angehoben Ziege, verwenden Sie Anti-Ziege Fab-Fragmente der Sekundärantikörper, um unspezifische Färbung zu reduzieren. Waschen Sie die Hindbrains bei 4 ° C 5 X mit PBT für 1 h. Die Hindbrains in 4 % Formaldehyd in PBS für 15 min bei RT für dauerhafte Erhaltung der Antikörperbindung Postfix. Spülen Sie kurz zweimal mit PBS-Puffer. Decken Sie einen Glas-Objektträger mit zwei Schichten schwarzes Isolierband und Verbrauchsteuern ein kleines Quadrat aus geschichteten Band erstelle ich eine Tasche groß genug für eine Hinterhirn. Übertragen Sie jedes Hinterhirn in eine Tasche mit einer Pasteurpipette, entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit zu und fügen Sie eines entsprechenden antifade Reagenz in der Tasche vor dem abdecken es langsam mit einem Glas Deckgläschen Trapping Luftblasen unter dem Deckglas zu vermeiden hinzu. Versiegeln Sie das Deckglas und kleben Sie es auf die Folie mit einer dünnen Schicht des Nagellacks. Folie bei 4 ° C im Dunkeln bis zur Bildaufnahme (Protokoll Abschnitt 7) lagern. 5. Vibratome schneiden und schwimmende Abschnitt Immunfluoreszenz Falls erforderlich, rehydrieren Sie Hindbrains aus Methanol wie unter Punkt 4.1 beschrieben. Betten Sie Hindbrains in geschmolzenem 3 % w/V Agarose in destilliertem Wasser zubereitet.Hinweis: Lassen Sie flüssige Agarose auf ca. 55 ° C abkühlen, kurz vor dem Einbetten um Hinterhirn Hitzeschäden zu vermeiden. Schnitt quer Hinterhirn Abschnitten bis zu einer Dicke von 70 µm mit einer Vibratome. Übertragen Sie frisch geschnittene Abschnitte mit einem Pinsel in einen Brunnen von einer 24-Well-Platte mit eiskaltem PBS. Die schwimmenden Abschnitte zu kennzeichnen, wie in 4.2-4.7 beschrieben, aber ändern Sie die Schritte wie folgt: Waschen der schwimmenden Abschnitte bei 4 ° C 3 X mit PBT jeweils 15 min Inkubationszeit für Sekundärantikörper 2 h zu verringern und in Sekundärantikörper bei RT inkubieren Optional nach Kennzeichnung mit Antikörpern für andere Epitope, wie unter Punkt 5.4 beschrieben, EdU+ Kerne mit einer EdU labeling Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers zu erkennen. Inkubieren Sie die schwimmenden Abschnitte in der Reaktion cocktail für 30 min bei 37 ° C im Dunkeln. Waschen Hinterhirn Abschnitte 3 X mit PBT für 15 min bei 4 ° C. Optional nach Kennzeichnung für andere Epitope, wie unter Punkt 5.4 beschrieben, erkennen Sie BrdU+ Kerne wie folgt. Inkubieren Sie schwimmende Abschnitte in 2 N Salzsäure bei 37 ° C für 30 Minuten im Dunkeln. Inkubieren Sie schwimmende Abschnitte in 0,1 M Natrium Borat Puffer pH 8,5 zweimal für jeweils 5 min bei RT in der Dunkelheit, die Salzsäure zu neutralisieren. Schwimmende Abschnitte 3 x kurz mit PBS-Puffer bei 4 ° c zu waschen Durchführen Sie Immunfluoreszenz labeling für BrdU wie unter Punkt 5.4 beschrieben. Inkubieren Sie die schwimmenden Abschnitte für 2 min bei RT in 10 µg/mL 4′, 6-Diamidino-2-Phenylindole Dihydrochloride (DAPI) mit PBS-Puffer, Zellkerne Gegenfärbung. Postfix die schwimmenden Abschnitte in 4 % Formaldehyd für 15 min bei RT Waschen Sie schwimmende Abschnitte kurz in PBS. Übertragen Sie schwimmende Abschnitte sorgfältig auf einen Glas-Objektträger mit einem Pinsel. Wischen Sie überschüssiges PBS rund um den Bereich mit Löschpapier oder Gewebe. Montieren Sie Abschnitte mit 80 % Glycerin in PBS und Abdeckung langsam mit einem Glas Deckgläschen Trapping Luftblasen zu vermeiden. Folie bei 4 ° C im Dunkeln bis zur Bildaufnahme (Schritt 7) lagern. 6. Kryostat schneiden und Cryosection Immunfluoreszenz Kennzeichnung Falls erforderlich, rehydrieren Sie Hindbrains aus Methanol wie unter Punkt 4.1 beschrieben. Hindbrains in 30 % w/V Saccharose in PBS, Cryoprotect Hindbrains vor dem Einfrieren zu inkubieren.Hinweis: Hindbrains sind bereit für das Einfrieren, wenn sie an der Unterseite des Rohres, versenkt haben, die dauert in der Regel ≤ 2 h für e9.5-10.5 Hindbrains und 3-6 h für e11.5-13.5 Hindbrains. Tauchen Sie Hindbrains in optischen Schnitttemperatur zusammengesetzten (OCT) und frieren Sie schnell durch die Übertragung von Formen mit den Hindbrains im Okt. bis Isopentane auf-40 ° C bis-50 ° C auf Trockeneis gekühlt.Hinweis: Bei-20 ° C kurzfristig und langfristig-80 ° C bis-Schnitt können gefroren, eingebettete Hindbrains gespeichert werden. Schnitt quer Hinterhirn Abschnitten bis zu einer Dicke von 10 µm mit einem Kryostaten und Transfer zum elektrostatisch anhaftenden Objektträger.Hinweis: Hinterhirn Cryosections können bei-20 ° C kurzfristig und langfristig-80 ° C bis Kennzeichnung gespeichert werden. Inkubieren Sie Folien bei RT für 15 min Abschnitte zu den Folien zu trocknen. Cryosections mit PBS Waschen auflösen OCT und Mark eine hydrophobe Barriere rund um Cryosections mit einem PAP-Stift. Wiederholen Sie die Schritte 5.4-5.8. Wiederholen Sie Schritt 5.10 mit einem polyvinyl Alkohol basierenden Eindeckmedium anstelle von Glycerin. 7. die Bildaufnahme Bildbeispiele mit einem Epifluorescent oder konfokale Laserscanning-Mikroskop mit Linsen geeignet für wässrige Medien montierte Folien und optische Filter für die Fluorophore verwendet für Immunolabeling ausgestattet. Um das ganze Hinterhirn oder dem Hinterhirn Abschnitt Bild, verwenden Sie ein Objektiv für 10 X Vergrößerung (z.B. Abb. 2 b); Verwenden Sie um Hindbrains Bereiche für die Quantifizierung zu visualisieren, eine 40 X Vergrößerung (z.B. Abb. 2D) und zu visualisieren Einzelzellen, verwenden Sie ein Objektiv mit einer 63 X Vergrößerung (z.B. Abb. 2). 8. alternative Methoden Folgender Schritt 3,8 homogenisieren Sie unfixierten Hindbrains um eine einzelne Zelle Aufhängung für Durchflusszytometrie Anwendungen15zu produzieren. Folgender Schritt 3,8 homogenisieren Sie unfixierten Hindbrains zum Extrahieren von RNA aus einzelnen Zellsuspensionen für RT-qPCR (z.B. 16).Hinweis: Stellen Sie sicher alle Reagenzien und Geräte sind gehalten, steril und RNase-kostenlos im gesamten Abbau der RNA zu verhindern. Folgender Schritt 3,8 homogenisieren Sie unfixierten Hindbrains um NPCs zu isolieren und sie als Neurosphären für die Analyse von Hinterhirn NPC Verhalten17 in Vitro zu propagieren.Hinweis: Stellen Sie sicher alle Reagenzien und Geräte sind steril, Bakterien-/Pilzbefall Neurosphäre Kulturen zu verhindern gehalten.