마우스 Hindbrain 배아 신생 공부에 대 한 모델

모든 동물 작품 영국 홈 오피스 및 로컬 윤리 지침에 따라 수행 되었다. 1입니다. 단계와 타이밍의 요약 배아 일 (전자) 9.5 e13.5 임신;를 조사 생물학 질문에 대답 하는 적합 한 스트레인에서 성인 쥐의 초과 matings를 수행 12-15 일이 필요합니다. 선택적으로, 준비 5-브로 모-2′-deoxyuridine (BrdU) / deoxyuridine (듀)-5-ethynyl-2′ 솔루션 수행 주입 (프로토콜 섹션 2); 필요 합니다 ~ 전날 또는 듀/BrdU 라벨의 원하는 길이 따라 배아 격리의 하루에 1 시간. 수행 하는 고립과 hindbrain 절 개 태아 (프로토콜 섹션 3); 필요 합니다 ~ 10 분/태아. 수행 하는 wholemount 면역 형광 라벨 (프로토콜 섹션 4); 3 일이 필요합니다. 부동 섹션 면역 형광 라벨 (프로토콜 섹션 4)을 수행 하는 vibratome를 사용 하 여 섹션: 2 일 필요 합니다. cryostat를 사용 하 여 섹션과 면역 형광 라벨 cryosections (프로토콜 섹션 5);의 수행 2 일 필요합니다. 2. 주입 임신 여성 마우스 BrdU 또는 듀 (선택 사항) 분해 BrdU 또는 듀 버퍼링 멸 균 인산 염 (PBS) 10 mg/mL 및 1 mg/mL의 농도에서 각각.주의: BrdU와 듀는 독성; 적절 한 보호를 착용 하십시오. 임신 마우스 무게와 계산 BrdU 또는 듀 솔루션 BrdU 100 mg/kg를 도달 하는 관리 되는 볼륨 또는 5 mg/kg에 듀. 라벨의 필요한 길이 따라 배아를 수집 하기 전에 어느 1 h 또는 1 일 복 경로 통해 BrdU 또는 듀 솔루션을 주입.참고: S-단계에서 hindbrain 셀 시각화 1 h에 대 한 라벨. 1 일 라벨 시각화 hindbrain NPCs의 자손. 3. Hindbrains e9.5-e13.5 마우스 배아에서에서의 해 부 (예를 들면, 자 궁 경부 전위) 필요한 임신 단계에서 윤리적으로 승인 된 절차를 사용 하 여 타임-임신 여성 마우스 안락사 날카로운가 위를 사용 하 여 복 막 구멍을 자르면 고 신중 하 게 자 궁을 삭제할. 20 mL의 얼음 처럼 차가운 PBS를 포함 하는 60 m m 플라스틱 접시에 배아를 포함 하는 삭제 자 궁을 놓습니다.참고: 무 균 기술을 필요 하지 않습니다. 모든 추가 절 개 해 현미경을 사용 하 여 수행 합니다. Using 시계 집게 번호 5, 배아를 노출, 각 배아 탯 severing 하 여 놓고 노른자위 낭 제거 자 궁 근육 벽 눈물. 넓은 구멍 열기와 살 균 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여, 얼음 처럼 차가운 PBS 가진 깨끗 한 플라스틱 접시에 각 배아를 전송 합니다. Using 시계 집게 번호 55, 머리 (그림 1E) 서버. 필요에 따라 조직 (예를 들어, 노 른 자 삭 또는 약 2mm 꼬리 끝의 ¼) 게놈 DNA 분리 및 후속 유전형의 작은 조각을 유지 합니다. Using 시계 집게 번호 55, 삭제할 hindbrain 병렬 하 고 즉시 얼굴 및 개 조직 (그림 1 층)에서 분리 hindbrain neuroepithelium 아래를 포함 하는 조직. 위치는 hindbrain 및 꼬리 머리 조직 등 쪽 고 얇은 조직 층 (지붕 격판덮개)에 의해 덮여 있는 4번째 심 실 식별. 조심 스럽게 시계 집게 번호 55 (그림 1G)을 사용 하 여 지붕 판 피어스와 집게, rostrally는 중간 선 따라 midbrain, 위로 이동 함께 멀리 초과 조직 껍질 그리고 caudally 후부 hindbrain 척수 (그림 1G 이상 ); hindbrain 이제 오픈 책 준비 (그림 1 H)에 노출 되어야 합니다. Hindbrains wholemount immunolabeling (옵션 1)에 대 한 준비. Using 시계 집게 번호 55, 신중 하 게 나무 랄 수 멀리 나머지 머리 mesenchyme 및 hindbrain 집게 (그림 1I)를 사용 하 여의 pial 측에 연결 된 모든 meninges. Hindbrain 조직 (그림 1 K)만 두고 midbrain 및 척수 조직 (그림 1J)를 제거 합니다.참고:이 절차의이 단계 하지 따라야 한다 e9.5 또는 e10.5, 시도 hindbrain neuroepithelium; 손상 가능성이 것 때문에 또한, meninges 제거 되지 않습니다 필수 hindbrain neuroepithelium immunolabeling에 대 한 항 체의 효율적인 침투 수 있도록이 단계에서 충분히 얇은 이기 때문에. 그러나이 단계,, 한다 meningeal 조직 통합, hindbrain neuroepithelium에 항 체 침투를 향상 시킬 때 이후, e11.5에서 따라야. 해 부는 얼음 처럼 차가운 PBS (각 hindbrain에 대 한 사용 깨끗 한 PBS)에서 수행 될 때 가장 쉬운. Hindbrains vibratome 및 cryosectioning (옵션 2)에 대 한 준비 시계 겸 번호 55를 사용 하면, 제거할 midbrain 및 척수 조직 (그림 1J).참고: 아니에요 mesenchyme 및 meninges 단면 ( 그림 1I에서 같이)를 위한 hindbrains의 제거 하는 데 필요한. 플라스틱 접시에서 둥근 바닥 2 mL 튜브 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 hindbrains를 전송 하 고 모든 PBS, 발음 갓 해 동된 4 %w / v 포 름 알 데히드 PBS에 녹아 있는 부드러운 동요와 4 ° C에서 2 시간에 대 한 수정.주의: 포름알데히드는 독성이; 적절 한 보호를 착용 하십시오. Hindbrains 3 배 시간 PBS와 린스. Immunolabeling 2-3 일 이내에 시작 됩니다 또는-20° C에 저장을 위해 100% 메탄올을 전송 하기 전에 5 분 동안 50% methanol/50% PBS와 PBS를 대체 하는 경우 PBS에 4 ° C에서 저장 4. Wholemount 면역 형광 검사 필요한 경우, 순차적으로 감소 하는 5 분 동안 실 온 (RT)에서 (예를 들어, 75% 메탄올, 50% 메탄올, 25% 메탄올) PBS에 메탄올의 희석에 hindbrains를 rehydrate 하 고 PBS에 전송.참고: 메탄올의 등급된 시리즈는 부드럽게 hindbrains를 rehydrate 하 고 적절 한 조직 보존을 보장 합니다. 0.1%를 포함 하는 PBS에 4 ° C에서 30 분 동안 hindbrains를 permeabilize Triton X-100 (PBT) 부드러운 동요와 함께. PBT 포함 된 부드러운 동요와 함께 10% 열 비활성화 염소 혈 청에서에서 4 ° C에서 1 시간에 대 한 hindbrains를 품 어.참고: 2 차 항 체에 제기 했다 호스트 종에서 혈 청을 사용 합니다. 염소에 1 차 항 체 혈 청 무료에서 품 어 대 한 단백질 차단, 예를 들어 5% 소 혈 청 알 부 민 PBS 또는 적당 한 상업적인 대안에 ( 재료의 표참조). 이 일반적인 염소에서 1 차 항 체를 사용 하는 경우 자주 관찰 얼룩을 줄일 것입니다. Hindbrains 1% 열 비활성화 세럼과 부드러운 동요와 1 차 항 체를 포함 하는 PBT에서 4 ° C에서 하룻밤을 품 어 (예를 들어, 토끼 안티 인 히스톤 H3 [pHH3] 희석 1:400).참고: 염소에서 기본 항 체, 혈 청 하지 않고 PBT를 사용 합니다. 4 ° c 5는 hindbrains를 씻어 1 h PBT와 배. PBT 적절 한 fluorophore 활용 된 이차 항 체 (예를 들면, 염소 안티 토끼 알 렉 사 Fluor 488) PBT 사용 기본 항 체에 대 한 대상에서 1: 200에서 포함에 4 ° C에서 하룻밤 hindbrains를 품 어. Photobleaching에서 fluorophores를 보호 하기 위해 여기 hindbrains 어둠 속에서 계속.참고: 염소에서 1 차 항 체에 대 한 일반적인 얼룩을 줄이기 위해 2 차 항 체의 항 염소 Fab 조각을 사용 합니다. 4 ° c 5는 hindbrains를 씻어 1 h PBT와 배. 항 체 바인딩의 장기 보존을 위한 RT에서 15 분 동안 4% 포름알데히드 PBS에 있는 hindbrains 접미사 짧게 PBS에 두 번 씻어. 검은 전기 테이프의 2 개의 층으로 유리 현미경 슬라이드 커버 하 고 작은 사각형 하나의 hindbrain를 충분히 큰 주머니를 만들 계층된 테이프에서 삭제할. 각 hindbrain 파스퇴르 피 펫으로 주머니에 전송, 과잉 액체를 제거 하 고 추가 적절 한 antifade 시 약 주머니는 coverslip에서 트랩 공기 방울을 피하기 위해 유리 coverslip로 천천히 그것을 취재 하기 전에. coverslip 봉인 하 고 매니큐어의 얇은 층을 가진 슬라이드에 부착. 이미지 수집 (프로토콜 섹션 7)까지 어둠 속에서 4 ° C에서 슬라이드를 저장 합니다. 5입니다. Vibratome 단면 및 부동 섹션 면역 형광 검사 4.1 단계에서 설명한 대로 필요한 경우 메탄올에서 hindbrains rehydrate. 증류수에 녹은 3 %w / v agarose에 hindbrains를 포함 합니다.참고: 녹은 agarose hindbrain에 열 손상을 방지 하기 위해 포함 하기 전에 짧게 약 55 ° C에 냉각 허용 합니다. vibratome을 사용 하 여 70 µ m의 두께로 가로 hindbrain 섹션을 잘라. 얼음 처럼 차가운 PBS를 포함 하는 24-잘 접시의 한 잘에는 붓으로 갓 커트 각 섹션을 전송 합니다. 4.2-4.7, 단계에서 설명한 대로 부동 섹션 라벨 하지만 단계를 다음과 같이 수정: 세척 부동 섹션 4 ° C에서 3 x PBT와 15 분 각, 2 h, 2 차 항 체에 대 한 보육 시간을 단축 하 고 실시간에 이차 항 체에 품 어 필요한 경우, 단계 5.4에서에서 설명 된 대로 다른 epitopes에 대 한 항 체와 라벨, 후 듀+ 핵은 듀 라벨 제조업체의 지침에 따라 장비를 사용 하 여 검색. 어둠 속에서 37 ° C에서 30 분 동안 칵테일 반응에서 부동 섹션을 품 어. 세척 hindbrain 섹션 4 ° C에서 15 분 동안 PBT와 3 배. 필요한 경우, 단계 5.4에서에서 설명 된 대로 다른 epitopes에 대 한 라벨, 후 감지 BrdU+ 핵 다음과 같습니다. 어둠 속에서 30 분 동안 37 ° C에서 2 N 염 산에 부동 섹션을 품 어. 두 번 5 분 동안 각 RT에 염 산을 중화 하는 어둠 속에서 0.1 M 나트륨 붕 산 염 버퍼 pH 8.5에서에서 부동 섹션을 품 어. 부동 섹션 3 짧게 x PBS에 4 ° c.에 세척 면역 형광 검사 BrdU 단계 5.4에서에서 설명 된 대로 대 한 라벨을 수행 합니다. 10 µ g/mL 4′, counterstain 세포 핵에 PBS에서 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)에 실시간에 2 분 동안 부동 섹션을 품 어. 실시간에서 15 분 동안 4% 포름알데히드에 부동 섹션 후 위 PBS에서 짧게 부동 섹션을 씻어. 신중 하 게 유리 현미경 슬라이드는 페인트 브러시를 사용 하 여 부동 섹션 전송. 초과 PBS 압 종이 또는 직물을 사용 하 여 섹션 주위를 청소 하십시오. 섹션 사용 하 여 PBS에 커버 80% 글리세롤 천천히 유리 coverslip 트랩 공기 방울을 피하기 위해 탑재 합니다. 이미지 수집 (7 단계)까지 어둠 속에서 4 ° C에서 슬라이드를 저장 합니다. 6. cryostat 단면화 및 Cryosection 면역 형광 라벨 4.1 단계에서 설명한 대로 필요한 경우 메탄올에서 hindbrains rehydrate. Hindbrains cryoprotect hindbrains 동결 이전에 PBS에서 30 %w / v 자당에서 품 어.참고: Hindbrains 그들은 일반적으로 ≤ 2 h 하는 관의 바닥에 침 몰 하는 때 동결에 대 한 준비가 e9.5 10.5 hindbrains 및 3-6 h e11.5 13.5 hindbrains. 잠수함 복합 광학 절삭 온도에 hindbrains (10 월) 및-40 ° C와-50 ° C에서 드라이 아이스 냉각 isopentane를 10 월에 hindbrains를 포함 하는 금형을 전송 하 여 신속 하 게 동결.참고: 고정 된, 포함 된 hindbrains는-20 ° C 단기 및 장기 단면까지 보기 위해-80 ° C에 저장할 수 있습니다. Cryostat 및 전송 정전 접착제 현미경 슬라이드를 사용 하 여 10 µ m의 두께로 가로 hindbrain 섹션을 잘라.참고: Hindbrain cryosections-20 ° C 단기 및 장기 라벨까지 보기 위해-80 ° C에 저장할 수 있습니다. 슬라이드 슬라이드 섹션 건조 15 분 RT에서 품 어. PBS 가진 cryosections 세척 디졸브 10 월 및 마크 cryosections PAP 펜을 사용 하 여 주위 소수 성 장벽. 5.4-5.8 단계를 반복 합니다. 5.10 글리세롤 대신 폴 리 비닐 알코올 기반 설치 매체를 사용 하 여 단계를 반복 합니다. 7. 이미지 수집 Epifluorescent 또는 수성 미디어 탑재 슬라이드 및 광학 필터 fluorophores immunolabeling 사용에 대 한 적합 한 적합 한 렌즈를 장착 하는 confocal 레이저 스캐닝 현미경을 사용 하 여 이미지 샘플. 전체 hindbrain 또는 hindbrain 섹션 이미지를 사용 하 여 렌즈를 10 배 확대 (예를 들어, 그림 2B);에 대 한 정량화에 대 한 hindbrains 영역을 시각화 하려면 40 배율 (예를 들어, 그림 2D) X 개별 셀을 시각화, 63 x 확대 (예를 들어, 그림 2C)와 함께 사용 하는 렌즈를 사용 합니다. 8. 다른 방법 3.8 단계, cytometry 응용 프로그램15에 대 한 단일 세포 현 탁 액을 생산 하기 위해 고정 되지 않은 hindbrains 균질. 3.8 단계, 실시간 정량 (예를 들어, 16)에 대 한 단일 셀 정지에서 RNA 추출 하 고정된 hindbrains 균질.참고: 확인 모든 시 약 및 장비 살 균과 RNase-무료 전체 RNA의 저하를 방지 하기 위해 유지 됩니다. 3.8 단계, NPCs를 격리 하 여 neurospheres hindbrain NPC 행동17의 분석으로 그들을 생체 외에서 전파 고정된 hindbrains 균질.주: 모든 시 약 및 장비 neurosphere 문화의 세균/곰 팡이 오염을 방지 하기 위해 살 균 보관 됩니다 확인 하십시오.