JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociência

העכבר Hindbrain כמודל ללימוד נוירוג'נסיס עובריים

Published: January 29, 2018
doi:
10.3791/56793
,
1UCL Institute of Ophthalmology

Summary

מאמר זה מדגים כיצד hindbrain עובריים העכבר יכול לשמש כמודל לומד נוירוג’נסיס התפתחותית כל האיבר והן ההכנות בסעיף רקמות.

Abstract

העכבר עובר הקדמי היא מערכת הנפוצות ביותר ללמוד נוירוג’נסיס יונקים במהלך הפיתוח. עם זאת, neuroepithelium הקדמי מאוד מקופל אינה לבצע ניתוח wholemount לבחון דפוסי נוירוג’נסיס איבר רחב. יתר על כן, הגדרת המנגנון של הקדמי נוירוג’נסיס אינה בהכרח חזוי של נוירוג’נסיס בחלקים אחרים של המוח; לדוגמה, בשל נוכחותם של תתי סוגים ספציפיים הקדמי קדמון. העכבר hindbrain מספק מודל אלטרנטיבי ללמוד נוירוג’נסיס עובריים זה לבצע ניתוח wholemount, כמו גם רקמות מקטעים כדי לבחון את התפלגות ייתכן וההתנהגות של אבות עצבית. יתר על כן, זה הוא בקלות גזור עבור יישומים אחרים במורד הזרם, כגון ניתוח בידוד או ביולוגיה מולקולרית של התא. כפי hindbrain העכבר ניתן לנתח בקלות במספר העצום של כתב היוחסין תא וללחצים בעכבר מוטנט שהפכו זמינים, הוא מציע מודל חזק לימוד מנגנונים תאית ומולקולרית נוירוג’נסיס התפתחותית ב מידע יונקים . אורגניזם. כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה ומהירה לשימוש hindbrain העובר את העכבר עבור ניתוח בתרבית של קדמון עצבית בהתנהגות התא (NPC) ב wholemount ההכנות ומקטעים רקמות.

Introduction

במהלך התפתחות יונקים, לחלק NPCs חדרית (VZ), אזורי (SVZ) subventricular neuroepithelium מתרחבת כדי ליצור נוירונים חדשים בתהליך הנקרא ‘נוירוג’נסיס’. הדור של נוירונים חדשים, מבשרי NPC שלהם נחקר בהרחבה הקדמי1, בעוד פחות ידוע על תהליך זה באזורים אחרים.

הקדמי הוא מקופל מסובכת ומורכבת מבנה, הוא למד בעיקר עם שיטות היסטולוגית לאחר חלוקתה רקמות, מה שהופך את ההבנה נוירוג’נסיס דפוסי מעבר כל האיבר מאתגר. בנוסף, מחקרים של הקדמי נוירוג’נסיס אינם בהכרח חזוי של התנהגות neurogenic באזורים אחרים במוח או בחוט השדרה. לדוגמה, אשר איתות רמזים עשוי להפיק תגובות שונות על-פני אזורים הנבדלים זה מזה CNS, כפי שנצפה במקרה של ciliary neurotrophic פקטור ו לוקמיה מעכבות פקטור, לקדם התחדשות עצמית של NPCs לרוחב קדושתו ganglionic, אבל נסיעה הבידול של חוט השדרה אבות2. יתר על כן, תת מחלקה של NPCs לאכלס הקדמי לפתח ולתרום באופן משמעותי הרחבה של קליפת המוח1 נעדרים hindbrain חוט השדרה3. . הפוך, זה מתקבל על הדעת כי חוט השדרה ואת hindbrain מכילים יחוברו NPC חלופית לא נוכח בקליפת.

Hindbrain העובר העכבר הוא האזור העתיק אבולוציונית של המוח יונקים ומייצר את המוח, גזע המוח. למרות שימור שלה על פני מינים, יחסית מעט מאוד ידוע על נוירוג’נסיס hindbrain, כולל תת NPC או תקנה שלהם. רוב המחקר hindbrain העכבר התמקדה התהליך של פילוח רקמות, מונע על ידי גנים Hox4ואת המתבנת של הנוירונים הפוסט-mitotic5. בנוסף, hindbrain שימש כמודל ללמוד את המנגנונים של אנגיוגנזה התפתחותי6.

בניגוד hindbrain העכבר, hindbrain דג זברה שימש בהרחבה לעקוב אחר NPC בידול והתקדמות שושלת היוחסין של אורגניזם מודל חוליות (למשל,7,8). הבחורה hindbrain ננקטה גם ללמוד נוירוג’נסיס במהלך הפיתוח חוליות (למשל,9,10). בדומה ה hindbrain דג זברה11, הבחורה hindbrain ניתן בשידור חי עם תמונה ללמוד התנהגות NPC ורגולציה לאורך זמן12. תצפית אורכית מקבילה על ידי הדמיה חיה אינה אפשרית כיום אורגניזמים יונקים, כי הם מפתחים ברחם. יתר על כן, ממוקד מניפולציה באמצעות טכניקות כגון אלקטרופורציה ניתן להחיל בקלות על עוברי דג זברה אל-אווירני עצמאי או אפרוח עוברי ב ovo (למשל,13), אבל טכניקות אלה הם גם יותר מאתגרת ב . פשוט תאכל.

למרות זאת, hindbrain העובר העכבר מתאימה להפליא כדי להגדיר את המנגנונים המולקולריים הסלולר המפקחים נוירוג’נסיס. ראשית, ניתוח של hindbrain העכבר, במקרים רבים, יספק מידע שהוא רלוונטי יותר להתפתחויות בני אדם מזה שהושג דרך לימוד חולייתנים התחתון. יתר על כן, מספר עצום של זנים מהונדסים העכבר זמינים כי יכול גם לשמש לגורל מיפוי NPCs מאתר או לשנות את מנגנוני הרגולציה אללים mutant מכוננת או מותנה של גנים הרלוונטיים. ולבסוף, לאחרונה הוכח כי microinjection של hindbrain חדרית אבות שמחוץ מאפשר לפחות בדיקה קצרה של hindbrain NPC קינטיקה14. עדיין, כיום, מעט מאוד ידוע על הארגון ייתכן ועל ההתנהגות של hindbrain NPCs בהקשר כל האיבר.

. הנה, נדגים שיטה פשוטה ומהירה לשימוש את hindbrain כמודל עוצמה לניתוח התנהגות NPC בתרבית של ההכנות wholemount ומקטעים רקמות. אנו מספקים נוסף פרוטוקולים להשתמש immunolabeling ללמוד פרמטרים שונים נוירוג’נסיס תהליך hindbrain דגימות נוספות ליישומים מולקולרית במורד הזרם כגון כמותיים רוורס טרנסקריפטאז (לרביעיית)-PCR.

Protocol

כל העבודה בעלי חיים בוצע לפי משרד הפנים בריטניה והנחיות אתיות מקומיים. 1. סיכום השלבים והתזמון בצע matings מתוזמן של עכברים בוגרים מתוך זן מתאים לענות על השאלה ביולוגיות. תחת חקירה כדי להשיג הריונות 9.5-e13.5 מתחלקים היום (ה); דורשת 12-15 ימים. לחלופין, להכין 5-ברומו-2′-deoxyuridine (BrdU) / 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (אדו) פתרון לבצע הזרקה (פרוטוקול בסעיף 2); דורש ~ h 1 ביום שלפני או ביום של בידוד העובר, בהתאם לאורך הרצוי של עידו/BrdU תיוג. לבצע חיתוך בידוד, hindbrain העובר (פרוטוקול בסעיף 3); דורש ~ 10 min/העובר. לבצע תיוג (פרוטוקול סעיף 4); immunofluorescence wholemount דורש 3 ימים. סעיף באמצעות vibratome ולבצע צף immunofluorescence סעיף תיוג (פרוטוקול סעיף 4): דורש 2 ימים. סעיף באמצעות cryostat ולבצע immunofluorescence תיוג של cryosections (פרוטוקול בסעיף 5); דורש 2 ימים. 2. להזריק את העכבר נקבה בהריון עם BrdU או אדו (אופציונלי) להמיס BrdU או אדו פוספט סטרילי buffered תמיסת מלח (PBS) ריכוזי של 10 מ”ג/מ”ל, 1 מ”ג/מ”ל, בהתאמה.התראה: BrdU ואדו הם רעילים; לענוד הגנה הולמת. שוקל את העכבר בהריון ולחשב את עוצמת הקול של BrdU או אדו פתרון זה צריך להיות מנוהל על מנת להגיע 100 מ”ג/ק”ג BrdU או 5 מ”ג/ק”ג אדו. מזריקים BrdU או אדו פתרון דרך המסלול בקרום הבטן או 1 h או 1 יום לפני איסוף העוברים, בהתאם לאורך חובה תיוג.הערה: תיוג עבור 1 h מדמיין hindbrain תאים בשלב-S. תיוג עבור יום אחד מדמיין הוא צאצא. של hindbrain NPCs. 3. ניתוח Hindbrains מ- e9.5 – e13.5 העכבר עוברי המתת חסד עכבר נקבה בהריון-תוזמן באמצעות הליך אתית שאושרו בשלב הריון הדרושים (למשל, נקע בצוואר הרחם). באמצעות מספריים חדות, לחתוך חלל הצפק, בזהירות לסלק את הרחם. מקם את הרחם נכרת המכיל את העוברים לתוך צלחת פלסטיק 60 מ מ המכיל 20 מ”ל PBS קר כקרח.הערה: הטכניקה Aseptic אינה נדרשת. לבצע כל ניתוח נוסף באמצעות מיקרוסקופ ויבתר. באמצעות שען מלקחיים מספר 5, דמעה על הקיר שריר הרחם כדי לחשוף את העוברים, שחרר כל העובר על-ידי ניתוק הטבור ולהסיר את שק החלמון. באמצעות פיפטה סטרילי של פסטר עם wide-משעמם פתיחה, להעביר כל העובר לתוך צלחת פלסטיק נקי עם PBS קר כקרח. בעזרת מלקחיים שען מספר 55, סבר הראש (איור 1E). באופן אופציונלי, שומרים על חתיכה קטנה של רקמות (למשל, ¼ של שק חלמון או כ 2 מ מ קצה הזנב) בידוד דנ א גנומי, genotyping עוקבות. בעזרת מלקחיים שען מספר 55, לסלק את הרקמה המכילה את hindbrain מקביל ל ומתחת מיד את neuroepithelium hindbrain כדי להפרידו מרקמות ופנים הקדמי (איור 1F). מקם את hindbrain ואת הצד הגבי סימטרית רקמות ראש למעלה ולזהות הנוזליםth 4, המכוסה על ידי שכבה רקמה דקה (צלחת גג). בזהירות לנקב את הצלחת גג באמצעות מלקחיים שען מספר 55 (איור 1 ג’י) ולהתקלף רקמות עודף משם עם מלקחיים, מעבר rostrally לאורך קו האמצע המוח האמצעי, ולאחר מכן הקליפה על hindbrain האחורי ועל חוט השדרה (איור 1 ג’י ); hindbrain צריך להיחשף עכשיו בהכנה ספר פתוח (איור 1 H). היכונו hindbrains wholemount immunolabeling (אפשרות 1). באמצעות שען מלקחיים מספר 55, בזהירות להקניט משם מזנכימה ראש הנותרים ואת כל קרומי המוח מחוברים לצד pial hindbrain באמצעות מלקחיים (איור 1I). הסר את המוח האמצעי ואת רקמת חוט השדרה (איור 1J) להשאיר רק את הרקמה hindbrain (איור 1 K).הערה: שלב זה של ההליך צריכה לא להיות מלווה e9.5 או e10.5, כי מנסה לעשות זאת סביר להניח ולפגיעה את neuroepithelium hindbrain; יתר על כן, הסרת קרומי המוח אינה חיונית, כי neuroepithelium hindbrain דליל מספיק בשלב זה כדי לאפשר חדירה יעיל של נוגדנים עבור immunolabeling. שלב זה צריך, עם זאת, לפעול לפיהם מ e11.5 ואילך, מאחדת את הרקמה של קרום המוח, כדי לשפר את הנוגדן לחדירה neuroepithelium hindbrain. ניתוח היא הקלה כאשר מבוצעת ב- PBS קר כקרח (שימוש, נקי PBS עבור כל hindbrain). היכונו hindbrains vibratome ו- cryosectioning (אפשרות 2) בעזרת מלקחיים שען מספר 55, הסר את המוח האמצעי ואת רקמת חוט השדרה (איור 1J).הערה: אין צורך להסיר מזנכימה, קרומי המוח של hindbrains מיועד חלוקתה (כפי שמוצג באיור 1I). להעביר hindbrains צלחת פלסטיק עגול עם תחתית mL 2 צינורות באמצעות פיפטה של פסטר, תשאף כל PBS, תקן עבור 2 h ב 4° C עם עדין-עצבנות בפורמלין המופשרים טרי 4% w/v מומס PBS.התראה: פורמלדהיד הוא רעיל; לענוד הגנה הולמת. לשטוף hindbrains 3 x פעמים עם PBS. לאחסן ב 4 ° C ב- PBS אם immunolabeling להתחיל בתוך 2-3 ימים או להחליף PBS עם 50% methanol/50% PBS במשך 5 דקות לפני העברת 100% מתנול לאחסון ארוך ב-20מעלות צלזיוס. 4. Wholemount Immunofluorescence אם נדרש, נוזלים hindbrains באופן סדרתי ומקטין דילולים של מתנול ב- PBS (למשל, 75% מתנול, 50% מתנול, 25% מתנול) בטמפרטורת החדר (RT) למשך 5 דקות ולאחר מכן להעביר ל- PBS.הערה: סדרה מדורגת של מתנול נדרש להחזיר נוזלים hindbrains בעדינות ולהבטיח שימור הרקמה הנכונה. Permeabilize hindbrains למשך 30 דקות ב 4 ° C ב- PBS המכיל 0.1% X-100 טריטון (PBT) עם עצבנות עדין. דגירה hindbrains עבור h 1 ב 4 ° C ב- PBT המכיל 10% סרום להשבית חום עז עם עצבנות עדין.הערה: להשתמש בסרום מן המינים מארח שגדלו הנוגדנים משני שם. עבור ראשי נוגדנים העולות עז, דגירה, סרום ללא חלבון לחסום, למשל 5% שור אלבומין PBS או חלופה המסחרי (ראה טבלה של חומרים). פעולה זו תקטין את שאינם ספציפיים מכתים נצפו לעתים קרובות באמצעות נוגדנים העיקרי העולות עז. דגירה hindbrains בין לילה ב 4 ° C ב- PBT המכיל 1% לא פעיל חום סרום נוגדנים ראשי עם עצבנות עדין (לדוגמה, ארנב אנטי-פוספו היסטון H3 [pHH3] מדולל 1:400).הערה: עבור ראשי נוגדנים העולות עז, השתמש PBT ללא סרום. לשטוף את hindbrains ב 4 ° C 5 x עם PBT עבור 1 h. דגירה hindbrains בין לילה ב 4 ° C ב- PBT המכיל המתאים fluorophore מצומדת משני נוגדנים (למשל, עז נגד ארנב אלקסה עבור חיל הים 488) ב- 1:200 ב- PBT המכוונים נגד נוגדנים העיקרי בשימוש. לשמור hindbrains בחושך מכאן על להגן על fluorophores photobleaching.הערה: נוגדנים העיקרי העולות עז, לשימוש שברי Fab עז נגד נוגדנים משניים כדי להפחית שאינם ספציפיים מכתים. לשטוף את hindbrains ב 4 ° C 5 x עם PBT עבור 1 h. Postfix את hindbrains בפורמלין 4% ב- PBS למשך 15 דקות ב RT לשימור לטווח ארוך של הנוגדן מחייב. בקצרה לשטוף פעמיים ב- PBS. מכסה זכוכית מיקרוסקופ שקופית עם שתי שכבות של איזולירבנד שחור, בלו כיכר קטנה מהקלטת בשכבות כדי ליצור כיס גדול מספיק כדי להכיל hindbrain אחד. העברת כל hindbrain לתוך כיס עם פיפטה פסטר, להסיר עודפי נוזלים ולהוסיף ריאגנט antifade המתאים של הכיס לפני וכיסה אותו לאט לאט coverslip זכוכית כדי למנוע השמנה בועות אוויר תחת coverslip. לסגור את coverslip, ולהצמיד אותו לשקופית עם שכבה דקה של לק. לאחסן שקופיות ב 4 ° C בחושך עד ייבוא תמונות (פרוטוקול סעיף 7). 5. Vibratome חלוקתה, צף סעיף Immunofluorescence אם נדרש, נוזלים hindbrains של מתנול כפי שמתואר בשלב 4.1. להטביע hindbrains מותכת agarose w/v של 3%, המבושלות מים מזוקקים.הערה: אפשר agarose מותכת להתקרר כ 55 מעלות בקצרה לפני הטמעת כדי למנוע נזק חום hindbrain. חותכים hindbrain רוחבי מקטעים לעובי מיקרומטר 70 באמצעות של vibratome. העברת כל מקטע טרי חתוך באמצעות מברשת צבע לתוך אחד טוב של צלחת 24-ובכן המכיל PBS קר כקרח. תווית הסעיפים צף כמתואר בצעדים 4.2-4.7, אבל לשנות את השלבים כדלהלן: תשטוף הצפים סעיפים ב 4 ° C 3 x עם PBT עבור 15 דקות כל אחד, להקטין את זמן הדגירה של נוגדנים משניים 2 h, דגירה של נוגדנים משניים-RT. לחלופין, לאחר תיוג עם נוגדנים עבור אחרים epitopes כפי שמתואר בשלב 5.4, לזהות גרעינים אדו+ באמצעות להכש תיוג ערכת על פי הוראות היצרן. דגירה בסעיפים צף התגובה קוקטייל במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחושך. תשטוף hindbrain סעיפים ב 4 ° C 3 x עם PBT למשך 15 דקות כל אחד. לחלופין, לאחר תיוג עבור אחרים epitopes כפי שמתואר בשלב 5.4, לאתר את הגרעינים BrdU+ כדלקמן. דגירה צף ובסעיף 2 חומצה הידרוכלורית N ב 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות בחושך. דגירה צף ובסעיף 0.1 M נתרן בוראט מאגר pH 8.5 פעמיים במשך 5 דקות כל אחד ב- RT בחושך כדי לנטרל את חומצת מלח. לשטוף צף ובסעיף 3 x בקצרה PBS ב 4 º C. לבצע תיוג עבור BrdU כפי שמתואר בשלב 5.4 immunofluorescence. דגירה הסעיפים צף למשך 2 דקות ב RT ב 10 µg/mL 4′, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (דאפי) ב- PBS כדי counterstain גרעין התא. Postfix הסעיפים צף בפורמלדהיד 4% למשך 15 דקות ב- RT. רחץ מקטעים צף בקצרה ב- PBS. בזהירות להעביר מקטעים צף על שקופית זכוכית מיקרוסקופ שימוש במכחול. תנגבי PBS עודף סביב הסעיף באמצעות נייר סופג או רקמה. טעינת המקטעים באמצעות 80% גליצרול PBS ואת הכיסוי לאט עם coverslip זכוכית כדי למנוע השמנה בועות אוויר. לאחסן שקופיות ב 4 ° C בחושך עד ייבוא תמונות (שלב 7). 6. cryostat חלוקתה, Cryosection Immunofluorescence תיוג אם נדרש, נוזלים hindbrains של מתנול כפי שמתואר בשלב 4.1. דגירה hindbrains ב- 30% w/v סוכרוז ב- PBS כדי cryoprotect hindbrains להקפאה.הערה: Hindbrains הם מוכן קפוא כאשר הם טבענו לתחתית של הרכבת התחתית, אשר בדרך כלל לוקח ≤ 2 h עבור hindbrains e9.5-10.5 ו- h 3-6 עבור hindbrains e11.5-13.5. להטביע hindbrains בטמפרטורה חיתוך אופטי, מתחם (אוקטובר) ומקפיאים במהירות על ידי העברת תבניות המכילות hindbrains ב- OCT כדי איזופנטאן מקורר בין-40 ° C ל-50 מעלות צלזיוס על קרח יבש.הערה: ניתן לאחסן hindbrains קפואים, מוטבעים ב-20 ° C לטווח הקצר ולטווח הארוך-80 ° C עד חלוקתה. חותכים למקטעים hindbrain רוחבי בעובי 10 מיקרומטר באמצעות cryostat העברת שקופיות מיקרוסקופ electrostatically דבק.הערה: ניתן לאחסן Hindbrain cryosections ב-20 ° C לטווח הקצר ולטווח הארוך-80 ° C עד תיוג. דגירה שקופיות ב RT למשך 15 דקות לייבוש סעיפים על השקופיות. לשטוף cryosections עם PBS כדי להמיס OCT ומארק מחסום הידרופובי מסביב cryosections באמצעות עט PAP. חזור על שלבים 5.4-5.8. חזור על שלב 5.10 באמצעות בינוני פוליוויניל הרכבה על בסיס אלכוהול במקום גליצרול. 7. ייבוא תמונות דגימות באמצעות פלורסנטי או מיקרוסקופ קונפוקלי סריקה בלייזר, מצוידים עם עדשות מתאים שקופיות רכוב מדיה מימית ומסנני מתאים fluorophores משמש immunolabeling. כדי דמות את hindbrain שלם או מקטע hindbrain, השתמש עדשה של 10 x הגדלה (למשל, איור 2B); כדי להמחיש hindbrains אזורים על כימות, השתמש 40 X הגדלה (למשל, איור דו-ממדי) וכדי להמחיש תאים בודדים, השתמש עדשה עם 63 x הגדלה (למשל, איור 2C). 8. שיטות אלטרנטיביות בעקבות צעד 3.8, homogenize hindbrains מבולבל לייצר השעיה תא בודד עבור cytometry זרימה יישומים15. בעקבות צעד 3.8, homogenize hindbrains מבולבל לחלץ RNA לתא בודד המתלים עבור RT-qPCR (למשל, 16).הערה: ודא כל ראגנטים וציוד נשמרים וסטרילי, RNase-מתכווננים כדי למנוע השפלה של RNA. בעקבות צעד 3.8, homogenize hindbrains מבולבל כדי לבודד NPCs להפיץ אותם במבחנה כמו neurospheres לניתוח התנהגות NPC hindbrain17.הערה: ודא כל ראגנטים וציוד נשמרים סטרילי למניעת זיהום בקטריאלי/פטרייתי של תרבויות neurosphere.

Representative Results

סעיף זה ממחיש דוגמאות של תוצאות ניתן להשיג כשלמדתי נוירוג’נסיס ב hindbrain עובריים העכבר דרך ניתוח סעיף wholemount ורקמות. אנו מראים את immunolabeling wholemount של hindbrain microdissected עם נוגדן עבור pHH3 סמן mitotic מדמיין חלוקת NPCs ב VZ (איור 2B – D). אנחנו מראים pHH3+ NPCs בהגדלה כדי להדגיש שלבים שונים של מיטוזה (איור 2C). לנו יש מאויר זה תיוג בשיטה זו מתאים שיבוצע על פני מספר שלבים רצופים של פיתוח hindbrain לבחון את מהלך הזמן NPC מיטוזה באיבר זה (איור דו-ממדי). אנחנו מראים כי הדמיה immunolabeled רוחבי vibratome חלקים hindbrain 1 h לאחר ההזרקה אדו, מדמיין את הכיוון המחשוף של mitotic NPCs (איור 3B), התבנית ההעברה גרעיני pseudostratified, interkinetic של רכיבה על אופניים אבות18 (איור 3B, D), המבנה VZ הכולל (איור 3B – D). שימו לב כי pHH3 mitotic+ NPCs נמצאים רק על פני השטח חדרית, לא יותר basally (איור 3C), אשר ניגודים הדפוס חטיבת הבזליים של NPCs מחויב יותר הקדמי19. אנחנו גם מדגימים איך רכיבה על אופניים NPCs ואת צאצאיהן הבדיל ניתן שכותרתו עם BrdU או EdU כדי להעריך את התקדמות שושלת היוחסין NPC (איור 4). Immunolabeling של cryosections רוחבי של hindbrain העכבר 1 יום לאחר ההזרקה BrdU עבור BrdU ו Ki67מדגים המספר ובמיקום של טיולי אופניים NPCs neuroepithelium (איור 4A, B), לפיה המספר חידוש עצמי NPCs יכולה להיות מוגדרת על-ידי חישוב אחוז Ki67+ BrdU+ תאים בין כל התאים BrdU+ (איור 4A, ג). לבסוף, אנו מראים דוגמה immunolabeling סעיפים vibratome hindbrain עבור RC2, אנטיגן של חוט הלהט ביניים עצבית ספציפית nestin, לדמיין NPC endfeet (איור 5B) ותהליכים (איור 5C). קטעים Vibratome, במקום cryosections דק, לאפשר תצפית משופרת של NPCs מסועף מאוד וגם המבנה הכללי של neuroepithelial. איור 1 : המפתח נכנס ניתוח hindbrain מעוּבּר העכבר e11.5. (A – D) תיאור סכמטי של hindbrain microdissection. (א) הרקמה ראש סימטרית יוסר על ידי ניתוק לאורך הקווים המנוקדים אדום. (B) הצלחת גג פירסינג, אז נקרע משם הן rostral והן סימטרית הכיוונים לאורך הקו האמצעי (קווים אדומים אנכי) ולאחר מכן רוחבית כדי לחשוף את neuroepithelium hindbrain. (ג) neuroepithelium זה לחטט הרחק קרומי המוח לאחר הוספת המלקחיים שבין שני המבנים, רקמות המוח האמצעי חוט השדרה מוסרות באמצעות ניתוק הרקמה עם המלקחיים לאורך הקווים המנוקדים אדום. (ד) הליך זה מניב hindbrain שעברו שיטוח. (E–K) לכידת תמונה של השלבים העיקריים בהליך hindbrain microdissection. (E) העובר הוא ערף באמצעות ניתוק לאורך הקו המנוקד. (F) hindbrain את החדרth 4, המוקפים צלחת הגג, הן טוחנות ואת הופרדו הראש באמצעות ניתוק לאורך הקווים המקווקווים. (G) הנוזליםth 4 הוא orientated כלפי מעלה לפני חור קטן היא מנוקבת על המשקולת גג (כוכבית). החור מורחב על ידי פילינג הרקמה בקפידה גם rostrally וגם הקליפה לאורך הקו האמצעי (חיצים) לחשוף את hindbrain. Hindbrain הוא ממוקם בצד pial למטה, משמאל שמתקפל לתוך הכנת ספר פתוח (H; שחור ראש החץ מצביע על רקמה עצבית hindbrain). אם hindbrain נדרשת עבור wholemount immunolabeling, קרום pial תוסר מסען בעדינות את neuroepithelium hindbrain של הממברנות של קרום המוח שמסביב באמצעות מלקחיים (אני). עודף המוח האמצעי (mb) וחוט השדרה (sc) רקמה היא שהוסר (קווים מנוקדים ב J) כדי לבודד את hindbrain (K). סרגל קנה מידה: מיקרומטר 500 עבור (E), 300 מיקרומטר עבור ( KF – ). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 2 : Wholemount immunolabeling יכול לשמש כדי לכמת NPC mitoses על פני hindbrain. (א) מפרטים טכניים הממחישות en פנים הדמיה של NPCs mitotic לשכבת hindbrain חדרית. V, hindbrain חדרית צד; P, pial hindbrain בצד. (B) סריקה אריח קונאפוקלית z ערימת hindbrain e10.5 בעקבות wholemount immunolabeling עבור mitotic סמן pHH3 (אדום). התיבה הלבנה מציינת את האזור מוצג בהגדלה גבוהה יותר בלוח השני (D). (ג) קדם “אנאפאזה” (ראש חץ לבן) ודמויות mitotic “אנאפאזה” (ראש חץ שחור) הם ניתן להבחנה בתוך קבוצה הכוללת כמובן mitotic NPCs. (D) הזמן של wholemount pHH3 תיוג של e9.5-13.5. גודל ברים: 500 מיקרומטר (B); מיקרומטר 20 ב (ג); 100 מיקרומטר (D). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3 : NPCs רכיבה על אופניים באזור נבטי שלהם ב hindbrain rostral. (א) מפרטים טכניים המתארים את המיקום של mitotic (ירוק) ו- S-פאזי (אדום) NPCs על פני חדרית hindbrain, באזור periventricular, בהתאמה. חתך וירטואלי דרך hindbrain מוצג בהגדלה גבוהה יותר בצד הימין. החץ השחור מציין את כיוון העברת צאצאי NPC זה סוגר את הדפדפן את מחזור התא לעבר אזור בידול. (B) מחסנית z קונאפוקלית של מקטע hindbrain e11.0 צף מעוּבּר קיבל ה 1 אדו הדופק; immunolabeling pHH3, עידו שימש כדי להמחיש mitotic (ירוק) ו- NPCs S-פאזי (אדום), בהתאמה. Hindbrain משטחים מסומנים על ידי קווים מנוקדים; V, hindbrain חדרית צד; P, pial hindbrain בצד. האזור שצוין על-ידי תיבה לבנה מוצג בהגדלה גבוהה יותר ב- שיבוץ; חיצים מציינים מישור המחשוף NPC ב “אנאפאזה”, ביחס השטח חדרית. (ג) ערוץ יחיד הצגת pHH3 immunolabeling בלבד. Mitotic NPCs מסומנים באמצעות חץ ציאן; העדר חטיבות הבזליים מציינים Δ. (D) ערוץ יחיד הצגת אדו תיוג בלבד. אדו+ NPCs לאמץ התפלגות pseudostratified עקב ההגירה גרעיני interkinetic שלהם. המרחק NPCs להעביר מהמשטח חדרית ניתן למדוד, כמצוין בקו הכתום מייצג. גודל ברים: 100 מיקרומטר ב (B -D); 10 מיקרומטר בשיבוץ (B). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 4 : שילוב BrdU עם Ki67 תיוג כדי לקבוע hindbrain NPC התחדשות עצמית הקיבולת. (א) z קונאפוקלית ערימת cryosection hindbrain e10.5 לאחר תיוג Ki67 (ירוק), BrdU (אדום) בעקבות יום 1 BrdU דופק. תאי זוגית-חיובי באזור חדרית הם NPCs שילבו BrdU והוא עדיין עוברים דרך מחזור התא, כמצוין על-ידי תיוג Ki67. היחס של התווית על-ידי שני תאים בין מכלל האוכלוסייה BrdU+ מייצג את אחוז עצמי המתחדש NPCs. (B, C) יחיד ערוצי הצגת Ki67 (B), BrdU (ג) immunolabeling בלבד. תא BrdU+ חסר Ki67, ולכן סביר להניח ביצע את מחזור התא מציינים לצורת ראש חץ ציאן (A,C). Hindbrain משטחים מסומנים על ידי קווים מנוקדים; V, hindbrain חדרית צד; P, pial hindbrain בצד. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 5 : Nestin immunolabeling מדמיין תהליכי NPC, endfeet. (A – C) Immunofluorescence עבור RC2, אשר מזהה את epitope על חוט הלהט ביניים עצבית nestin, מדגים NPC מורפולוגיה לרוחב neuroepithelium hindbrain. (א) מחסנית z קונאפוקלית של מקטע צף מ hindbrain e11.5 בעקבות RC2 immunolabeling; התחומים מוצגים בהגדלה גבוהה יותר ב (ב’, ב’; אזור הפסגה/חדרית) ו- (C, ג ‘; הבזליים אזור). Hindbrain משטחים מסומנים על ידי קווים מנוקדים; V, hindbrain חדרית צד; P, pial hindbrain בצד. (B, C) Z קונאפוקלית ערימות של התחומים ב- (א); מוצגים קטעים אופטי יחיד (ב’, סי ‘), בהתאמה. Endfoot הפסגה NPC מעוגן על פני חדרית מסומן על ידי חץ (ב’). NPC fasciculated ותהליכי יחיד מסומנים באמצעות ראשי חץ שחור ולבן ב (סי ‘), בהתאמה. גודל ברים: 100 מיקרומטר, (א); מיקרומטר 25 (ב, ג). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר כיצד להשתמש hindbrain עובריים את העכבר כמודל ללמוד על מנגנוני נוירוג’נסיס התפתחותית. באמצעות מגוון של שיטות שונות immunolabeling, hindbrain NPCs ניתן לאבחן, המספר שלהם לכמת בסעיפים רקמות או לאורך איבר wholemounts. הקלות של דיסקציה של האנטומיה שטוח מבטיחה hindbrain יכול לדימות בהכנה ‘ספר פתוח’ ‘ כדי לאסוף מידע על דפוסי נוירוג’נסיס איבר רחב.

בהמשך נראה כי הקשורות מחזור התא NPC מיקום ומורפולוגיה NPC, ניתן בקלות לאבחן ב צף- או cryosections של hindbrain. שתי התנהגויות עלול לנצל כדי להגדיר אוכלוסיות חדשות קדמון, כמו בעבר בוצעה ב telencephalon בתרבית של20. לדוגמה, neuroepithelia Sox2+ מעוצב-מוקדם ו Pax6+ הפסגה רדיאלי עכשיו, דונלד נוכחים hindbrain21,22, אבל hindbrain חסרה אבות הבזליים Tbr2+ 3 .

ניתן להתאים כדי לבחון את אופן הפעולה של subpopulations NPC ספציפיים על-ידי תיוג פלורסנט הדמיה חיה ו/או מעקב אחר שושלת היוחסין ברקמות קבוע גם הפרוטוקול המתואר כאן. זו יכולה להיות מושגת, לדוגמה, על ידי לימוד hindbrains של עכברים נושאת את transgene Sox1-iCreERT2 טמוקסיפן-inducible ומן הכתב Rosa26tdTomato 23.

בנוסף להעשרת הידע נוירוג’נסיס מאתר, לומד את hindbrain עשוי להבהיר מנגנונים neurogenic בהרחבה רלוונטיים המשותפים בין המינים, מכיוון hindbrain אזור המוח מאוד שנשמרת צפוי להיות דומה יותר בין המינים חוליות מאשר הקדמי.

כפי hindbrain נוירוג’נסיס מתקיים על חלון זמן יחסית קצר יותר מאשר הקדמי נוירוג’נסיס23, חשוב לשקול הצורך השוואת שלמאחה מבוים עוברי. בהתאם לכך, הטיה ניסיוני הוא נמנע על ידי ספירת להקליט מספר זוגות somite העובר לפני בידוד hindbrain שלה. הרקמה hindbrain עצמה שביר ולא צריך מלקחיים ולכן יטופל בקפידה בעת הפרדת הרקמות hindbrain מזנכימה ראש, קרומי המוח; זוג ‘תרגולים’ ולכן ייתכן רצוי לפני ניתוח יקר עוברי מתבצע ניסיון. יתר על כן, hindbrains יועבר מהצינור אחד למשנהו באמצעות פיפטה פסטר נשא רחב ולא עם מלקחיים כדי למנוע נזק (הפתיחה של פיפטה הנקבעים על ידי חיתוך של הקצה עם מספריים נקי). לבסוף, נדירה יחסית, מידת השתלבות אדו/BrdU S-פאזי NPCs עלול להיות משתנה, במיוחד במהלך פולסים קצרים (כלומר, 1 h). כדי לשפר את תיוג, להבטיח כי עידו/BrdU התפרקה כראוי לפני טעינת הפתרון לתוך המזרק, להחדיר בזהירות לתוך חלל הצפק. זריקות המסכן, כגון אלה עשויים subcutaneously בטעות, לגרום לאבד או השמנה הפתרון אדו/BrdU ולמנוע אותו מלהיכנס את זרימת הדם.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים Vasiliki Chantzara על ביצוע matings מתוזמן וצוות של יחידת המשאבים הביולוגיים-מכון עיניים של UCL עבור גידול העכבר. מחקר זה נתמך על ידי Wellcome אמון פרס החוקר 095623/Z/11/Z כדי CR.

Materials

Round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) VWR 211-2120 Also available from other commercial suppliers
Plastic cell culture dish, 60 mm Thermo Fisher 150288 Also available from other commercial suppliers
Cell culture plates, 12-well Thermo Fisher 150628 Also available from other commercial suppliers
Pasteur pipettes Copan 200C Also available from other commercial suppliers
Dumont Watchmaker forceps, no. 5 FST 91150-20
Dumont Watchmaker forceps, no. 55 FST 11295-51
29G needle/syringe BD BD Micro-Fine +1ml
Anti-phospho-histone H3 primary antibody Millipore 06-570 Goat, dilution 1:400
Anti-BrdU primary antibody Abcam ab6326 Rat, dilution 1:400
Anti-Ki67 primary antibody BD Biosciences 550609 Mouse, dilution 1:400
Anti-RC2 primary antibody Developmental Studies Hybridoma Bank RC2 Mouse (IgM), dilution 1:400
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti rabbit secondary antibody Thermo Fisher A11029 Dilution 1:200
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rabbit secondary antibody Thermo Fisher A11037 Dilution 1:200
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse IgM secondary antibody Thermo Fisher A21042 Dilution 1:200
Alexa Fluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody Thermo Fisher A11001 Dilution 1:200
Alexa Fluor 594-conjugated goat anti rat secondary antibody Thermo Fisher A11007 Dilution 1:200
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) Sigma D9542 Use at 10 μg per mL
5-ethynyl-2’-deoxyuridine (EdU) Sigma 900584
5-bromo-2´-deoxyuridine (BrdU) Sigma B5002
Click-iT EdU Alexa Fluor 594 Imaging Kit Thermo Fisher C10086
Heat-inactivated goat serum Sigma G9023
Bovine serum albumin Sigma A7906
DAKO protein-block serum free Agilent X0909
Triton X-100 Sigma T8787 Also available from other commercial suppliers
Phosphate buffer saline Sigma P4417 Also available from other commercial suppliers
Paraformaldehyde Sigma P6148 Also available from other commercial suppliers
Sodium tetraborate Sigma B9876 Also available from other commercial suppliers
Sucrose Sigma S0389 Also available from other commercial suppliers
Agarose Sigma A9539 Also available from other commercial suppliers
Super PAP pen liquid blocker Ted Pella, Inc. 22309
SlowFade Antifade Kit Thermo Fisher S-2828
Glycerol Fisher Scientific 10337700
Mowiol Millipore 475904
OCT Scigen 4583 Also available from other commercial suppliers
Isopentane Sigma M32631 Also available from other commercial suppliers
Methanol Thermo Fisher 10675112 Also available from other commercial suppliers
Hydrochloric acid Thermo Fisher 10316380 Also available from other commercial suppliers
Microscope slides VWR 631-0912
Superfrost microscope slides VWR 631-0108
Thermometer VWR 620-0858
Cover glass VWR 631-0137
Stereo Microscope, Leica MZ16 Leica not applicable
Confocal laser scanning microscope  LSM710 Zeiss not applicable
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Wilsch-Brauninger, M., Florio, M., Huttner, W. B. Neocortex expansion in development and evolution – from cell biology to single genes. Curr Opin Neurobiol. 39, 122-132 (2016).
  2. Gregg, C., Weiss, S. CNTF/LIF/gp130 receptor complex signaling maintains a VZ precursor differentiation gradient in the developing ventral forebrain. Development. 132 (3), 565-578 (2005).
  3. Kwon, G. S., Hadjantonakis, A. K. Eomes::GFP-a tool for live imaging cells of the trophoblast, primitive streak, and telencephalon in the mouse embryo. Genesis. 45 (4), 208-217 (2007).
  4. Krumlauf, R. Hox Genes and the Hindbrain: A Study in Segments. Curr Top Dev Biol. 116, 581-596 (2016).
  5. Guthrie, S. Patterning and axon guidance of cranial motor neurons. Nat Rev Neurosci. 8 (11), 859-871 (2007).
  6. Fantin, A., Vieira, J. M., Plein, A., Maden, C. H., Ruhrberg, C. The embryonic mouse hindbrain as a qualitative and quantitative model for studying the molecular and cellular mechanisms of angiogenesis. Nat Protoc. 8 (2), 418-429 (2013).
  7. Terriente, J., Gerety, S. S., Watanabe-Asaka, T., Gonzalez-Quevedo, R., Wilkinson, D. G. Signalling from hindbrain boundaries regulates neuronal clustering that patterns neurogenesis. Development. 139 (16), 2978-2987 (2012).
  8. Coolen, M., Thieffry, D., Drivenes, O., Becker, T. S., Bally-Cuif, L. miR-9 controls the timing of neurogenesis through the direct inhibition of antagonistic factors. Dev Cell. 22 (5), 1052-1064 (2012).
  9. Dias, J. M., Alekseenko, Z., Applequist, J. M., Ericson, J. Tgfbeta signaling regulates temporal neurogenesis and potency of neural stem cells in the CNS. Neuron. 84 (5), 927-939 (2014).
  10. Jacob, J., et al. Retinoid acid specifies neuronal identity through graded expression of Ascl1. Curr Biol. 23 (5), 412-418 (2013).
  11. Alexandre, P., Reugels, A. M., Barker, D., Blanc, E., Clarke, J. D. Neurons derive from the more apical daughter in asymmetric divisions in the zebrafish neural tube. Nat Neurosci. 13 (6), 673-679 (2010).
  12. Peretz, Y., et al. A new role of hindbrain boundaries as pools of neural stem/progenitor cells regulated by Sox2. BMC Biol. 14, 57 (2016).
  13. Graeden, E., Sive, H. Live imaging of the zebrafish embryonic brain by confocal microscopy. J Vis Exp. (26), (2009).
  14. Taverna, E., Haffner, C., Pepperkok, R., Huttner, W. B. A new approach to manipulate the fate of single neural stem cells in tissue. Nat Neurosci. 15 (2), 329-337 (2011).
  15. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
  16. Hutton, S. R., Pevny, L. H. SOX2 expression levels distinguish between neural progenitor populations of the developing dorsal telencephalon. Dev Biol. 352 (1), 40-47 (2011).
  17. Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M., Ansari, S., Reynolds, B. A. Establishing embryonic mouse neural stem cell culture using the neurosphere assay. J Vis Exp. (47), (2011).
  18. Sauer, F. Mitosis in the neural tube. The Journal of Comparative Neurology. 62 (2), 377-405 (1935).
  19. Sessa, A., Mao, C. A., Hadjantonakis, A. K., Klein, W. H., Broccoli, V. Tbr2 directs conversion of radial glia into basal precursors and guides neuronal amplification by indirect neurogenesis in the developing neocortex. Neuron. 60 (1), 56-69 (2008).
  20. Pilz, G. A., et al. Amplification of progenitors in the mammalian telencephalon includes a new radial glial cell type. Nat Commun. 4, 2125 (2013).
  21. Fantin, A., et al. Tissue macrophages act as cellular chaperones for vascular anastomosis downstream of VEGF-mediated endothelial tip cell induction. Blood. 116 (5), 829-840 (2010).
  22. Kayam, G., et al. A novel role for Pax6 in the segmental organization of the hindbrain. Development. 140 (10), 2190-2202 (2013).
  23. Tata, M., et al. Regulation of embryonic neurogenesis by germinal zone vasculature. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), 13414-13419 (2016).

Tags

MouseEmbryonicHindbrainNeurogenesisNeural ProgenesisDissectionUterusEmbryoFourth VentricleRoof PlateWholemount ImmunolabelingVibratomeCryosectioning

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Tata, M., Ruhrberg, C. The Mouse Hindbrain As a Model for Studying Embryonic Neurogenesis. J. Vis. Exp. (131), e56793, doi:10.3791/56793 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image