Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

मिश्रित लाइसिन प्रकार / Arginine प्रकार monomers और उनके विरोधी leishmanial गतिविधि के मूल्यांकन के साथ peptoids के संश्लेषण के लिए एक कारगर तरीका

Published: November 2, 2016 doi: 10.3791/54750
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Chemistry, Durham University, 2School of Medicine, Pharmacy and Health, Durham University

Introduction

Peptoids (या पाली एन -substituted glycines) पेप्टाइड mimetics कि पेप्टाइड्स करने के लिए इसी तरह की संपत्ति प्रदान करते हैं और इस तरह के रूप में तेजी से औषधीय और सामग्री अनुप्रयोगों के लिए जांच की जा रही के एक वर्ग के हैं। पेप्टाइड्स में, प्रत्येक अमीनो एसिड के पक्ष श्रृंखला एमाइड रीढ़ की α कार्बन से जुड़ा है; peptoids में पक्ष श्रृंखला रीढ़ की नाइट्रोजन परमाणु पर स्थानांतरित कर रहे हैं। महत्वपूर्ण बात, इस peptoids प्रोटियोलिसिस करने के लिए अधिक से अधिक प्रतिरोध देता है।

Peptoids सामान्यतः submonomer विधि जुकरमैन एट अल।, जहां peptoid monomers एक amine एक ठोस समर्थन और हैलोजन एक प्राथमिक अमाइन का उपयोग कर के बाद के विस्थापन से जुड़ी कार्यक्षमता के अनुक्रमिक haloacetylation द्वारा बनाया जा सकता है ने बीड़ा उठाया है का उपयोग कर संश्लेषित कर रहे हैं। 1 हमारे समूह ने हाल ही में विकसित किया गया है इस submonomer विधि के लिए एक अनुकूलन lysine- और arginine प्रकार peptoid अवशेषों च के लिए एक ही peptoid अनुक्रम में शामिल होने के लिए अनुमति देने के लिएirst समय। 2 यह मैनुअल ठोस चरण दृष्टिकोण संश्लेषण peptoid को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों और आम प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करता है, यह प्रयोगशालाओं के बहुमत के लिए सुलभ बना रही है। Peptoids ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया, ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया और कवक प्रजातियों है कि कई ज्ञात रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स करने के लिए तुलना कर रहे हैं की एक विस्तृत श्रृंखला के खिलाफ होनहार गतिविधियों को दिखाया गया है। 3-9

हमारे काम में, peptoids उपेक्षित उष्णकटिबंधीय रोग लीशमनियासिस के उपचार के लिए उपन्यास विरोधी संक्रामक यौगिकों के रूप में इस्तेमाल किया गया है। 5,10 Leishmaniasis दुनिया भर में 80 से अधिक देशों में स्थानिक है और यह अनुमान है कि 12 लाख से अधिक लोगों को विश्व स्तर पर संक्रमित हैं। 11 रोग प्रोटोजोआ परजीवी है कि एक sandfly के काटने से फैलता जाता है के कारण होता है। लीशमैनिया प्रजातियों त्वचीय लीशमनियासिस, एक शर्त है कि श्लेष्मा झिल्ली को scarring और नुकसान होता है, या जीवन के लिए खतरा पैदा कर सकता है आंत leishmaniasis, जो घातक अंग क्षति का कारण बनता है। कोई टीका इस बीमारी के लिए वर्तमान में उपलब्ध है और मौजूदा उपचार दवाओं है कि गंभीर साइड इफेक्ट की एक छोटी संख्या पर निर्भर हैं। इसके अलावा, मौजूदा दवाओं के लिए प्रतिरोध एक उभरती हुई और गंभीर समस्या इतनी नए उपचार सख्त प्रभावी रूप से भविष्य में लीशमनियासिस के इलाज के लिए की जरूरत है। 12-16

इन रोगाणुरोधी अनुप्रयोगों में, peptoids अक्सर cationic और हाइड्रोफोबिक monomers के एक मिश्रण के साथ amphipathic तैयार हो रहे हैं। 3,4 यह peptoids, बैक्टीरियल कोशिकाओं की ओर चयनात्मकता की एक डिग्री दे सकते हैं स्तनधारी कोशिकाओं को विषाक्तता को कम करने, और आणविक ट्रांसपोर्टरों के रूप में उनकी गतिविधि में सुधार करने के लिए । 17-20 साहित्य में विरोधी संक्रामक peptoids के बहुमत cationic पक्ष श्रृंखला है कि विशेष रूप से या तो अमीनो क्रियाशील लाइसिन प्रकार monomers या arginine प्रकार के अवशेष के शामिल होते हैं। पेप्टाइड peptoid काइमेरा, जहां cationic चेन एक के शामिल हैंMino एसिड लाइसिन या आर्जिनिन भी गतिविधि और विषाक्तता पर cationic समूहों के प्रभाव की जांच करने के लिए संश्लेषित किया गया है। 21-25

पाली lysine peptoids आसानी से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Boc संरक्षित amines का उपयोग कर संश्लेषित किया जा सकता है। पाली arginine peptoids सूचना एक विधि है जो एक एजेंट के रूप में guanidinylation pyrazole-1-carboxamidine का उपयोग करता है का उपयोग किया जा सकता है। 18 बहरहाल, यह केवल बाद peptoid राल और पक्ष श्रृंखला पर Boc सुरक्षा हटा से cleaved किया गया है किया जा सकता है, तो अनुक्रम के भीतर हर लाइसिन प्रकार अवशेषों एक arginine अवशेषों में तब्दील हो जाता है। ठीक धुन करने के प्रयास में यौगिकों के रासायनिक और जैविक गुणों, हम एक तरीका है कि दोहरी cationic कार्यक्षमता (जैसे, एन लिस और एन Arg) पहली बार के लिए किसी भी peptoid अनुक्रम में शामिल होने की अनुमति देता है विकसित की है। 2

इस के साथ साथ, हम संश्लेषण, शुद्धि और TW के लक्षण वर्णन का वर्णनओ उपन्यास peptoids कि उसी क्रम में दोनों lysine- और arginine प्रकार अवशेष होते हैं। विधि एक guanidinylation अभिकर्मक के रूप में pyrazole-1-carboxamidine साथ राल पर orthogonal एन -Boc और एन -Dde संरक्षण का उपयोग करता है। इन peptoids की जैविक मूल्यांकन भी लीशमैनिया मेक्सिकाना, त्वचीय लीशमनियासिस की प्रेरणा का एजेंट के खिलाफ cytotoxicity assays में वर्णित है। इस दोहरी cationic कार्यक्षमता के साथ peptoids उपयोग करने के लिए और उनके जैविक गतिविधि का आकलन करने के लिए एक व्यावहारिक तरीका प्रदान करता है। यह उम्मीद है कि इस विधि से भविष्य में peptoid समुदाय द्वारा amphipathic peptoids के संश्लेषण सहायता करेगा।

Protocol

Peptoids 1. ठोस चरण संश्लेषण

नोट: peptoids मैन्युअल ठोस चरण peptoid संश्लेषण की प्रक्रिया का उपयोग कर submonomer संश्लेषित कर रहे हैं। इस विधि उच्च युग्मन दक्षता और अच्छे अंतिम उत्पाद की पैदावार की अनुमति देता है। ठोस चरण पर संश्लेषण भी अनुमति देता है अतिरिक्त अभिकारकों प्रत्येक चरण के अंत में आसानी से हटाया जा रहा है और विधि यहाँ संशोधित किया गया है अलग क्रियाशील cationic monomers (यानी, arginine-प्रकार और लाइसिन प्रकार के अवशेष) की अनुमति देने के लिए एक ही भीतर शामिल किया जाना है अनुक्रम। 1,2

  1. एक रेखीय peptoid के संश्लेषण
    सावधानी: संश्लेषण शुरू करने से पहले सुरक्षा आकलन बाहर ले। एक धूआं हुड में सभी प्रतिक्रियाओं को बाहर ले जाने और उचित (यानी, डिस्पोजेबल nitrile दस्ताने, सुरक्षा चश्मा और एक प्रयोगशाला कोट) के रूप में पर्याप्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनने। जब निम्न अभिकर्मकों और सॉल्वैंट्स का उपयोग विशेष रूप से ध्यान रखना। Dimethylformamide (DMF) एक संदिग्ध teratogen और घ हैichloromethane (डीसीएम) एक कैसरजन। एन, एन '-diisopropylcarbodiimide (डीआईसी) और piperidine आंखों, त्वचा के लिए खतरनाक सांस की साँस लेना के माध्यम से कर रहे हैं, और त्वचा संवेदीकरण का कारण बन सकता है। अगर साँस Hydrazine, एक संदिग्ध कैसरजन घातक और त्वचा या आंखों को गंभीर रूप से जल का कारण बनता है। Bromoacetic एसिड भी त्वचा, आंखों और श्वसन तंत्र के लिए खतरनाक है और संपर्क पर जलता पैदा कर सकता है। Trifluoroacetic एसिड (टीएफए) एक अस्थिर तरल है और गंभीर रूप से जल इतनी देखभाल के साथ संभाल पैदा कर सकता है। भारी शुल्क दस्ताने सिफारिश कर रहे हैं।
    1. दो frits के साथ एक छाया हुआ 20 मिलीलीटर polypropylene प्रतिक्रिया पोत के लिए 0.12 छ Fmoc संरक्षित रिंक Amide राल (0.1 mmol, ठेठ लोड हो रहा है 0.7 mmol / छ) जोड़ें। 5 मिलीलीटर dimethylformamide (DMF) राल फूल और कमरे के तापमान पर कम से कम 60 मिनट के लिए खड़े करने के लिए पोत को छोड़ने के लिए जोड़ें। एक ठोस चरण निष्कर्षण वैक्यूम मंच का उपयोग DMF नाली।
    2. (/ वी वी DMF में 20%) सूजन राल पर Fmoc समूह deprotect करने के लिए, 2 मिलीलीटर piperidine समाधान जोड़ें। पोत पर रखेंकमरे के तापमान (450 आरपीएम) और एक प्रकार के बरतन मंच 5 मिनट के लिए हिला। वैक्यूम स्टेशन के माध्यम से समाधान निकालें।
      1. 2 मिलीलीटर piperidine समाधान के साथ Fmoc deprotection दोहराएँ और कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए हिला। पहले के रूप में समाधान नाली।
    3. 2 मिलीलीटर DMF जोड़ने और 30 सेकंड के लिए राल के मिश्रण से राल धो लें। DMF नाली और तीन बार दोहराएँ।
    4. एसिटिलीकरण के लिए, bromoacetic एसिड समाधान (DMF में 0.6 एम) और के 1 मिलीलीटर जोड़ें 0.2 मिलीग्राम, एन एन -diisopropylcarbodiimide समाधान (डीआईसी, DMF में 50% वी / वी)। प्रतिक्रिया पोत छोड़ दो कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए हिला। समाधान नाली और 2 मिलीलीटर DMF तीन बार के साथ राल धो लें।
    5. विस्थापन के लिए, अमाइन समाधान (DMF में 1.5 मीटर) के 1 मिलीलीटर जोड़ें। कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए राल हिला। समाधान नाली और 2 मिलीलीटर DMF तीन बार के साथ राल धो लें।
      1. एक arginine प्रकार मोनोमर जोड़ने के लिए, 1.7 कदम का पालन करें। वांछित peptoid अनुक्रम के आधार पर, अलग अलग aminesजोड़ा जाएगा।
    6. दोहराएँ 1.1.4 और 1.1.5 कदम।
    7. एक guanidine क्रियाशील मोनोमर (यानी, एन Arg) में शामिल करने के लिए, राल के लिए असुरक्षित Diamine समाधान (DMF में 1.5 मीटर) के 1 मिलीलीटर जोड़ें और कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए हिला।
      1. समाधान नाली और 2 मिलीलीटर DMF तीन बार के साथ राल धो लें।
      2. 2-acetyldimedone (0.2 ग्राम, 0.5 मिलीग्राम DMF में 1 mmol, 10 समकक्ष) मुफ्त प्राथमिक अमाइन के लिए डीडीई समूह जोड़ सकते हैं और कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए मंथन करने के लिए जोड़ें। समाधान नाली और 2 मिलीलीटर DMF तीन बार के साथ राल धो लें।
    8. submonomer संश्लेषण जारी के रूप में 1.1.7 के लिए 1.1.4 में जब तक इच्छित क्रम बना है। 2 मिलीलीटर DMF राल धोने और तीन बार दोहराने के लिए जोड़ें।
    9. राल पर डीडीई समूह deprotect करने के लिए, 4 मिलीलीटर 2% hydrazine समाधान (DMF वी / वी) जोड़ सकते हैं और कमरे के तापमान पर 3 मिनट के लिए हिला। समाधान नाली और तीन बार दोहराएँ।
    10. समाधान नाली और 2 मिलीलीटर DMF तीन टी के साथ राल धोनेIME में।
    11. Pyrazole-1-carboxamidine (प्रति मुक्त अमाइन 6 समकक्ष, यानी, प्रति एन Arg monomers, DMF की न्यूनतम मात्रा में) जोड़ें और एन, एन -diisopropylethylamine या DIPEA (प्रति मुक्त अमाइन 6 समकक्ष) और 60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर हिला ।
    12. समाधान नाली और 2 मिलीलीटर क्लोराइड तीन बार के साथ राल धो लें। 10 मिनट तो राल दरार (खंड 2) जब तक संग्रहित किया जा सकता है के लिए हवा में सूखने के लिए छोड़ दें राल।
    13. संश्लेषण रोकने के लिए, तीन बार DMF 2 मिलीलीटर के साथ राल धो लें। 2 मिलीलीटर DMF जोड़ें, संश्लेषण पोत डाट और एक धूआं हुड में कमरे के तापमान पर छोड़ दें।
      ध्यान दें: संश्लेषण के बाद किसी भी विस्थापन कदम (diketopiperazines के रूप में दूसरा विस्थापन कदम को छोड़कर का गठन किया जा सकता है) रोक दिया जा सकता है।
  2. पक्ष श्रृंखला deprotection और राल से दरार
    1. displa के बाद संश्लेषण के दौरान किसी भी बिंदु पर संश्लेषण (पवित्रता और मास) की प्रगति की जांच के लिए एक परीक्षण फोड़ना शुरूसीमेंट कदम, अतिरिक्त या डीडीई-समूह की रक्षा की या अंतिम दृश्य के बाद हटाने बना दिया गया है।
      1. एक नया 8 मिलीलीटर polypropylene fritted कारतूस में प्रतिक्रिया पोत से लगभग 10 राल मोती स्थानांतरण।
      2. Trifluoroacetic एसिड दरार कॉकटेल के 1 मिलीलीटर जोड़ें (95% TFA, 2.5% एच 2 हे, 2.5% triisopropylsilane युक्त) और कमरे के तापमान पर 90 मिनट के लिए हिला।
      3. एक 10 मिलीलीटर दौर तली फ्लास्क में fritted प्रतिक्रिया पोत का उपयोग कर राल से TFA दरार कॉकटेल फ़िल्टर।
      4. एक रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग कर दरार कॉकटेल लुप्त हो जाना और नियंत्रण रेखा एमएस या विश्लेषणात्मक एचपीएलसी को प्रस्तुत करने के लिए 1 मिलीलीटर acetonitrile / पानी में जिसके परिणामस्वरूप तेल redissolve।
    2. अंतिम दरार के लिए: संश्लेषण के लिए इस्तेमाल एक ही fritted polypropylene प्रतिक्रिया कारतूस, में टीएफए दरार कॉकटेल (95% TFA, 2.5% एच 2 हे, 2.5% triisopropylsilane) के 4 मिलीलीटर जोड़ने और पोत को कवर किया। कमरे के तापमान पर 90 मिनट के लिए हिला।
    3. फ़िल्टर वेंराल से ई TFA दरार कॉकटेल एक 50 मिलीलीटर दौर तली फ्लास्क में fritted प्रतिक्रिया पोत का उपयोग कर।
    4. एक रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग कर दरार कॉकटेल लुप्त हो जाना। टीएफए के बाद हटा दिया गया है, उत्पाद एक तेल के रूप में प्राप्त किया जाना चाहिए। इस कच्चे तेल से टीएफए को हटाने की सहायता करने के लिए, 2 एमएल निर्जल Diethyl ईथर जोड़ सकते हैं और peptoid वेग चाहिए।
      1. या तो पिपेट के माध्यम से Diethyl ईथर हटाने और त्यागने या एक रोटरी बाष्पीकरण का उपयोग कर लुप्त हो जाना। दोहराएँ Diethyl ईथर वर्षा तीन बार।
    5. 10 मिलीलीटर acetonitrile / अम्लीय पानी के घोल में कच्चे peptoid भंग (50% acetonitrile, पानी वी में 0.1% TFA / वी)। एक पूर्व तौला कंटेनर के लिए स्थानांतरण, 20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर और एक सूखे पाउडर के लिए lyophilize।

2. विशेषता और शुद्धीकरण

नोट: peptoid संश्लेषण नजर रखी जा सकती है और अंतिम peptoid एक C18 स्तंभ और एल का उपयोग कर विश्लेषणात्मक रिवर्स चरण HPLC के माध्यम से मूल्यांकनectrospray तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा एमएस)। नियंत्रण रेखा एमएस के लिए सॉल्वैंट्स के सभी एचपीएलसी सॉल्वैंट्स हौसले से तैयार किया जाना चाहिए।

  1. विश्लेषणात्मक एचपीएलसी
    1. एक छोटे से कांच की शीशी में peptoid के 1 मिलीग्राम वजन। acetonitrile की न्यूनतम मात्रा को भंग करने और पानी के साथ 1 मिलीलीटर को कमजोर करने के लिए जोड़ें। सुनिश्चित करें कि peptoid पूरी तरह से भंग कर दिया है।
    2. विश्लेषणात्मक एचपीएलसी के लिए 10 μl इंजेक्ट (सुझाव ढाल 0 - 30 मिनट, 100 से अधिक% विलायक बी जहां विलायक एक = 95% पानी, 5% acetonitrile, 0.05% TFA और विलायक बी = 95% acetonitrile, 5% पानी, 0.03% टीएफए) निर्माता के निर्देशों के अनुसार।
    3. 220 एनएम पर यूवी स्पेक्ट्रम कल्पना।
  2. ईएसआई नियंत्रण रेखा एमएस
    1. कदम 2.1.1 के रूप में 1 मिलीग्राम / एमएल peptoid समाधान करें।
    2. नियंत्रण रेखा एमएस electrospray को निर्धारित करने के लिए अगर लक्ष्य peptoid की आणविक वजन मौजूद है, निर्माता के निर्देशों का उपयोग कर 1 μl इंजेक्षन।
    3. एक pept का उपयोग कर peptoid अनुक्रम का लक्ष्य बड़े पैमाने पर जाँचकैलकुलेटर पर निर्देशों के अनुसार OID कैलकुलेटर,। 26 यह वेब उपयोगिता भी किसी भी विलोपन / इसके अलावा जन स्पेक्ट्रम में देखा उत्पादों के काम की अनुमति देता है। 26
  3. प्रारंभिक रिवर्स चरण एचपीएलसी
    1. अम्लीय 2 मिलीलीटर पानी / acetonitrile (95% पानी, 5% MeCN, 0.1% टीएफए) में कच्चे तेल की peptoids भंग और निर्माता प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए प्रारंभिक आरपी-एचपीएलसी द्वारा शुद्ध। क्षालन समय विश्लेषणात्मक एचपीएलसी और राशि इंजेक्शन स्तंभ आयाम पर निर्भर करेगा से प्राप्त द्वारा ढाल निर्धारित करते हैं।
    2. एक डिटेक्टर 220 एनएम पर सेट का उपयोग कर कल्पना।
    3. लीजिए 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में भिन्न, 20 डिग्री सेल्सियस और lyophilize पर फ्रीज।
    4. नियंत्रण रेखा एमएस और निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार विश्लेषणात्मक HPLC का उपयोग अंशों पुनः विश्लेषण। शुद्ध भिन्न recombine।

3. लीशमैनिया मेक्सिकाना परजीवी के खिलाफ जैविक परीक्षण

Caution:। सुरक्षा आकलन संश्लेषण शुरू करने से पहले बाहर किया जाना चाहिए लीशमैनिया मेक्सिकाना वर्गीकृत किया गया है ब्रिटेन और पर्याप्त नियंत्रण के उपायों में एक खतरा समूह 2 रोगज़नक़ परीक्षण शुरू करने से पहले जगह में होना चाहिए। सभी काम एक वर्ग 2 सूक्ष्मजीवविज्ञानी सुरक्षा कैबिनेट और पर्याप्त व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण उचित (यानी, nitrile दस्ताने, सुरक्षा चश्मा और एक प्रयोगशाला कोट) के रूप में पहना में बाहर किया जाना चाहिए।

  1. परजीवी की उपसंस्कृति
    1. 30 सेकंड के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में शीशी रखकर Defrost 1 मिलीलीटर -150 डिग्री सेल्सियस जमे हुए शेयर लीशमैनिया मेक्सिकाना M379।
    2. एक गैर निकाल टोपी के साथ एक 25 सेमी 3 सेल संस्कृति फ्लास्क में (पीएच 7.0 के साथ 15% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन पूरक पर) 10 मिलीलीटर श्नाइडर कीट मध्यम करने के लिए स्टॉक समाधान स्थानांतरण।
    3. 72 घंटे के लिए 26 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    4. हालत की जांच करने खुर्दबीन के नीचे परजीवी (400X बढ़ाई) की जांच करना। गुey कीट चरण promastigotes, कई कोशिकाओं को विभाजित के साथ लॉग चरण में procyclic रूपों होना चाहिए।
    5. 5 एक्स 10 5 परजीवी / एमएल हर तीन दिन की एकाग्रता के लिए उप-संवर्धन परजीवी द्वारा procyclic promastigotes बनाए रखें। एक Neubauer सुधार hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गणना।
  2. एल के परिवर्तन स्तनधारी चरण axenic amastigote प्रपत्र 27 में मेक्सिकाना कीट मंच
    1. एक 25 सेमी 3 सेल में (पीएच 7.0 के साथ 15% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन पूरक पर) 5 एक्स 10 5 परजीवी / श्नाइडर कीट मध्यम में मिलीलीटर पर लॉग चरण परजीवी के 10 मिलीलीटर संस्कृति तैयार: 0 दिवस एक गैर दिए टोपी के साथ संस्कृति कुप्पी।
    2. 48 घंटे के लिए 26 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    3. दिन 3: 5 मिनट के लिए 447 XG पर एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब और सेंट्रीफ्यूज के लिए स्थानांतरण 10 मिलीलीटर संस्कृति।
    4. पुराने मध्यम डालो और पीएच 5.5 से 20% ज के साथ पूरक पर 10 मिलीलीटर श्नाइडर कीट मध्यम (जोड़नेखाने निष्क्रिय भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन)। धीरे से एक पिपेट का उपयोग नए माध्यम में परजीवी की गोली resuspend।
    5. एक Neubauer सुधार hemocytometer का उपयोग परजीवी की संख्या की गणना। पीएच 5.5 मध्यम और एक 25 सेमी 3 सेल संस्कृति फ्लास्क हस्तांतरण के साथ 5 एक्स 10 5 परजीवी / एमएल की एकाग्रता के लिए पतला।
    6. लगभग 6 दिनों के लिए 26 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    7. दिन 9: एक माइक्रोस्कोप (400X) के तहत परजीवी जांच करते हैं। वे गैर नकल, संक्रामक metacyclic promastigote चरण में होना चाहिए।
    8. एक Neubauer सुधार hemocytometer का उपयोग परजीवी की संख्या की गणना। पीएच 5.5 माध्यम के साथ 5 एक्स 10 5 परजीवी / एमएल की एकाग्रता के लिए पतला।
    9. सेल संस्कृति के 10 मिलीलीटर निकालें और सेल संस्कृति फ्लास्क को हस्तांतरण। 5 दिनों के लिए 32 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
    10. 14 दिन: माइक्रोस्कोप (400X) के तहत परजीवी की उपस्थिति की जाँच करें। वे रोगजनक amastigote चरण में होना चाहिए, कशाभिका चरित्र की कमीpromastigotes की istic, और परख के लिए तैयार है।
  3. एल पर cytotoxicity परख मेक्सिकाना axenic amastigotes।
    नोट: peptoids का जैविक परीक्षण 96 अच्छी तरह से प्लेट में किए गए उच्च throughput assays उपयोग करता है। इस प्रोटोकॉल एल के परीक्षण का वर्णन मेक्सिकाना axenic amastigotes, लेकिन समान assays भी उचित मीडिया में promastigote चरण परजीवी पर बाहर किया जा सकता है। 60 मिनट के लिए 100 माइक्रोन के लिए और फिर एक 10 गुना कमजोर पड़ने के बाद 24 घंटे के लिए incubated - यौगिकों 3 से सांद्रता में परजीवी के साथ incubated हैं। परिणाम Resazurin आधारित सेल व्यवहार्यता समाधान (जैसे, alamarBlue) के साथ ऊष्मायन के बाद कुओं की प्रतिदीप्ति मापने के द्वारा प्राप्त कर रहे हैं।
    1. यौगिक स्टॉक समाधान तैयार करें। अंतिम शुद्ध peptoid उत्पाद एक विश्लेषणात्मक संतुलन का उपयोग कर के 1 मिलीग्राम वजन। आणविक जीव विज्ञान ग्रेड dimethylsulphoxide (DMSO) की उचित मात्रा 5 मिमी की एकाग्रता के लिए जोड़ें। 6 μl aliquots बनाओ और-20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर।
    2. 100 से 3 माइक्रोन के लिए तीन प्रतियों में 96 अच्छी तरह से प्लेट (एक सिफारिश की थाली लेआउट, परिणाम अनुभाग में देखा जा सकता है चित्रा 6) पर परिसर समाधान तैयार करें। शीर्ष पंक्ति (यानी, एक) में प्रत्येक यौगिक 5 मिमी शेयर समाधान के 2 μl जोड़ें। एक मल्टी चैनल पिपेट का उपयोग करने के लिए शीर्ष पंक्ति (पीएच 5.5 और 20% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस) पर) 48 μl ताजा श्नाइडर कीट मध्यम जोड़ें। अन्य सभी पंक्तियों के लिए 25 μl श्नाइडर कीट मध्यम जोड़ें (बी - एफ)।
      1. शीर्ष पंक्ति से pipetting 25 μl समाधान द्वारा एक धारावाहिक कमजोर पड़ने बाहर ले। नीचे पंक्ति को और मिश्रण जोड़ें। अंतिम पंक्ति है, जहां पिछले 25 μl समाधान खारिज किया जाना चाहिए जब तक dilutions बाहर ले।
      2. एक सकारात्मक नियंत्रण और DMSO (2% समाधान) तीन प्रतियों में एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में के रूप में amphotericin बी (5 मिमी स्टॉक) का प्रयोग करें।
    3. एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब और अपकेंद्रित्र में करने के लिए स्थानांतरण संस्कृति: परजीवी समाधान तैयार5 मिनट के लिए 447 XG। पुराने मध्यम डालो और 10 मिलीलीटर श्नाइडर कीट (पीएच 5.5 से और 20% FBS, 1% पी / एस) के माध्यम जोड़ें।
    4. धीरे से एक पिपेट का उपयोग नए माध्यम में परजीवी की गोली भंग करने और एक Neubauer सुधार hemocytometer का उपयोग गिनती। 8 x 10 6 परजीवी / एमएल संस्कृति पतला।
    5. 25 μl एल जोड़े प्रत्येक अच्छी तरह से मेक्सिकाना संस्कृति। 32 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए प्लेटें सेते हैं।
    6. इनक्यूबेटर से थाली निकालें और एक अच्छी तरह से 40 μl समाधान निकालने।
    7. 90 μl ताजा मध्यम जोड़ें और 32 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए सेते हैं।
    8. प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 10 μl Resazurin आधारित सेल व्यवहार्यता समाधान जोड़ें। 32 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए सेते हैं।
    9. प्रतिदीप्ति उपाय एक प्लेट रीडर का उपयोग (λ पूर्व = 540 एनएम, λ उन्हें = 600 एनएम), निर्माता के निर्देशों के अनुसार। औसत पृष्ठभूमि (मध्यम से ही कुओं) को हटाने और टी के संबंध सामान्य बनाने के बाद कुओं की प्रतिदीप्ति की तुलना द्वारा डेटा का विश्लेषणवह नियंत्रण DMSO।

Representative Results

एक प्रतिनिधि परिणाम, संश्लेषण और दो 12 अवशेषों दो लाइसिन प्रकार monomers और दो-arginine प्रकार monomers प्रत्येक वर्णित किया जाएगा युक्त peptoids के लक्षण वर्णन के रूप में। cytotoxicity परख से बाद के परिणामों को भी दिखाया गया है।

दो peptoids [(एन nArg एन spe एन एसपीई) (एन एई एन spe एन एसपीई)] 2 (क) और [(एन Harg एन spe एन एसपीई) (एन लिस एन spe एन एसपीई)] 2 (ख) संश्लेषित उपयोग कर रहे थे 120 मिलीग्राम रिंक Amide प्रत्येक (लोडिंग = 0.79 mmol / छ) राल। सभी एसिटिलीकरण और विस्थापन कदम के रूप में ऊपर वर्णित है, वाणिज्यिक खरीदा सभी अभिकर्मकों के साथ किए गए। इन अवशेषों के लिए, निम्न amines विस्थापन चरण में इस्तेमाल किया गया: एन spe (एस) - (-) - α-methylbenzylamine, एन एई एन - (tert -butoxycarbonyl) -1,2-व्यासinoethane, एन लिस एन - (tert -butoxycarbonyl) -1,4-diaminobutane। Arginine व्युत्पन्न अवशेषों के लिए, निम्न असुरक्षित diamines युग्मित गया: एन Harg 1,4-diaminobutane या एन nArg 1,2-diaminoethane, 2-acetyldimedone के साथ ऑन-राल संरक्षण के द्वारा पीछा (डीडीई-OH)। बाद पूरे अनुक्रम संश्लेषित किया गया था, डीडीई के hydrazine deprotection मुक्त करने के लिए guanidinylate amines अर्जित करता है।

आकृति 1
चित्रा 1. peptoid संरचनाओं (एक) [(एन एन nArg spe एन एसपीई) (एन एन एई spe एन एसपीई)] 2 और (ख) [(एन एन Harg spe एन एसपीई) (एन एनजी> लिस एन एन spe एसपीई)] 2। यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2। मिश्रित arginine / लाइसिन peptoids के संश्लेषण के लिए मैं विधि का इस्तेमाल किया। Diamine साथ submonomer विधि में स्टैंडर्ड विस्थापन कदम; द्वितीय। डीडीई, ओह, 90 मिनट के अतिरिक्त मुक्त अमाइन की रक्षा करने के लिए; तृतीय। इसके अलावा जोड़ submonomer विधि का उपयोग peptoid श्रृंखला का विस्तार करने के लिए; चतुर्थ। डीडीई DMF में 2% hydrazine का उपयोग करने का deprotection; । वी pyrazole-1-carboxamidine और DMF में DIPEA साथ राल पर मुक्त अमाइन की Guanidinylation; vi। राल और Boc समूहों की deprotection से अम्लीय दरार।large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

(क) 154 मिलीग्राम, (ख) 163 मिलीग्राम: राल और lyophilization से दरार के बाद कच्चे तेल उत्पादों सफेद पाउडर के रूप में प्राप्त किया गया। उत्पाद, 250 मिमी x 10 मिमी, 5 माइक्रोन एक विश्लेषणात्मक स्तंभ पर एक यूवी की तुलना डिटेक्टर (λ = 250 एनएम) के साथ एक नियंत्रण रेखा पंप का उपयोग कर अधिकतम 50 मिलीग्राम इंजेक्शन के साथ वर्णित के रूप में आरपी-एचपीएलसी के माध्यम से शुद्ध कर रहे थे; प्रवाह की दर = 2 मिलीग्राम / मिनट। लक्ष्य बड़े पैमाने पर करने के लिए इसी भिन्न संयुक्त और सफेद पाउडर के रूप में प्राप्त किया गया: (क) 54 मिलीग्राम (ख) 65 मिलीग्राम, भिन्न> 90% शुद्ध के लिए लगभग 30% के अंतिम पैदावार।

शुद्धि के बाद अंतिम यौगिक पहचान नियंत्रण रेखा एमएस (चित्रा 3 देखें) एक UPLC और एक photodiode सरणी डिटेक्टर से लैस एक ट्रिपल quadrupole मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग करके इस बात की पुष्टि कर रहे थे। सटीक मास स्पेक्ट्रोमेट्री टी पर ही स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग किया गया था वह [एम + 2H] 2 + आयनों। गणना के बाद और मनाया जनता बंद समझौते (चित्रा 4) में पाए गए हैं: (क) की गणना = 896.0026 एएमयू मनाया = 896.0038 एएमयू; (ख) की गणना = 952.0691 एएमयू मनाया = 952.0730 एएमयू।

चित्र तीन
शुद्ध peptoids के लिए चित्रा 3. नियंत्रण रेखा एमएस। (क) मी / z = 1,792 और (ख) मी / z = 1,903। जहां शीर्ष घरेलू, मध्य नियंत्रण रेखा एमएस स्पेक्ट्रम, 220 एनएम पर नीचे यूवी वर्णलेख है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा peptoids के लिए 4. सटीक मास स्पेक्ट्रोमेट्री डेटा (क) और (ख)।"Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig4large.jpg" लक्ष्य = "_blank"> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

उत्पाद पवित्रता एक विश्लेषणात्मक आरपी-एचपीएलसी का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया था (3.5 माइक्रोन, 4.6 मिमी x 100 मिमी एक विश्लेषणात्मक स्तंभ पर एक यूवी की तुलना डिटेक्टर के साथ नियंत्रण रेखा पंप, प्रवाह दर = 1 मिलीग्राम / मिनट), और 220 एनएम, absorbance कल्पना एमाइड की रीढ़ की हड्डी। चित्रा 5 ए और 5 ब पता चलता है कि यौगिकों सजातीय हैं।

चित्रा 5
शुद्ध peptoids के लिए चित्रा 5. विश्लेषणात्मक एचपीएलसी (क) और (ख)। 40 डिग्री सेल्सियस (एक = 95% एच 2 हे, 5% MeCN, 0.05 पर 30 मिनट, स्तंभ ओवन पर एक ढाल 0-100% बी नहीं है % TFA;। बी = 95% MeCN, 5% एच 2 ओ, 0.03% टीएफए) सीएल कृपयायह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ Ick।

शुद्ध peptoids (क) और (ख) एल के खिलाफ cytotoxicity assays में परीक्षण किया गया मेक्सिकाना axenic amastigotes। एल की जमी शेयरों मेक्सिकाना डीफ़्रॉस्ट और amastigote चरण परख के लिए तैयार करने के लिए तब्दील हो गया। defrosting के बाद 72 घंटे, परजीवी कई विभाजित कोशिकाओं के साथ उनके procyclic रूप में कीट चरण promastigotes, लॉग चरण में होना चाहिए। इस स्तर पर परजीवी पीएच और तापमान पाली। 27 में वर्णित परिवर्तन की 9 दिन में उपयोग करते हुए amastigote मंच के रूप में तब्दील किया जा सकता, परजीवी गैर नकल संक्रामक metacyclic promastigote चरण में होगा। 14 दिन में अंत में, परजीवी रोगजनक amastigote मंच है जहां परजीवी promastigotes की विशेषता flagella की कमी में होना चाहिए। 28

यौगिकों 5 मिमी स्टॉक समाधान सेल संस्कृति ग्रेड DMSO में बना है और पर triplicates में परीक्षण किया गयाएक मजबूत डेटा सेट सुनिश्चित करने के लिए दो अवसरों की एक न्यूनतम एकत्र किया गया था। एक प्रतिनिधि 96 अच्छी तरह से थाली योजना 6 चित्र में दिखाया गया है। परख के अंत में, सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक प्रत्येक अच्छी तरह से और प्रतिदीप्ति में जोड़ा गया था मापा गया था के रूप में प्रत्येक एकाग्रता का परीक्षण पर परजीवी की व्यवहार्यता की गणना करने के लिए वर्णित (चित्रा 7 देखें )। प्रवर्तन निदेशालय 50 मूल्यों के रूप में peptoid (एक)> 100 सुक्ष्ममापी और peptoid (ख) 37 माइक्रोन के क्रमश: गणना की गई। त्रुटि सलाखों साजिश रची, एक मानक विचलन के रूप में कुओं के बीच भिन्नता दिखाने के लिए और यह देखा जा सकता है कि इन सबसे सलाखों के लिए उचित हैं।

चित्रा 6
चित्रा 6. प्रतिनिधि 96 2 peptoid समाधान (सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण सहित) पर एक cytotoxicity परख के लिए अच्छी तरह से थाली की योजना है। मेड + = मध्यम (श्नाइडर कीट मध्यम, पीएच 5.5, 20% FBS, 1% पी / एस)। एल MEX। =मेड + 8 x 10 6 मिलीग्राम / परजीवी संस्कृति। AmphoB = DMSO में 5 मिमी। DMSO में peptoid = 5 मिमी शेयर समाधान। खाली कुओं बाँझ पानी को शामिल करना चाहिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा एल के खिलाफ cytotoxicity परख से 7. परिणाम मेक्सिकाना axenic amastigote peptoid का उपयोग कर परजीवी (क) और (ख)। यह देखा जा सकता है कि peptoid (ख) (क) दोनों यौगिकों एक खुराक निर्भर प्रभाव होने के साथ, व्यवहार्य परजीवी का प्रतिशत कम करने में peptoid की तुलना में अधिक प्रभावी है। त्रुटि सलाखों साजिश रची एक मानक विचलन के रूप में कुओं के बीच भिन्नता दिखाने के लिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Discussion

Peptoids तेजी से इस तरह के उपन्यास चिकित्सा 3-5, सेल वितरण एजेंट के रूप में रासायनिक जीव विज्ञान और अनुप्रयोगों में औषधीय रसायन विज्ञान के क्षेत्र में अध्ययन किया जा रहा 18,20 और नैदानिक उपकरण। 29 आमतौर पर, इन दृश्यों पर रोगज़नक़ के लिए चयनात्मकता की एक डिग्री प्रदान करने के लिए cationic हैं स्तनधारी कोशिकाओं, कोशिका झिल्ली के माध्यम से घुसना और भी जलीय प्रणालियों में घुलनशीलता सहायता करने की क्षमता। वहाँ cationic peptoids कि साहित्य में पूरी तरह lysine- या arginine-अनुकरण करनेवाला अवशेष होते हैं के कई उदाहरण हैं। हालांकि, आज तक, peptoids कि उसी क्रम में इन cationic अवशेषों के दोनों शामिल के संश्लेषण के लिए एक उपयुक्त सिंथेटिक प्रक्रिया के अभाव के कारण रुकावट किया गया है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल मिश्रित cationic peptoids एक कुशल तरीके से संश्लेषित करने की अनुमति देता है और बहुत ही वांछनीय है के रूप में यह amphipathic peptoids के जैविक और रासायनिक गुणों मिलाना के लिए एक मार्ग प्रदान करता है।

NT "> हमारे विधि आमतौर पर इस्तेमाल किया submonomer peptoid संश्लेषण के लिए एक अनुकूलन का उपयोग करता है और उसी क्रम के भीतर दोनों lysine- और arginine प्रकार monomers के अलावा परमिट। यह कमरे के तापमान कपलिंग उपयोग करता है और समूह के रसायन शास्त्र की रक्षा तो यह इस पद्धति है कि अनुमान है स्थापित अनुसंधान समूहों के बहुमत के लिए उपयोगी हो जाएगा। arginine प्रकार अवशेषों के लिए ओर्थोगोनल संरक्षण जोड़ने के लिए, एक असुरक्षित Diamine मानक विस्थापन की शर्तों के तहत जोड़ा और फिर सुरक्षित है साथ डीडीई ओह। diamines की एक किस्म के हो सकते हैं एक 60 मिनट का युग्मन में इस्तेमाल किया जो लंबे समय से स्थापित करने के लिए, यानी, 1,6-diaminohexane क्रमश: 1,2-diaminoethane। डीडीई की रक्षा-ओह अच्छी तरह से DMF में घुल 2 से 6 कार्बन कार्बन से पक्ष श्रृंखला की अनुमति देता है और के लिए एक बहुत ही कुशल और चयनात्मक समूह की रक्षा है प्राथमिक amines। डीडीई-सुरक्षा समूह माध्यमिक amines अप्रभावित, जैसे, peptoid श्रृंखला के असुरक्षित एन टर्मिनस छोड़ देता है। 30 एक सीमा है syn के सभी किथीसिस मैन्युअल कार्य शुरू किया गया था; हालांकि, यह अनुमान है युग्मन की स्थिति विकसित स्वचालित पेप्टाइड / peptoid सिंथेसाइज़र के साथ प्रयोग के लिए विधि उत्तरदायी बनाना है।

डीडीई-समूहों में से राल पर deprotection DMF में एक 2% hydrazine समाधान का उपयोग कर मुक्त amines कि pyrazole-1-carboxamidine का उपयोग कर राल पर guanidinylated जा सकती है छोड़ने के लिए किया जाता है। (यानी, प्रत्येक एन Arg प्रकार मोनोमर के लिए छह समकक्ष स्थापित करने के लिए) pyrazole-1-carboxamidine के छह समकक्ष और DIPEA के छह समकक्ष राल पर प्रति मुक्त अमाइन किया जाता है। फिर, यह प्रतिक्रिया भी कुशल है और pyrazole-1-carboxamidine अभिकर्मक DMF में अच्छा घुलनशीलता है। प्रतिक्रिया के पूरा होने में आम तौर पर कमरे के तापमान पर 60 मिनट के बाद नियंत्रण रेखा एमएस के माध्यम से देखा जाता है।

submonomer विधि की चंचलता को, प्राथमिक amines की एक विस्तृत विविधता विस्थापन चरण में इस्तेमाल किया जा सकता है कारण इतने शर्तों युग्मन effi बढ़ाने के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती हैदक्षता और समग्र उत्पाद पैदावार या ऊपर चर्चा दृश्यों के लिए पवित्रता। 31, कोई विशेष परिस्थितियों सफल कपलिंग के लिए आवश्यक थे। हालांकि, अब विस्थापन बार या उच्च सांद्रता अमाइन समस्याग्रस्त विस्थापन (यानी, खराब न्युक्लेओफ़िलिक या sterically भारी amines के लिए) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कुछ amines DMF में पूरी तरह से घुलनशील नहीं हो सकता है, जो मामले में यह बजाय submonomer संश्लेषण के लिए पिछले एक व्यापक विधि के रूप में एन -methyl-2-pyrrolidone (एनएमपी), या ठोस चरण प्रतिक्रियाओं के लिए अन्य उपयुक्त सॉल्वैंट्स में इन भंग करने की सिफारिश की है peptoids की। 32 monomers उस तरफ जंजीरों में असुरक्षित heteroatoms शामिल शामिल करने के लिए, chloroacetic एसिड का उपयोग एसिटिलीकरण अन्य समूहों द्वारा प्रभावी होना दिखाया गया है। 33 ही, दूसरे रेजिन अलग सी टर्मिनल functionalization साथ peptoids उपज के लिए इस विधि के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है। वांग रेजिन और 2-chlorotrityl क्लोराइड रेजिन नियमित रूप में इस्तेमाल कर रहे हैंpeptoids की submonomer संश्लेषण। उदाहरण के लिए, इस विधि को सफलतापूर्वक हमारे समूह में 2-chlorotrityl क्लोराइड राल के साथ इस्तेमाल किया गया है। रिंक Amide करने के लिए यहाँ पर चर्चा (विशिष्ट इस्तेमाल किया राल पर निर्भर) 2 अलग ठोस समर्थन करता है एक अलग लोडिंग प्रक्रिया की आवश्यकता होगी तो यह साहित्य के साथ जाँच की जानी चाहिए संश्लेषण से पहले।

पेप्टाइड संश्लेषण के लिए इसी प्रकार, राल peptoid बंद के अंतिम दरार के लिए शर्तों को भी विशिष्ट क्रम के लिए अनुकूलित किया जा सकता। इस प्रोटोकॉल में, एक TFA दरार कॉकटेल (triisopropylsilane और मैला ढोने वालों के रूप में पानी के साथ) का इस्तेमाल किया गया था। यहाँ प्रस्तुत peptoids केवल Boc संरक्षण, जो एक हद तक अस्थिर एसिड समूह है निहित। संरक्षित अवशेषों या उससे कम एसिड अस्थिर समूहों की रक्षा का एक बड़ा अनुपात के साथ दृश्यों की पूरी deprotection सुनिश्चित करने के लिए लंबे समय तक दरार बार आवश्यक हो सकता है (यानी, 2 घंटे से अधिक में दरार बार दृश्यों कि PBF या तृतीयक-बू रोकने के लिए सिफारिश कर रहे हैंTYL एस्टर संरक्षित समूहों)। वैकल्पिक मैला ढोने वालों को भी विशेष पक्ष श्रृंखला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, ethanedithiol या 2-मर्केप्टोइथेनाल अक्सर पेप्टाइड्स है कि सिस्टीन या methionine तरह सल्फर युक्त पक्ष श्रृंखला में इस्तेमाल किया जाता है)।

जैविक प्रस्तुत परख एक मानक cytotoxicity परीक्षण है जो अलग-अलग सेल लाइनों सूट करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है। यह ध्यान रखें कि प्रत्येक 96 अच्छी तरह से थाली प्राप्त परिणामों में विश्वास की अनुमति देने के लिए पर्याप्त नियंत्रण को शामिल करना चाहिए महत्वपूर्ण है। इस मामले में, amphotericin बी के रूप में यह बीमारी का इलाज करने के लिए इस्तेमाल एक ज्ञात दवा है एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है और DMSO के रूप में इस परख के लिए यौगिक शेयरों बनाने के लिए इस्तेमाल विलायक है एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है। अन्य सेल लाइनों का इस्तेमाल किया जा रहा है, विकल्प, उपयुक्त नियंत्रण प्राप्त किया जाना चाहिए और उपयोग करने से पहले पुष्टि। एल मेक्सिकाना एक घंटे के लिए 100 और 2 माइक्रोन के बीच सांद्रता में peptoid साथ incubated है, और फिर परजीवी / peptoid समाधान से पतला हैरात ऊष्मायन के लिए दस में से एक कारक है (यानी, कुओं शुरू में 100 माइक्रोन के peptoid स्टॉक के साथ 10 माइक्रोन से पतला कर रहे हैं)।

सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक परख के अंत में अच्छी तरह से प्रत्येक (कुल अच्छी तरह से मात्रा का 10%) को जोड़ा गया है। एक दृश्य रंग परिवर्तन व्यवहार्य परजीवी (गुलाबी), नियंत्रण कुओं कोई व्यवहार्य परजीवी (नीला) और व्यवहार्य परजीवी के मध्यवर्ती संख्या के साथ जो स्पेक्ट्रम के साथ साथ कुओं के बीच देखा जाता है। प्रतिदीप्ति जीवित कोशिकाओं की संख्या के अनुपात में होती है और कोशिकाओं की चयापचय क्रिया से मेल खाती है; resazurin डाई (गैर फ्लोरोसेंट) metabolically सक्रिय कोशिकाओं में कमी प्रतिक्रियाओं द्वारा फ्लोरोसेंट resorufin में बदल जाती है। 34 इस परख में, सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक के साथ ऊष्मायन समय एल के लिए अनुकूलित किया गया है मेक्सिकाना। व्यवहार्यता अभिकर्मक प्लेटों के लिए अलग अलग होंगे साथ ऊष्मायन बार अलग सेल सांद्रता में या अलग सेल लाइनों (उदाहरण के लिए इस पद्धति का भी इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ वरीयता प्राप्तस्तनधारी कोशिकाओं के साथ)। इस्तेमाल किया सटीक प्लेट रीडर पर निर्भर करता है, विचार प्रतिदीप्ति माप लिया जाता है से पहले किए जाने की जरूरत है। कुओं में किसी भी हवाई बुलबुले सुनिश्चित करने के लिए सही रीडिंग ले जाया जा सकता हटाया जाना चाहिए। कुछ पाठकों की थाली प्लेटों के नीचे, जो मामले में फ्लैट 96 अच्छी तरह प्लेटें इस्तेमाल किया जाना चाहिए तली से पढ़ें। अन्य मशीनों प्लेट के ऊपर से पढ़ सकता है, तो थाली के ढक्कन माप से पहले हटा दिया जाना चाहिए।

अंत में, भविष्य में, इस प्रोटोकॉल स्वचालित सिंथेसाइज़र है कि समानांतर में कई दृश्यों बनाने में सक्षम हैं के साथ संगत हो सकता है। इसके अतिरिक्त, चक्रीय peptoids के संश्लेषण भी इस विधि का उपयोग संभव है। इस प्रोटोकॉल एक व्यावहारिक कृत्रिम प्रक्रिया है कि दोनों lysine- और arginine प्रकार monomers, जो सामग्री या औषधीय क्षेत्रों सहित कई अनुप्रयोगों में उपयोग की जा सकती है के साथ उपन्यास peptoid scaffolds उपयोग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करना चाहिए।

Acknowledgments

हम वित्तीय सहायता के लिए इंजीनियरिंग और शारीरिक विज्ञान अनुसंधान परिषद (EPSRC) (HLB) धन्यवाद। हम भी इस प्रक्रिया के फिल्मांकन के दौरान उसकी सहायता के लिए श्रीदेवी Maalika Ramanoudjame धन्यवाद।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Polypropylene solid phase extraction cartridges with two frits Crawford Scientific 12131017 and 12131015 20 ml and 6 ml cartridges used in this preparation
Trifluoroacetic acid Tokyo Chemical Industry (Europe) T0431-100g >98%; CAUTION: can cause severe burns and respiratory irritation
N,N'-diisopropylcarbodiimide Sigma Aldrich 38370-100ML >98%; CAUTION: hazardous to eyes, skin and via respiratory inhalation, may also cause sensitisation
Dimethylformamide Fischer Scientific 10346180 HPLC grade; CAUTION: suspected teratogen
Acetonitrile Fischer Scientific 10407440 HPLC grade
Dichloromethane Fischer Scientific 10354263 99.8%; CAUTION: suspected carcinogen
Bromacetic acid Sigma Aldrich 17000-100G >99%; CAUTION: causes burns and hazardous to skin, eyes and respiratory tract
(S)-(-)-alpha methylbenzylamine Sigma Aldrich 115568-100G 98%; CAUTION: harmful if swallowed, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nspe monomer
N-Boc 1,4-diaminobutane Tokyo Chemical Industry (Europe) A1373-25g >98%; CAUTION: causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the NLys monomer
N-Boc 1,2-diaminoethane Tokyo Chemical Industry (Europe) A1371-25g >97%; CAUTION: causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nae monomer
1,2-diaminobutane Sigma Aldrich D13208-100G 99%; CAUTION: flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NhArg monomer
1,4-diaminoethane Sigma Aldrich 03550-250ML >99.5%; CAUTION: flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NnArg monomer
 
 
1H-pyrazole-1-carboxamidine HCl Sigma Aldrich 402516-10G as HCl salt; CAUTION: harmful if swallowed and may cause an allergic skin reaction, causes serious eye damage
Hydrazine monohydrate Sigma Aldrich 207942-5G reagent grade; CAUTION: suspected carcinogen, fatal if inhaled and causes severe burns to skin and eyes
2-acetyl dimedone Novabiochem 8510150005 Dde-OH
Rink Amide resin Novabiochem 8551190005 100-200 mesh, high loading
Piperidine Sigma Aldrich 411027-1L >99.5%, a controlled substance, so adequate permission must be obtained before purchase; CAUTION: highly flammable liquid and vapour, harmful if swallowed and toxic in contact with skin or if inhaled, causes severe skin burns and eye damage, harmful to aquatic life with long lasting effects
Triisopropylsilane Sigma Aldrich 233781-50G 98%; CAUTION: flammable liquid and vapour, causes skin irritation and serious eye irritation
alamarBlue ThermoFischer  DAL1025 Not classified as hazardous
Schneider's Insect Medium Sigma Aldrich S9895-1L Powdered, medium must be made prior to use following manafacturers instructions; allow to warm to room temperature before use in biological assays
96 well plates VWR 734-1793 Flat bottom (to allow fluorescence measurement from the bottom), tissue-culture treated
Solvent reservoirs VWR 613-1182 Used with multi channel pipette
Multi channel pipette Eppendorf 3122000043
Pipette tips Starlab Group S1111-3810, S1113-1810, S1111-6810 Volume of tip dependent on pipette used. 10 µl, 10 - 200 µl and 1,000 µl recommended for assays
25 cm3 cell culture flasks VWR 734-2312
50 ml centrifuge tubes VWR 525-0791
dimethylsulphoxide (molecular biology grade) Sigma Aldrich D8418-50ML Not classified as hazardous
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum ThermoFischer  10082139-100mL Gibco
Penicillin/Streptomycin ThermoFischer  15140148-20mL Abbreviation: P/S
Amphotericin B Sigma Aldrich 46006-100mg Amphotericin B trihydrate, VetranalTM analytical standard

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. Efficient method for the preparation of peptoids oligo(N-substituted glycines) by submonomer solid-phase synthesis. J. Am. Chem. Soc. 114, 10646-10647 (1992).
  2. Bolt, H. L., Cobb, S. L. A practical method for the synthesis of peptoids containing both lysine-type and arginine-type monomers. Org. Biomol. Chem. 14, 1211-1215 (2016).
  3. Mojsoska, B., Zuckermann, R. N., Jenssen, H. Structure-activity relationship study of novel peptoids that mimic the structure of antimicrobial peptides. Antimicrob Agents Chemother. , (2015).
  4. Chongsiriwatana, N. P., et al. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 2794-2799 (2008).
  5. Eggimann, G. A., Bolt, H. L., Denny, P. W., Cobb, S. L. Investigating the Anti-leishmanial Effects of Linear Peptoids. Chem Med Chem. 10, 233-237 (2015).
  6. Kapoor, R., et al. Antimicrobial Peptoids Are Effective against Pseudomonas aeruginosa Biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 3054-3057 (2011).
  7. Ryge, T. S., Frimodt-Moller, N., Hansen, P. R. Antimicrobial activities of twenty lysine-peptoid hybrids against clinically relevant bacteria and fungi. Chemotherapy. 54, 152-156 (2008).
  8. Huang, M. L., Benson, M. A., Shin, S. B. Y., Torres, V. J., Kirshenbaum, K. Amphiphilic Cyclic Peptoids That Exhibit Antimicrobial Activity by Disrupting Staphylococcus aureus Membranes. Eur. J. Org. Chem. , 3560-3566 (2013).
  9. Huang, M. L., Shin, S. B. Y., Benson, M. A., Torres, V. J., Kirshenbaum, K. A Comparison of Linear and Cyclic Peptoid Oligomers as Potent Antimicrobial Agents. Chem Med Chem. 7, 114-122 (2012).
  10. Bolt, H. L., Eggimann, G. A., Denny, P. W., Cobb, S. L. Enlarging the Chemical Space of Anti-leishmanials: a Structure-Activity Relationship Study of Peptoids against Leishmania mexicana, a Causative Agent of Cutaneous Leishmaniasis. Med Chem Comm. , (2016).
  11. The World Health Organisation. Leishmaniasis. , Available from: http://www.who.int/leishmaniasis/en/ (2016).
  12. Chon, S. Y., et al. Antibiotic overuse and resistance in dermatology. Dermatologic therapy. 25, 55-69 (2012).
  13. Alvar, J., et al. Leishmaniasis Worldwide and Global Estimates of Its Incidence. PLOS ONE. 7, (2012).
  14. Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A. Chemotherapy of trypanosomiases and leishmaniasis. Trends Parasitol. 21, 508-512 (2005).
  15. Kedzierski, L. Leishmaniasis Vaccine: Where are We Today? J Global Infect Dis. 2, 177-185 (2010).
  16. Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. Drug resistance in leishmaniasis. Clin Microbiol Rev. 19, 111-126 (2006).
  17. Huang, W., et al. Learning from Host-Defense Peptides: Cationic, Amphipathic Peptoids with Potent Anticancer Activity. PLOS ONE. 9, (2014).
  18. Wender, P. A., et al. The Design, Synthesis, and Evaluation of Molecules That Enable or Enhance Cellular Uptake: Peptoid Molecular Transporters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 13003-13008 (2000).
  19. Schröder, T., et al. Peptoidic Amino- and Guanidinium-Carrier Systems: Targeted Drug Delivery into the Cell Cytosol or the Nucleus. J. Med. Chem. 51, 376-379 (2008).
  20. Kömel, D. K., et al. Cell-penetrating peptoids: Introduction of novel cationic side chains. Eur. J. Med. Chem. 79, 231-243 (2014).
  21. Hein-Kristensen, L., Knapp, K. M., Franzyk, H., Gram, L. Bacterial membrane activity of α-peptide/β-peptoid chimeras: Influence of amino acid composition and chain length on the activity against different bacterial strains. BMC Microbiology. 11, 1-12 (2011).
  22. Su, Y., Doherty, T., Waring, A. J., Ruchala, P., Hong, M. Roles of Arginine and Lysine Residues in the Translocation of a Cell-Penetrating Peptide from (13)C, (31)P and (19)F Solid-State NMR. Biochem. 48, 4587-4595 (2009).
  23. Andreev, K., et al. Guanidino groups greatly enhance the action of antimicrobial peptidomimetics against bacterial cytoplasmic membranes. BBA Biomembranes. 1838, 2492-2502 (2014).
  24. Foged, C., et al. Cellular uptake and membrane-destabilising properties of alpha-peptide/beta-peptoid chimeras: lessons for the design of new cell-penetrating peptides. BBA Biomembranes. 1778, 2487-2495 (2008).
  25. Vedel, L., et al. Antiplasmodial and prehemolytic activities of alpha-peptide-beta-peptoid chimeras. Chem Bio Chem. 8, 1781-1784 (2007).
  26. Lear, S., Cobb, S. L. Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment. J Computer-Aided Mol Des. , 1-7 (2016).
  27. Bates, P. A. Complete developmental cycle of Leishmania mexicana in axenic culture. Parasitol. 108, 1-9 (1994).
  28. Gossage, S. M., Rogers, M. E., Bates, P. A. Two separate growth phases during the development of Leishmania in sand flies: implications for understanding the life cycle. Int J Parasitology. 33, 1027-1034 (2003).
  29. Seo, J., Lee, B. C., Zuckermann, R. N., et al. Comp Biomaterials. Ducheyne, P., et al. 2, Elsevier. 53-76 (2011).
  30. Nash, I. A., Bycroft, B. W., Chan, W. C. Dde - A selective primary amine protecting group: A facile solid phase synthetic approach to polyamine conjugates. Tetrahedron Lett. 37, 2625-2628 (1996).
  31. Culf, A. S., Ouellette, R. J. Solid-phase synthesis of N-substituted glycine oligomers (alpha-peptoids) and derivatives. Molecules. 15, 5282-5335 (2010).
  32. Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets. J Vis Exp. , e3373 (2011).
  33. Burkoth, T. S., Fafarman, A. T., Charych, D. H., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Incorporation of unprotected heterocyclic side chains into peptoid oligomers via solid-phase submonomer synthesis. J. Am. Chem. Soc. 125, 8841-8845 (2003).
  34. Nakayama, G. R., Caton, M. C., Nova, M. P., Parandoosh, Z. Assessment of the Alamar Blue assay for cellular growth and viability in vitro. J Immunol Methods. 204, 205-208 (1997).

Tags

जैव रसायन अंक 117 peptoid संश्लेषण arginine मोनोमर लाइसिन मोनोमर amphipathic परजीवी Leishmaniasis
मिश्रित लाइसिन प्रकार / Arginine प्रकार monomers और उनके विरोधी leishmanial गतिविधि के मूल्यांकन के साथ peptoids के संश्लेषण के लिए एक कारगर तरीका
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bolt, H. L., Denny, P. W., Cobb, S.… More

Bolt, H. L., Denny, P. W., Cobb, S. L. An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity. J. Vis. Exp. (117), e54750, doi:10.3791/54750 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter