JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Bioquímica

En effektiv metode for syntese av Peptoids med Mixed Lysin-type / Arginin-type Monomerer og evaluering av deres anti-leishmanial aktivitet

Published: November 02, 2016
doi:
10.3791/54750
, ,
1Department of Chemistry,Durham University, 2School of Medicine, Pharmacy and Health,Durham University

Summary

A protocol to synthesize peptoids with mixed cationic functionality in the same sequence is presented (lysine- and arginine-type monomers). Subsequent testing of these compounds against Leishmania mexicana, the protozoan parasites that cause cutaneous leishmaniasis, is also described.

Abstract

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this procedure amino functionalized ‘lysine’ and guanido functionalized ‘arginine’ peptoid monomers can be included within the same peptoid sequence. This procedure uses on-resin (N-(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)ethyl) or Dde protection, orthogonal conditions to the Boc protection of lysine monomers. Subsequent deprotection allows an efficient on-resin guanidinylation reaction to form the arginine residues. The procedure is compatible with the commonly used submonomer method of peptoid synthesis, allowing simple peptoids to be made using common laboratory equipment and commercially available reagents. The representative synthesis, purification and characterization of two mixed peptoids is described. The evaluation of these compounds as potential anti-infectives in screening assays against Leishmania mexicana is also described. The protozoan parasite L. mexicana is a causative agent of cutaneous leishmaniasis, a neglected tropical disease that affects up to 12 million people worldwide.

Introduction

Peptoids (eller poly- N-substituerte glycines) er en klasse av peptid-etterligninger som tilbyr tilsvarende egenskaper til peptider og som sådan er i økende grad undersøkt for legemidler og materialer applikasjoner. I peptider, er sidekjeden av hver aminosyre koblet til α-karbonet av amidet ryggraden; i peptoids sidekjedene er forskjøvet inn på nitrogenatom i ryggraden. Avgjørende, gir dette peptoids større motstand mot proteolyse.

Peptoids er vanligvis syntetisert ved hjelp av submonomer metode utviklet av Zuckermann et al., Hvor peptoid monomerer kan bygges ved sekvensiell haloacetylation av et amin-funksjonalitet festet til en fast bærer, og etterfølgende fortrengning av halogenet ved hjelp av et primært amin. 1 Vår gruppe har nylig utviklet en tilpasning til denne submonomer metoden for å tillate lysin og arginin-type peptoid rester å være innbefattet innenfor de samme peptoid sekvensen for first tid. 2 Denne håndboken fast-fase tilnærming til peptoid syntese bruker kommersielt tilgjengelige reagenser og felles laboratorieutstyr, som gjør den tilgjengelig for de fleste laboratorier. Peptoids har vist seg å ha lovende aktivitet mot et bredt spekter av Gram-negative bakterier, Gram-positive bakterier og sopp-arter som er sammenlignbare med mange kjente antimikrobielle peptider. 3-9

I vårt arbeid, har peptoids blitt brukt som nye anti-infeksiøse forbindelser for behandling av forsømte tropiske sykdommen leishmaniasis. 5,10 Leishmaniasis er endemisk i mer enn 80 land over hele verden, og det er anslått at over 12 millioner mennesker er smittet på verdensbasis. 11 sykdommen er forårsaket av protozo parasitter som overføres ved bitt av en sandfly. Leishmania arter kan forårsake kutan leishmaniasis, en tilstand som fører til arrdannelse og skade på slimhinner, eller livstruende visceral leishmaniasis, noe som fører til fatale organskade. Ingen vaksine er tilgjengelig for denne sykdommen og eksisterende behandlinger stole på et lite antall legemidler som har alvorlige bivirkninger. I tillegg er motstand mot eksisterende legemidler en ny og alvorlig problem så nye behandlinger er desperat behov for å effektivt behandle leishmaniasis i fremtiden. 12-16

I disse antimikrobielle anvendelser er peptoids ofte utformet for å være amfipatisk med en blanding av kationisk og hydrofobe monomerer. 3,4 Dette kan gi peptoids en grad av selektivitet mot bakterieceller, redusere toksisitet overfor pattedyrceller, og for å forbedre deres aktivitet som molekylære transportører . 17-20 flertallet av antiinfektive peptoids i litteraturen inneholde kationiske sidekjeder som utelukkende består av enten aminofunksjonalisert lysin-type monomerer eller arginin-type rester. Peptid-peptoid kimærer, hvor de kationiske kjedene er omfattet av enmino syrer lysin eller arginin, er også blitt syntetisert for å undersøke effekten av kationiske grupper på aktivitet og toksisitet. 21-25

Poly-lysin peptoids kan lett syntetiseres ved hjelp av kommersielt tilgjengelige Boc-beskyttede aminer. De poly-arginin peptoids rapporterte kan gjøres ved hjelp av en metode som benytter pyrazol-1-karboksamidin som et guanidinylation middel. 18 Dette kan imidlertid bare foretas etter at peptoid er blitt spaltet fra harpiksen og Boc-beskyttelse av sidekjeder fjernes, så hver lysin-type rester innenfor sekvensen er forvandlet til en argininrest. I et forsøk på å finjustere de kjemiske og biologiske egenskapene til forbindelsene, har vi utviklet en metode som gjør det mulig med to kationiske funksjonalitet (for eksempel N-Lys og Arg N) som skal inngå i en hvilken som helst gitt peptoid sekvens for første gang. 2

Heri beskriver vi syntese, rensing og karakterisering av two nye peptoids som inneholder både lysin og arginin-type rester i den samme sekvens. Metoden bruker ortogonale N-Boc og N -Dde beskyttelse på harpiks med pyrazol-1-carboxamidine som guanidinylation reagens. Den biologiske evaluering av disse peptoids er også beskrevet i cytotoksisitetsassayer mot Leishmania mexicana, den utløsende agent for kutan leishmaniasis. Dette tilveiebringer en praktisk fremgangsmåte for å få tilgang til peptoids med dobbelt kationisk funksjonalitet og for å vurdere deres biologiske aktivitet. Det er forventet at denne metoden vil hjelpe syntesen av amphipathic peptoids av peptoid samfunnet i fremtiden.

Protocol

1. Fast-fase syntese av Peptoids MERK: Peptoids syntetiseres manuelt ved hjelp av submonomer prosedyren av fast-fase peptoid syntese. Denne metoden gir høy kopling effektivitet og gode endelige produktutbytte. Syntese av fast-fase tillater også overskytende reaktanter kan fjernes enkelt ved slutten av hvert trinn, og fremgangsmåten har blitt modifisert her for å tillate ulike funksjonaliserte kationiske monomerer (dvs. arginin-type og lysin-type rester) som skal inkluderes i den samme sekvens. 1,2 Syntese av en lineær peptoid Forsiktig: Gjennomføre sikkerhetsvurderinger før du starter syntese. Utføre alle reaksjoner i et avtrekksskap og slitasje egnet personlig verneutstyr etter behov (dvs. disponibel nitrilhansker, vernebriller og laboratoriefrakk). Vær spesielt forsiktig når du bruker følgende reagenser og løsningsmidler. Dimetylformamid (DMF) er en mistanke om teratogen og dichloromethane (DCM) er et kreftfremkallende. N, N 'diisopropylkarbodiimid (DIC) og piperidine er farlig for øynene, huden, via luft innånding og kan forårsake hudsensibilisering. Hydrazin er en mistenkt kreftfremkallende, dødelig ved innånding og forårsaker alvorlige brannskader på hud og øyne. Bromeddiksyre er også farlig for hud, øyne og luftveier og forårsake brannskader ved kontakt. Trifluoreddiksyre (TFA) er en flyktig væske og kan forårsake alvorlige brannskader, så vær forsiktig. Kraftige hansker anbefales. Legg 0,12 g Fmoc-beskyttet Rink Amid resin (0,1 mmol, typisk laste- 0,7 mmol / g) til en avkortet 20 ml polypropylen-reaksjonsbeholder med to fritter. Tilsett 5 ml dimetylformamid (DMF) for å svelle harpiksen og la beholderen stå i minst 60 minutter ved romtemperatur. Drenere DMF ved anvendelse av en fast-fase ekstraksjon vakuum plattform. Å avbeskytte Fmoc-gruppen på den svellede harpiks, tilsett 2 ml piperidin-løsning (20% i DMF v / v). Plasser beholderen påen risteplattform ved romtemperatur (450 rpm) og rystes i 5 min. Fjern løsningen via vakuum stasjon. Gjenta Fmoc-avbeskyttelse med 2 ml piperidin og oppløsningen rystes i 15 minutter ved romtemperatur. Drain løsningen som før. Vask harpiksen ved tilsetning av 2 ml DMF og blande harpiksen i 30 sek. Tapp av DMF og gjenta tre ganger. For acetylering, tilsett 1 ml bromeddiksyre-løsning (0,6 M i DMF) og 0,2 ml N, N'-diisopropylkarbodiimid oppløsning (DIC, 50% i DMF v / v). La reaksjonsbeholder for å riste i 20 minutter ved romtemperatur. Drain løsningen og vask harpiksen med 2 ml DMF tre ganger. For forskyvning, tilsett 1 ml av aminløsning (1,5 M i DMF). Rist harpiksen i 60 minutter ved romtemperatur. Drain løsningen og vask harpiksen med 2 ml DMF tre ganger. For å legge til en arginin-type monomer, følg trinn 1.7. Avhengig av den ønskede peptoid sekvens, forskjellige aminervil bli lagt til. Gjenta trinn 1.1.4 og 1.1.5. For å inkludere et guanidin funksjonalisert monomer (dvs. N Arg), tilsett 1 ml ubeskyttet diamin-løsning (1,5 M i DMF) til harpiksen og rist i 60 min ved romtemperatur. Drain løsningen og vask harpiksen med 2 ml DMF tre ganger. Tilsett 2-acetyldimedone (0,2 g, 1 mmol i 0,5 ml DMF, 10 ekvivalenter) for å legge til Dde gruppen til det frie primære amin og det hele rystes i 60 minutter ved romtemperatur. Drain løsningen og vask harpiksen med 2 ml DMF tre ganger. Fortsett submonomer syntese som i 1.1.4 til 1.1.7 til ønsket sekvens er gjort. Tilsett 2 ml DMF for å vaske harpiksen og gjentas tre ganger. For å avbeskytte den Dde gruppen på harpiks, tilsett 4 ml 2% hydrazin-oppløsning (i DMF v / v) og ryste i 3 minutter ved romtemperatur. Drain løsningen og gjenta tre ganger. Drain løsningen og vask harpiksen med 2 ml DMF tre tIME. Legg pyrazol-1-karboksamidin (6 ekvivalenter pr fritt amin, dvs. N pr Arg monomerer, i et minimalt volum DMF) og N, N-diisopropyletylamin eller DIPEA (6 ekvivalenter pr fritt amin) og ristes ved romtemperatur i 60 min . Drain løsningen og vask harpiksen med 2 ml diklormetan tre ganger. La harpiksen til å tørke i luft i 10 minutter og deretter harpiksen kan lagres inntil spaltning (seksjon 2). Hvis du vil stanse syntese, vask harpiksen med 2 ml DMF tre ganger. Tilsett 2 ml DMF, proppen syntesen fartøyet og la ved romtemperatur i et avtrekk. MERK: Syntesen kan bli stanset etter en eventuell forskyvning trinn (unntatt andre trinnet som diketopiperaziner kan dannes). Sidekjede-avbeskyttelse og spalting fra harpiks Foreta en test henge fast sjekke fremdriften av syntese (renhet og masse) på noe tidspunkt under syntesen etter displasement trinn, tilsetning eller fjerning av Dde-beskyttende gruppe, eller etter at den endelige sekvensen har blitt gjort. Overfør ca. 10 harpiks perler fra reaksjonsbeholderen inn i en ny 8 ml polypropylen frittet patron. Tilsett 1 ml trifluoreddiksyre Kløyvingsblandingen (inneholdende 95% TFA, 2,5% H2O, 2,5% triisopropylsilan) og rist i 90 min ved romtemperatur. Filtrer TFA-spaltning cocktail fra harpiksen ved hjelp av frittet reaksjonsbeholderen i en 10 ml rundbunnet kolbe. Fordamp Kløyvingsblandingen ved anvendelse av en rotasjonsfordamper og gjenoppløse den resulterende oljen i 1 ml acetonitril / vann for tilførsel til LC-MS eller analytisk HPLC. For den endelige spaltning: i samme frittet polypropylen reaksjon patron som brukes for syntese, tilsett 4 ml TFA-spaltning cocktail (95% TFA, 2,5% H2O, 2,5% triisopropylsilan) og dekk i fartøyet. Riste i 90 minutter ved romtemperatur. filter the TFA Kløyvingsblandingen fra harpiksen ved hjelp av frittet reaksjonsbeholderen inn i en 50 ml rundbunnet kolbe. Fordamp Kløyvingsblandingen ved anvendelse av en rotasjonsfordamper. Etter TFA-er fjernet, skal produktet oppnådd som en olje. For å hjelpe TFA fjernet fra denne råolje, tilsett 2 ml vannfri dietyleter, og den peptoid skal utfelles. Enten fjerne dietyleter via pipette og kast eller fordampe ved anvendelse av en rotasjonsfordamper. Gjenta dietyleter utfelling tre ganger. Oppløs den urene peptoid i 10 ml acetonitril / vann surgjort oppløsning (50% acetonitril, 0,1% TFA i vann v / v). Overføring til en på forhånd veiede beholder, fryse ved 20 ° C og lyofilisere til et tørt pulver. 2. Karakterisering og rensing MERK: peptoid syntese kan overvåkes og den endelige peptoid vurdert gjennom analytisk revers-fase HPLC ved anvendelse av en C18-kolonne og electrospray væske-kromatografi-massespektrometri (LC-MS). Alle HPLC løsemidler av løsemidler for LC-MS bør tilberedes. analytisk HPLC Vei 1 mg peptoid i en liten glassflaske. Legge til et minimalt volum acetonitril for å løse opp og fortynne til 1 ml med vann. Sørg for at peptoid er helt oppløst. Injiser 10 ul til analytisk HPLC (antydet gradient 0 – 100% løsningsmiddel B over 30 min, hvor løsningsmiddel A = 95% vann, 5% acetonitril, 0,05% TFA og løsningsmiddel B = 95% acetonitril, 5% vann, 0,03% TFA) , som i henhold til produsentens instruksjoner. Visualiser UV-spekteret ved 220 nm. ESI LC-MS Lag 1 mg / ml peptoid løsning som i trinn 2.1.1. Injiser 1 mL til elektro LC-MS for å bestemme om molekylvekten av målet peptoid er til stede, ved bruk av produsentens instruksjoner. Kontroller målet for massen av peptoid sekvensen ved hjelp av et PeptOID kalkulator, som per instruksjonene på kalkulatoren. 26 Denne nett verktøyet lar også tildelingen av eventuell sletting / tilsetningsprodukter sett i massespekteret. 26 Preparativ revers fase HPLC Oppløs råolje peptoids i 2 ml surgjort vann / acetonitril (95% vann, 5% MeCN, 0,1% TFA) og rens ved preparativ RP-HPLC ved anvendelse av produsentens protokoll. Bestemme gradienten ved eluering tid oppnådd fra analytisk HPLC og den injiserte mengde vil være avhengig av kolonnedimensjoner på. Visualisere ved hjelp av en detektor innstilt ved 220 nm. Utlevering fraksjoner i 15 ml sentrifugerør, fryse ved 20 ° C og Lyofiliser. Re-analysere fraksjoner ved hjelp av LC-MS og analytisk HPLC i henhold til produsentens protokoll. Rekombinerer rensede fraksjoner. 3. Biologisk testing mot Leishmania mexicana Parasitter Causjon. Sikkerhetsvurderinger skal gjennomføres før syntese Leishmania mexicana er klassifisert en fare gruppe 2 patogen i Storbritannia og tilstrekkelige kontrolltiltak må være på plass før du starter testing. Alt arbeid skal utføres i en klasse 2 mikrobiologisk sikkerhetskabinett og tilstrekkelig personlig verneutstyr brukes etter behov (dvs. nitril hansker, vernebriller og laboratoriefrakk). Subkultur av parasitter Tine en ml -150 ° C frossen lager Leishmania mexicana M379 ved å plassere flasken i en 37 ° C vannbad i 30 sek. Overfør stamløsning på 10 ml Schneider Insect medium (ved pH 7,0 supplementert med 15% varme-inaktivert føtalt bovint serum og 1% penicillin / streptomycin) i en 25 cm3 kolbe cellekultur med en ikke-ventilert hette. Inkuber ved 26 ° C i 72 timer. Undersøk parasitter henhold mikroskop (400X forstørrelse) for å sjekke tilstanden. they bør være insektscene promastigotes, procyclic former i log fase med mange dele celler. Oppretthold procyclic promastigotes av sub-dyrkning parasitter til en konsentrasjon på 5 x 10 5 parasitter / ml hver tredje dag. Telle celler ved hjelp av et Neubauer forbedret hemocytometer. Transformasjon av L. mexicana insekt scenen i pattedyr scenen axenic amastigote skjema 27 Dag 0: Fremstill 10 ml kultur av log trinns parasitter på 5 x 10 5 parasitter / ml i Schneider Insect medium (ved pH 7,0 supplementert med 15% varme-inaktivert føtalt bovint serum og 1% penicillin / streptomycin) i en 25 cm 3 celle kulturflaske med en ikke-ventilert hette. Inkuber ved 26 ° C i 48 timer. Dag 3: Overfør 10 ml kultur til et 50 ml sentrifugerør og sentrifuger ved 447 xg i 5 minutter. Hell av gammelt medium og tilsett 10 ml Schneiders Insect medium (ved pH 5,5 supplert med 20% hspise-inaktivert føtalt bovint serum og 1% penicillin / streptomycin). Forsiktig resuspender pelleten av parasitter i det nye mediet ved hjelp av en pipette. Tell antall parasitter ved hjelp av en Neubauer forbedret hemocytometer. Fortynn til en konsentrasjon på 5 x 10 5 parasitter / ml med pH 5,5 medium og overføring til en 25 cm3 kolbe cellekultur. Inkuber ved 26 ° C i ca. 6 dager. Dag 9: Undersøk parasitter under et mikroskop (400X). De bør være i den ikke-replikerende, infeksiøs metacyclic promastigote stadium. Tell antall parasitter ved hjelp av en Neubauer forbedret hemocytometer. Fortynn til en konsentrasjon på 5 x 10 5 parasitter / ml med pH 5,5 medium. Fjern 10 ml av cellekultur og overføres til cellekulturflaske. Inkuber ved 32 ° C i 5 dager. Dag 14: Sjekk utseende parasitter under mikroskopet (400X). De bør være i patogene amastigote scenen, mangler flagellen karakterOppgangen av promastigotes, og klar for analyse. Cytotoksisitet analysen på L. Mexicana axenic amastigotes. MERK: biologisk testing av peptoids bruker high-throughput analyser utført i 96 brønners plater. Denne protokollen beskriver testing av L. Mexicana axenic amastigotes, men identiske analyser kan også utføres på promastigote scenen parasitter i aktuelle medier. Forbindelsene blir inkubert med parasitter ved konsentrasjoner fra 3 – 100 uM i 60 minutter og deretter inkubert i 24 timer etter en 10 gangers fortynning. Resultatene er oppnådd ved å måle fluorescensen av brønner etter inkubasjon med Resazurin-baserte cellelevedyktighet løsning (f.eks alamarBlue). Forbered sammensatte stamløsninger. Vei opp 1 mg av det endelige rensede peptoid produktet ved hjelp av en analytisk vekt. Tilsett passende mengde molekylær biologi karakter dimetylsulfoksyd (DMSO) til en konsentrasjon på 5 mM. Gjør 6 ul porsjoner ogfryse ved -20 ° C. Forbered sammensatte løsninger på 96 brønners plater (en anbefalt plate layout kan sees i resultatene delen, figur 6) i tre eksemplarer 100-3 mikrometer. Tilsett 2 pl 5 mM stamløsning av hver forbindelse i den øverste raden (dvs. A). Legg 48 ul frisk Schneider Insect medium (ved pH 5,5 og 20% ​​føtalt bovint serum (FBS), 1% penicillin / streptomycin (P / S)) til øverste rad ved hjelp av en multikanal pipette. Legg 25 mL Schneiders Insect medium til alle andre radene (B – F). Gjennomføre en seriell fortynning ved pipettering 25 mL løsning fra den øverste raden. Legg til rad under og bland. Gjennomføre fortynninger til siste rad, hvor de siste 25 mikroliter oppløsning skal kastes. Bruk amfotericin B (5 mM aksjer) som en positiv kontroll og DMSO (2% løsning) som en negativ kontroll i tre eksemplarer. Forbered parasitt løsning: overføre kulturen til et 50 ml sentrifugerør og sentrifuger ved447 x g i 5 min. Hell av gammelt medium og tilsett 10 ml Schneiders Insect medium (ved pH 5,5 og 20% ​​FBS, 1% P / S). Forsiktig oppløse pellet av parasitter i det nye mediet ved hjelp av en pipette og telle ved hjelp av et Neubauer forbedret hemocytometer. Spe kultur til 8 x 10 6 parasitter / ml. Legg 25 mL L. mexicana kultur til hver brønn. Inkuber platene i 60 minutter ved 32 ° C. Fjern platen fra inkubatoren og fjerne 40 ul løsning fra hver brønn. Legg 90 mL friskt medium og inkuberes i 24 timer ved 32 ° C. Tilsett 10 mL Resazurin-baserte cellelevedyktighet løsning til hver brønn. Inkuber i 4 timer ved 32 ° C. Mål fluorescens med en plateleser (λ ex = 540 nm, λ em = 600 nm), som per produsentens instruksjoner. Analysere data ved å fjerne gjennomsnitt bakgrunn (fra medium kun brønner) og sammenligne fluorescensen av brønner etter normalisering med hensyn til than DMSO kontroller.

Representative Results

Som et representativt resultat, syntese og karakterisering av to 12 rester peptoids inneholdende to lysin-type monomerer og to-arginin typen monomerer som hver skal beskrives. De etterfølgende resultater fra cytotoksisitet assay er også vist. To peptoids [(N Narg N spe N SPE) (N ae N spe N spe)] 2 (a) og [(N hArg N spe N SPE) (N Lys N spe N spe)] 2 (b) ble syntetisert ved hjelp 120 mg Rink amid harpiks hver (lasting = 0,79 mmol / g). Alle acetylering og forskyvningstrinn ble utført som beskrevet ovenfor, med alle reagensene kjøpt kommersielt. For disse rester, ble de følgende aminer anvendes i fortrengningstrinnet: N spe (S) – (-) – α-metylbenzylamin, N ae N – (tert-butoksykarbonyl) -1,2-diaminoethane, N Lys N – (tert-butoksykarbonyl) -1,4-diaminobutan. For arginin avledede rester, ble følgende ubeskyttede diaminene koplet: N hArg 1,4-diaminobutan eller N Narg 1,2-diaminoetan, etterfulgt av på-harpiks beskyttelse med to-acetyldimedone (Dde-OH). Etter at hele sekvensen var blitt syntetisert, hydrazin avbeskyttelse av Dde gir frie aminene til guanidinylate. Figur 1. peptoid strukturer (a) [(N Narg N spe N SPE) (N ae N spe N spe)] 2 og (b) [(N hArg N spe N SPE) (N <stro ng> Lys N spe N spe)] 2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 2. Metoden som brukes til å syntetisere blandede arginin / lysin peptoids. I. Standard forskyvning trinn i fremgangsmåten submonomer med diamin; ii. Tilsetting av DDE-OH, 90 minutter for å beskytte fri amin; iii. Ytterligere tilsetninger for å forlenge den peptoid kjeden ved hjelp av submonomer metoden; iv. Avbeskyttelse av Dde ved anvendelse av 2% hydrazin i DMF; V. Guanidinylation av fritt amin på harpiks med pyrazol-1-karboksamidin og DIPEA i DMF; vi. Surt spalting fra resinet og avbeskyttelse av Boc-gruppene.large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Etter spalting fra resinet og frysetørking, ble råproduktene oppnådd som hvite pulvere: (a) 154 mg, (b) 163 mg. Produktene ble renset ved RP-HPLC som beskrevet med maksimalt 50 mg injeksjoner ved hjelp av en LC-pumpe med en UV-vis detektor (λ = 250 nm) på en analytisk kolonne, 250 mm x 10 mm, 5 um; strømningshastighet = 2 ml / min. Fraksjoner svarende til målet massen ble kombinert og erholdt som hvite pulvere: (a) 54 mg (b) 65 mg, endelige utbytter på ca 30% for fraksjoner> 90% rene. De endelige sammensatte identiteter etter rensing ble bekreftet ved LC-MS (se figur 3) ved hjelp av en trippel kvadrupol massespektrometer utstyrt med en UPLC og en fotodiode array detektor. Nøyaktig massespektrometri ble utført ved å bruke den samme spektrometeret på t han [M + 2H] 2 + ioner. Følgende beregnet og observerte massene ble funnet i nærheten av avtalen (figur 4): (a) beregnet = 896,0026 amu, observerte = 896,0038 amu; (B) beregnes = 952,0691 amu, observerte = 952,0730 amu. Figur 3. LC-MS for rensede peptoids. (A) m / z = 1792 og (b) m / z = 1903. Hvor toppen er TIC, midt LC-MS spekteret, bunn UV kromatogram ved 220 nm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 4. Nøyaktig massespektrometri data for peptoids (a) og (b)."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig4large.jpg" target = "_ blank"> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Produkt renhet ble vurdert ved hjelp av en analytisk RP-HPLC (LC pumpe med en UV-vis detektor på en analytisk kolonne, 4,6 mm x 100 mm, 3,5 pm; strømningshastighet = 1 ml / min), og visualisert ved 220 nm, absorbansen amid ryggrad. Figur 5a og 5b viser at forbindelsene er homogene. Figur 5. Analytisk HPLC for de rensede peptoids (a) og (b). Det er en gradient 0-100% B over 30 minutter, kolonne ovn ved 40 ° C (A = 95% H2O, 5% MeCN, 0,05 % TFA;. B = 95% MeCN, 5% H2O, 0,03% TFA) Vennligst click her for å se en større versjon av dette tallet. De rensede peptoids (a) og (b) ble testet i cytotoksisitetsanalyser mot L. Mexicana axenic amastigotes. Frosne bestander av L. mexicana ble tint og transformert til amastigote scenen klar for analysen. 72 timer etter tining, bør parasittene være insektscene promastigotes i sin procyclic skjema, i log fase med mange dele celler. På dette stadiet parasitter kan omdannes til den amastigote scenen ved hjelp av pH-verdien og temperaturen skiftet beskrevet. 27 På dag 9 av transformasjonen, vil parasitter være i den ikke-reproduserende infeksiøs metacyclic promastigote stadium. Endelig er ved dag 14, bør være parasitter i den patogene amastigote stadiet hvor parasitter mangler den karakteristiske flageller av promastigotes. 28 5 mM stamløsninger av forbindelsene ble gjort i cellekulturkvalitet DMSO og testet in triplo påminst to ganger for å sikre en robust datasett ble oppsamlet. En representativ 96-brønns plate plan er vist på figur 6. Ved slutten av analysen, ble cellelevedyktigheten reagens tilsatt til hver brønn, og fluorescensen ble målt som beskrevet for å beregne levedyktigheten av parasitter ved hver konsentrasjon som testes (se Figur 7 ). ED 50-verdier ble beregnet som peptoid (a)> 100 pM og peptoid (b) henholdsvis 37 pM. Feilstolpene plottet, viser variasjonen mellom brønnene som et standard avvik, og det kan sees at disse er rimelige for de fleste barer. Figur 6. Representative 96-brønners plate plan for en cytotoksisitet assay på 2 peptoid oppløsninger (inklusive positive og negative kontroller). Med + = medium (Schneider Insect medium, pH 5,5, 20% FBS, 1% P / S). L. mex. =8 x 10 6 / ml parasitt kultur i MED +. AmphoB = 5 mM i DMSO. Peptoid = 5 mM stamløsning i DMSO. Tomme brønner bør inneholde sterilt vann. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. Figur 7. Resultater fra cytotoksisitet analysen mot L. mexicana axenic amastigote parasitter valgt peptoid (a) og (b). Det kan sees at peptoid (b) er mer effektiv enn peptoid (a) ved å redusere prosentandel av levedyktige parasitter, med begge forbindelser som har en doseavhengig effekt. De feilfelt plottet viser variasjonen mellom brønnene som et standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Peptoids økende grad studert innenfor kjemisk biologi og medisinsk kjemi felt i applikasjoner som for eksempel nye therapeutics 3-5, celleleveringsmidler 18,20 og diagnostiske verktøy. 29 Vanligvis er disse sekvensene er kationiske å gi en grad av selektivitet for patogenet i løpet pattedyrceller, evnen til å trenge gjennom cellemembraner og også hjelpe oppløselighet i vandige systemer. Det finnes mange eksempler på kationiske peptoids som inneholder utelukkende lysin eller arginin-etterligning rester i litteraturen. Men til dags dato, syntesen av peptoids som inneholder begge disse kationiske rester i den samme sekvens er blitt hindret av mangel på en egnet syntetisk prosedyre. Protokollen er beskrevet her gjør det mulig for blandede kationiske peptoids å bli syntetisert på en effektiv måte og er meget ønskelig da det gir en rute for å modulere de biologiske og kjemiske egenskaper av amfipatiske peptoids.

nt "> Vår metode benytter en tilpasning til den brukte submonomer peptoid syntese og tillater tilsetning av både lysin og arginin-type monomerer innenfor den samme sekvens. Den bruker romtemperatur koplinger og etablert beskyttelsesgruppekjemien slik at det er forventet at denne metoden vil være nyttig for de fleste av forskningsgrupper. for å legge ortogonal beskyttelse for arginin-type rester, er en ubeskyttet diamin tilsatt under standardfortrengningsbetingelser, og deretter beskyttet i en 60-minutters kopling med Dde-OH. en rekke diaminer kan være brukes som tillater sidekjeder fra to karbonatomer til 6 karbonatomer lang, for å bli installert, dvs. 1,2-diaminoetan til 1,6-diaminoheksan henholdsvis. Den beskyttende Dde-OH oppløses godt i DMF, og er en meget effektiv og selektiv beskyttende gruppe for primære aminer. DDE-beskyttelse gruppe forlater sekundære aminer upåvirket, f.eks ubeskyttet N endestasjonen peptoid kjeden. 30 en begrensning er at alle synOppgaven ble gjennomført manuelt; imidlertid, er det forventet at koblingsbetingelsene utviklet gjøre fremgangsmåten anvendelig for bruk med automatiske peptid / peptoid synthesizere.

Den på harpiks avbeskyttelse av DDE-gruppene er foretatt ved bruk av en 2% hydrazin-oppløsning i DMF til å forlate frie aminer som kan guanidinylated på resin ved bruk av pyrazol-1-karboksamidin. Seks ekvivalenter av pyrazol-1-karboksamidin og seks ekvivalenter DIPEA benyttes pr frie amin på harpiksen (dvs. seks ekvivalenter for hver N Arg typen monomer som skal installeres). Igjen, er denne reaksjonen også effektiv og pyrazol-1-karboksamidin-reagenset har god løselighet i DMF. Fullføring av reaksjonen blir vanligvis sett via LC-MS etter 60 minutter ved romtemperatur.

På grunn av allsidigheten av submonomer metoden, kan en lang rekke primære aminer anvendes i fortrengningstrinnet slik at forholdene kan trenge å bli optimalisert for å øke koplings effeffektivitet og totale produktutbytte eller renhet. 31 For de sekvensene som er omtalt ovenfor, ingen spesielle forholdene var nødvendig for vellykkede koblinger. Imidlertid kan lengre fortrengning ganger eller høyere amin konsentrasjoner brukes til problematiske forskyvninger (dvs. for dårlig nukleofile eller sterisk voluminøse aminer). Noen aminer kan ikke være fullstendig oppløselig i DMF, i hvilket tilfelle anbefales det å oppløse disse i N-metyl-2-pyrrolidon (NMP), eller andre egnede oppløsningsmidler for fast-fase reaksjoner i stedet som i en foregående omfattende metode for syntese submonomer av peptoids. 32 for å innlemme monomerer som inneholder ubeskyttet heteroatomer i sidekjedene, acetylering ved hjelp av klorsyre er blitt vist å være effektive ved andre grupper. 33 i tillegg kan andre harpikser brukes med denne metoden for å gi peptoids med forskjellige C-terminale funksjonalisering. Wang harpiks og 2-chlorotrityl klorid-harpikser blir rutinemessig brukt isubmonomer syntese av peptoids. For eksempel har denne metoden vært brukt med hell med 2-klortrityl-klorid harpiks i vår gruppe. 2 Forskjellige faste bærere vil kreve en annen laste fremgangsmåte til Rink Amid omtalt her (avhengig av den spesifikke harpiks som brukes), slik dette skal kontrolleres med litteraturen før syntesen.

I likhet med peptidsyntese, kan betingelsene for endelig spaltning av peptoid av harpiksen også være optimalisert for den spesifikke sekvens. I denne protokollen, ble en cocktail TFA-spaltning som brukes (med triisopropylsilan og vann som scavengers). De peptoids som presenteres her, inneholdt bare Boc-beskyttelse som er et rimelig syrelabil gruppe. For å sikre fullstendig avbeskyttelse av sekvenser med en større andel av beskyttede rester eller mindre syrelabile beskyttelsesgrupper, lengre spaltningsseter tider kan være nødvendig (dvs. spaltningsseter ganger i overkant av 2 timer anbefales for sekvenser som inneholder Pbf eller tertiær-buTyl ester beskyttede grupper). Alternative passiveringsmidler kan også brukes for spesialiserte sidekjeder (for eksempel etanditiol eller 2-merkaptoetanol blir ofte brukt i peptider som har svovelholdige sidekjeder som cystein eller metionin).

Den biologisk analyse som presenteres er en standard cytotoksisk test som kan endres for å passe til forskjellige cellelinjer. Det er viktig å merke seg at hver 96-brønns plate bør inneholde tilstrekkelig kontroller for å tillate tillit til de oppnådde resultater. I dette tilfellet er amfotericin B anvendt som en positiv kontroll som det er et kjent stoff som brukes til å behandle sykdommen og DMSO blir benyttet som en negativ kontroll, da dette er det løsningsmiddel som anvendes til å lage sammensatte lager for analysen. Hvis andre cellelinjer blir brukt, bør alternative, egnede kontroller oppnås og valideres før bruk. L. mexicana inkuberes med peptoid ved konsentrasjoner mellom 100 og 2 uM i en time, og deretter parasitten / peptoid oppløsningen blir fortynnet veden faktor på ti for inkubering over natten (dvs. brønner først med 100 uM peptoid lager blir fortynnet til 10 uM).

Den cellelevedyktighet reagens blir tilsatt til hver brønn (10% av totalbrønnvolum) ved slutten av analysen. En synlig fargeendring er sett mellom brønner med levedyktige parasitter (rosa), kontrollbrønner uten levedyktige parasitter (blå) og et spektrum mellom med middels antall levedyktige parasitter. Fluorescens er proporsjonal med antallet levende celler og tilsvarer den metabolske aktivitet av cellene; Resazurin fargestoff (ikke fluorescerende) omdannes til den fluorescerende resorufin ved reduksjonsreaksjoner i metabolsk aktive celler. 34 I denne analysen har inkubasjonstiden med cellenes levedyktighet reagenset blitt optimalisert for L. mexicana. Inkubasjonstidene med levedyktigheten reagens vil variere for plater podet ved forskjellige cellekonsentrasjoner eller med forskjellige cellelinjer (for eksempel denne metoden kan også benyttesmed pattedyrceller). Avhengig av den eksakte plateleser som brukes, betraktninger må gjøres før fluorescens-målingene foretas. Eventuelle luftbobler i brønnene bør fjernes for å sikre nøyaktige målinger kan tas. Noen lesere plate leses fra bunnen av plater, i hvilket tilfelle flatbunnet 96-brønners plater bør ikke brukes. Andre maskiner kan leses fra toppen av platen, slik at lokket på platen bør fjernes før måling.

Til slutt, i fremtiden, kan denne protokollen være kompatibel med automatiserte synthesizere som er i stand til å gjøre mange sekvenser parallelt. I tillegg er syntesen av cykliske peptoids er også mulig ved hjelp av denne metoden. Denne protokollen bør gi forskere med en praktisk syntetisk prosedyre som kan brukes for å få tilgang til nye peptoid stillas med både lysin og arginin-type monomerer som kan være nyttige i mange anvendelser, inkludert materialer eller medisinske felt.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Engineering og Fysisk Sciences Research Council (EPSRC) for økonomisk støtte (HLB). Vi takker også Sridevi Maalika Ramanoudjame for hennes assistanse under filmingen av denne prosedyren.

Materials

Polypropylene solid phase extraction cartridges with two frits Crawford Scientific 12131017 and 12131015 20 mL and 6 mL cartridges used in this preparation
Trifluoroacetic acid Tokyo Chemical Industry (Europe) T0431-100g >98%; CAUTION can cause severe burns and respiratory irritation
N-N'-diisopropylcarbodiimide Sigma Aldrich 38370-100ML >98%; CAUTION hazardous to eyes, skin and via respiratory inhalation, may also cause sensitisation
Dimethylformamide Fischer Scientific 10346180 HPLC grade; CAUTION suspected teratogen
Acetonitrile Fischer Scientific 10407440 HPLC grade
Dichloromethane Fischer Scientific 10354263 99.8%; CAUTION suspected carcinogen
Bromacetic acid Sigma Aldrich 17000-100G >99%; ; CAUTION causes burns and hazardous to skin, eyes and respiratory tract
(S)-(-)-alpha methylbenzylamine Sigma Aldrich 115568-100G 98%; CAUTION harmful if swallowed, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nspe monomer
N-Boc 1,4 diaminobutane Tokyo Chemical Industry (Europe) A1373-25g >98%; CAUTION causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the NLys monomer
N-Boc 1,2 diaminoethane Tokyo Chemical Industry (Europe) A1371-25g >97%; CAUTION causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nae monomer
1,2 diaminobutane Sigma Aldrich D13208-100G 99%; CAUTION flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NhArg monomer
1,4 diaminoethane Sigma Aldrich 03550-250ML >99.5%; CAUTION flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NnArg monomer
1H-pyrazole-1-carboxamidine HCl Sigma Aldrich 402516-10G as HCl salt; CAUTION harmful if swallowed and may cause an allergic skin reaction, causes serious eye damage
Hydrazine monohydrate Sigma Aldrich 207942-5G reagent grade; CAUTION suspected carcinogen, fatal if inhaled and causes severe burns to skin and eyes
2-acetyl dimedone Novabiochem 8510150005 Dde-OH
Rink Amide resin Novabiochem 8551190005 100-200 mesh, high loading 
Piperidine Sigma Aldrich 411027-1L >99.5%, a controlled substance, so adequate permission must be obtained before purchase; CAUTION highly flammable liquid and vapour, harmful if swallowed and toxic in contact with skin or if inhaled, causes severe skin burns and eye damage, harmful to aquatic life with long lasting effects
Triisopropylsilane Sigma Aldrich 233781-50G 98%; CAUTION flammable liquid and vapour, causes skin irritation and serious eye irritation
alamarBlue ThermoFischer  DAL1025 Not classified as hazardous
Schneider's Insect Medium Sigma Aldrich S9895-1L Powdered, medium must be made prior to use following manafacturers instructions; allow to warm to room temperature before use in biological assays
96 well plates VWR 734-1793 Flat bottom (to allow fluorescence measurement from the bottom), tissue-culture treated
Solvent reservoirs VWR 613-1182 Used with multi channel pipette
Multi channel pipette Eppendorf 3122000043
Pipette tips Starlab Group S1111-3810, S1113-1810, S1111-6810 Volume of tip dependent on pipette used. 10 µL, 10 – 200 µL and 1000 µL recommended for assays
25 cm3 cell culture flasks VWR 734-2312
50 mL centrifuge tubes VWR 525-0791
dimethylsulphoxide (molecular biology grade) Sigma Aldrich D8418-50ML Not classified as hazardous
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum ThermoFischer  10082139-100mL Gibco
Penicillin/Streptomycin ThermoFischer  15140148-20mL Abbreviation: P/S
Amphotericin B Sigma Aldrich 46006-100mg Amphotericin B trihydrate, VetranalTM analytical standard
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. Efficient method for the preparation of peptoids oligo(N-substituted glycines) by submonomer solid-phase synthesis. J. Am. Chem. Soc. 114, 10646-10647 (1992).
  2. Bolt, H. L., Cobb, S. L. A practical method for the synthesis of peptoids containing both lysine-type and arginine-type monomers. Org. Biomol. Chem. 14, 1211-1215 (2016).
  3. Mojsoska, B., Zuckermann, R. N., Jenssen, H. Structure-activity relationship study of novel peptoids that mimic the structure of antimicrobial peptides. Antimicrob Agents Chemother. , (2015).
  4. Chongsiriwatana, N. P., et al. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 2794-2799 (2008).
  5. Eggimann, G. A., Bolt, H. L., Denny, P. W., Cobb, S. L. Investigating the Anti-leishmanial Effects of Linear Peptoids. Chem Med Chem. 10, 233-237 (2015).
  6. Kapoor, R., et al. Antimicrobial Peptoids Are Effective against Pseudomonas aeruginosa Biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 3054-3057 (2011).
  7. Ryge, T. S., Frimodt-Moller, N., Hansen, P. R. Antimicrobial activities of twenty lysine-peptoid hybrids against clinically relevant bacteria and fungi. Chemotherapy. 54, 152-156 (2008).
  8. Huang, M. L., Benson, M. A., Shin, S. B. Y., Torres, V. J., Kirshenbaum, K. Amphiphilic Cyclic Peptoids That Exhibit Antimicrobial Activity by Disrupting Staphylococcus aureus Membranes. Eur. J. Org. Chem. , 3560-3566 (2013).
  9. Huang, M. L., Shin, S. B. Y., Benson, M. A., Torres, V. J., Kirshenbaum, K. A Comparison of Linear and Cyclic Peptoid Oligomers as Potent Antimicrobial Agents. Chem Med Chem. 7, 114-122 (2012).
  10. Bolt, H. L., Eggimann, G. A., Denny, P. W., Cobb, S. L. Enlarging the Chemical Space of Anti-leishmanials: a Structure-Activity Relationship Study of Peptoids against Leishmania mexicana, a Causative Agent of Cutaneous Leishmaniasis. Med Chem Comm. , (2016).
  11. Chon, S. Y., et al. Antibiotic overuse and resistance in dermatology. Dermatologic therapy. 25, 55-69 (2012).
  12. Alvar, J., et al. Leishmaniasis Worldwide and Global Estimates of Its Incidence. PLOS ONE. 7, (2012).
  13. Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A. Chemotherapy of trypanosomiases and leishmaniasis. Trends Parasitol. 21, 508-512 (2005).
  14. Kedzierski, L. Leishmaniasis Vaccine: Where are We Today?. J Global Infect Dis. 2, 177-185 (2010).
  15. Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. Drug resistance in leishmaniasis. Clin Microbiol Rev. 19, 111-126 (2006).
  16. Huang, W., et al. Learning from Host-Defense Peptides: Cationic, Amphipathic Peptoids with Potent Anticancer Activity. PLOS ONE. 9, (2014).
  17. Wender, P. A., et al. The Design, Synthesis, and Evaluation of Molecules That Enable or Enhance Cellular Uptake: Peptoid Molecular Transporters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 13003-13008 (2000).
  18. Schröder, T., et al. Peptoidic Amino- and Guanidinium-Carrier Systems: Targeted Drug Delivery into the Cell Cytosol or the Nucleus. J. Med. Chem. 51, 376-379 (2008).
  19. Kömel, D. K., et al. Cell-penetrating peptoids: Introduction of novel cationic side chains. Eur. J. Med. Chem. 79, 231-243 (2014).
  20. Hein-Kristensen, L., Knapp, K. M., Franzyk, H., Gram, L. Bacterial membrane activity of α-peptide/β-peptoid chimeras: Influence of amino acid composition and chain length on the activity against different bacterial strains. BMC Microbiology. 11, 1-12 (2011).
  21. Su, Y., Doherty, T., Waring, A. J., Ruchala, P., Hong, M. Roles of Arginine and Lysine Residues in the Translocation of a Cell-Penetrating Peptide from (13)C, (31)P and (19)F Solid-State NMR. Biochem. 48, 4587-4595 (2009).
  22. Andreev, K., et al. Guanidino groups greatly enhance the action of antimicrobial peptidomimetics against bacterial cytoplasmic membranes. BBA Biomembranes. 1838, 2492-2502 (2014).
  23. Foged, C., et al. Cellular uptake and membrane-destabilising properties of alpha-peptide/beta-peptoid chimeras: lessons for the design of new cell-penetrating peptides. BBA Biomembranes. 1778, 2487-2495 (2008).
  24. Vedel, L., et al. Antiplasmodial and prehemolytic activities of alpha-peptide-beta-peptoid chimeras. Chem Bio Chem. 8, 1781-1784 (2007).
  25. Lear, S., Cobb, S. L. Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment. J Computer-Aided Mol Des. , 1-7 (2016).
  26. Bates, P. A. Complete developmental cycle of Leishmania mexicana in axenic culture. Parasitol. 108, 1-9 (1994).
  27. Gossage, S. M., Rogers, M. E., Bates, P. A. Two separate growth phases during the development of Leishmania in sand flies: implications for understanding the life cycle. Int J Parasitology. 33, 1027-1034 (2003).
  28. Seo, J., Lee, B. C., Zuckermann, R. N., Ducheyne, P. . Comp Biomaterials. 2, 53-76 (2011).
  29. Nash, I. A., Bycroft, B. W., Chan, W. C. Dde – A selective primary amine protecting group: A facile solid phase synthetic approach to polyamine conjugates. Tetrahedron Lett. 37, 2625-2628 (1996).
  30. Culf, A. S., Ouellette, R. J. Solid-phase synthesis of N-substituted glycine oligomers (alpha-peptoids) and derivatives. Molecules. 15, 5282-5335 (2010).
  31. Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets. J Vis Exp. , e3373 (2011).
  32. Burkoth, T. S., Fafarman, A. T., Charych, D. H., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Incorporation of unprotected heterocyclic side chains into peptoid oligomers via solid-phase submonomer synthesis. J. Am. Chem. Soc. 125, 8841-8845 (2003).
  33. Nakayama, G. R., Caton, M. C., Nova, M. P., Parandoosh, Z. Assessment of the Alamar Blue assay for cellular growth and viability in vitro. J Immunol Methods. 204, 205-208 (1997).

Tags

PeptoidsLysineArginineAnti-leishmanial ActivityCutaneous LeishmaniasisLeishmania MexicanaSubmonomer SynthesisFmoc-protected ResinPiperidineBromoacetic AcidDICAmine Solution

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Bolt, H. L., Denny, P. W., Cobb, S. L. An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity. J. Vis. Exp. (117), e54750, doi:10.3791/54750 (2016).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image