A protocol to synthesize peptoids with mixed cationic functionality in the same sequence is presented (lysine- and arginine-type monomers). Subsequent testing of these compounds against Leishmania mexicana, the protozoan parasites that cause cutaneous leishmaniasis, is also described.
This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this procedure amino functionalized ‘lysine’ and guanido functionalized ‘arginine’ peptoid monomers can be included within the same peptoid sequence. This procedure uses on-resin (N-(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)ethyl) or Dde protection, orthogonal conditions to the Boc protection of lysine monomers. Subsequent deprotection allows an efficient on-resin guanidinylation reaction to form the arginine residues. The procedure is compatible with the commonly used submonomer method of peptoid synthesis, allowing simple peptoids to be made using common laboratory equipment and commercially available reagents. The representative synthesis, purification and characterization of two mixed peptoids is described. The evaluation of these compounds as potential anti-infectives in screening assays against Leishmania mexicana is also described. The protozoan parasite L. mexicana is a causative agent of cutaneous leishmaniasis, a neglected tropical disease that affects up to 12 million people worldwide.
Peptoider (eller poly-N-substituerade glyciner) är en klass av peptid-härmare som erbjuder liknande egenskaper som peptider och som sådan är allt utreds för läkemedel och materialtillämpningar. I peptider, är sidokedjan av varje aminosyra kopplad till α-kolet av amiden ryggraden; i peptoider sidokedjoma skiftas på kväveatomen hos ryggraden. Avgörande ger peptoider större motståndskraft mot proteolys.
Peptoider vanligen syntetiseras med användning av submonomer metod uppfunnen av Zuckermann et al., Där peptoid monomerer kan byggas genom sekventiell haloacetylation av en aminfunktionalitet bunden till en fast bärare och efterföljande undanträngning av halogenen med användning av en primär amin. 1 Vår grupp har nyligen utvecklat en anpassning till denna submonomer metod för att tillåta lysin och arginin-typ peptoid rester att innefattas inom samma peptoid sekvensen för fFÖRSTA tid. 2 Denna handbok strategi fast fas för att peptoid syntes använder kommersiellt tillgängliga reagens och vanlig laboratorieutrustning, vilket gör den tillgänglig för de flesta laboratorier. Peptoider har visat sig ha lovande aktivitet mot ett brett spektrum av gramnegativa bakterier, grampositiva bakterier och svamparter som är jämförbara med många kända antimikrobiella peptider. 3-9
I vårt arbete har peptoider använts som nya anti-infektiösa föreningar för behandling av försummade tropiska sjukdomar leishmaniasis. 5,10 Leishmaniasis är endemisk i mer än 80 länder över hela världen och det uppskattas att över 12 miljoner människor är smittade över hela världen. 11 sjukdomen orsakas av protozoer parasiter som överförs genom bett av en sandfly. Leishmania arter kan orsaka kutan leishmanios, ett tillstånd som leder till ärrbildning och skador på slemhinnor, eller livshotande viscerala leishmaniasis, vilket orsakar dödlig organskada. Inget vaccin finns för närvarande för denna sjukdom och befintliga behandlingar förlita sig på ett litet antal läkemedel som har allvarliga biverkningar. Dessutom resistens mot befintliga läkemedel är ett växande och allvarligt problem så nya behandlingar desperat behövs för att effektivt behandla leishmaniasis i framtiden. 12-16
I dessa antimikrobiella tillämpningar används peptoider ofta utformade för att vara amfipatisk med en blandning av katjoniska och hydrofoba monomerer. 3,4 Detta kan ge peptoider en grad av selektivitet mot bakterieceller, minska toxicitet för däggdjursceller, och för att förbättra deras aktivitet som molekylära transportörer . 17-20 majoriteten av de antiinfektiva peptoider i litteraturen innehåller katjoniska sidokedjor som uteslutande är sammansatta av antingen amino- funktionaliserad lysin-typ monomerer eller arginin-typ rester. Peptid-peptoid chimärer, där katjoniska kedjorna består av enmino syror lysin eller arginin, har också syntetiserats att undersöka effekten av katjoniska grupper på aktivitet och toxicitet. 21-25
Poly-lysin peptoider kan lätt syntetiseras med användning av kommersiellt tillgängliga Boc-skyddade aminer. Poly-arginin peptoider rapporterade kan göras med hjälp av en metod som använder pyrazol-1-karboxamidin som en guanidinylation medel. 18 Detta kan dock endast ske efter det att peptoid har klyvts från hartset och Boc skydd på sidokedjor avlägsnas, så varje lysin-typ rest inom sekvensen omvandlas till en argininrest. I ett försök att finjustera de kemiska och biologiska egenskaperna hos föreningarna, har vi utvecklat en metod som gör det möjligt för dubbla katjonisk funktionalitet (t.ex. N Lys och N Arg) som skall ingå i varje given peptoid sekvens för första gången. 2
Häri beskriver vi syntesen, rening och karakterisering av TWo nya peptoider som innehåller både lysin och arginin-typ rester i samma sekvens. Metoden använder ortogonala N -Boc och N -Dde skydd på harts med pyrazol-1-karboxamidin som en guanidinylation reagens. Den biologiska utvärderingen av dessa peptoider beskrivs också i cytotoxicitetsanalyser mot Leishmania mexicana, det orsakande medlet av kutan leishmaniasis. Detta ger en praktisk metod för att komma åt peptoider med dubbla katjonisk funktionalitet och bedöma deras biologiska aktivitet. Det förväntas att denna metod kommer att hjälpa syntes av amfipatiska peptoider av peptoid samhället i framtiden.
Peptoider alltmer studeras inom kemisk biologi och läkemedelskemi områden applikationer såsom nya behandlingar 3-5, cellleveransmedel 18,20 och diagnostiska verktyg. 29 Normalt är dessa sekvenser är katjoniska för att åstadkomma en grad av selektivitet för patogenen över däggdjursceller, förmågan att tränga igenom cellmembran och även underlätta löslighet i vattenbaserade system. Det finns många exempel på katjoniska peptoider som innehåller enbart lysin eller arginin-härmande rester i litteraturen. Men hittills, syntes av peptoider som innehåller båda dessa katjoniska rester i samma sekvens har hindrats av avsaknaden av en lämplig syntesförfarande. Protokollet som beskrivs här tillåter blandade katjoniska peptoider syntetiseras på ett effektivt sätt och är mycket önskvärt eftersom det ger en väg för att modulera de biologiska och kemiska egenskaper amfipatiska peptoider.
nt "> Vår metod använder en anpassning till den vanligen använda submonomer peptoid syntes och tillåter tillsatsen av både lysin och arginin-typ monomerer inom samma sekvens. Den använder rumstemperaturkopplingar och etablerade skyddsgrupp kemi så det förväntas att denna metod kommer att vara användbart för de flesta forskningsgrupper. för att lägga till ortogonalt skydd för arginin-typ-rest, är en oskyddad diamin tillsättes under standardundanträngningsbetingelser och sedan skyddas på ett 60 minuters koppling med Dde-OH. en mängd olika diaminer kan vara användas, som tillåter sidokedjor från 2 kolatomer till 6 kolatomer långa för att installeras, det vill säga, 1,2-diaminoetan till 1,6-diaminohexan respektive. skyddsgruppen Dde-OH upplöses väl i DMF och är en mycket effektiv och selektiv skyddsgrupp för primära aminer. den Dde-skyddsgrupp lämnar sekundära aminer opåverkade, t.ex., den oskyddade N-terminalen av peptoid-kedjan. 30 En begränsning är att alla av syn-Avhandlingen genomfördes manuellt, emellertid förväntas det att de kopplingsbetingelser som utvecklats göra metoden mottaglig för användning med automatiserade peptid / peptoid synthesizers.Den på harts avskyddande av Dde-grupperna sker med hjälp av en 2% hydrazin-lösning i DMF för att lämna fria aminer som kan guanidinylated på harts med användning pyrazol-1-karboxamidin. Sex ekvivalenter av pyrazol-1-karboxamidin och sex ekvivalenter av DIPEA används per fri amin på hartset (dvs., sex ekvivalenter för varje N Arg monomertyp som ska installeras). Återigen är denna reaktion också effektiv och pyrazol-1-karboxamidin-reagens har god löslighet i DMF. Fullbordan av reaktionen typiskt sett via LC-MS efter 60 minuter vid rumstemperatur.
På grund av mångsidigheten hos submonomer metoden, kan ett stort antal olika primära aminer användas i undanträngningssteget så betingelser kan behöva optimeras för att öka kopplings effieffektivitet och övergripande produktutbyten eller renhet. 31 För de sekvenser som diskuterats ovan, inga särskilda villkor var nödvändiga för framgångsrika kopplingar. Emellertid kan längre förskjutningstider eller högre aminkoncentrationer användas för problematiska förskjutningar (dvs för dåligt nukleofila eller steriskt skrymmande aminer). Vissa aminer kan inte vara fullständigt lösliga i DMF, i vilket fall det rekommenderas att lösa dessa i N-metyl-2-pyrrolidon (NMP), eller andra lämpliga lösningsmedel för fast fas reaktioner i stället som i en tidigare omfattande metod för submonomer syntes av peptoider. 32 för att införliva monomerer som innehåller oskyddade heteroatomer i sidokedjorna, acetylering med användning av klorättiksyra har visat sig vara effektiva vid andra grupper. 33 Dessutom kan andra hartser användas med denna metod för erhållande av peptoider med olika C-terminala funktionalisering. Wang hartser och 2-klorotritylkloridharts hartser används rutinmässigt isubmonomer syntes av peptoider. Till exempel, har denna metod med framgång använts med 2-klorotritylkloridharts i vår grupp. 2 Olika fasta bärare kommer att kräva en annan laddningsförfarande till Rink Amide diskuteras här (beroende på den specifika använda hartset) så detta bör kontrolleras med litteraturen före syntes.
Liknar peptidsyntes, kan villkoren för slutlig klyvning av peptoid off hartset också optimeras för den specifika sekvensen. I detta protokoll, var en TFA klyvnings cocktail som används (med triisopropylsilan och vatten som scavengers). De peptoider som presenteras här endast innehöll Boc skydd som är ett rimligt syralabil grupp. För att säkerställa fullständig avblockering av sekvenser med en större andel av skyddade rester eller mindre syralabila skyddsgrupper, längre klyvnings gånger kan vara nödvändig (dvs klyvnings gånger överstigande 2 timmar rekommenderas för sekvenser som innehåller Pbf eller tertiär-butyll ester skyddade grupper). Alternativa scavengers kan också användas för specialiserade sidokedjor (t ex etanditiol eller 2-merkaptoetanol används ofta i peptider som har svavelinnehållande sidokedjor såsom cystein eller metionin).
Den biologiska analysen som presenteras är en standard cytotoxicitet test som kan ändras för att passa olika cellinjer. Det är viktigt att notera att varje 96-brunnsplatta bör innehålla tillräckliga kontroller för att tillåta förtroende för de erhållna resultaten. I detta fall, är amfotericin B som används som en positiv kontroll eftersom det är ett känt läkemedel som används för behandling av sjukdomen och DMSO användes som en negativ kontroll, eftersom detta är det lösningsmedel som används för att göra sammansatta bestånd för analysen. Om andra cellinjer används, bör alternativa, lämpliga kontroller erhållas och valideras före användning. L. mexicana inkuberas med peptoid vid koncentrationer mellan 100 och 2 pM i en timme, och sedan parasiten / peptoid lösningen utspädes genomen faktor tio för inkubering över natten (dvs brunnarna initialt med 100 | iM peptoid lager späds till 10 ^ M).
Cellviabiliteten reagens sätts till varje brunn (10% av den totala brunnsvolym) i slutet av analysen. En synlig färgförändring syns mellan brunnar med livsdugliga parasiter (rosa), kontrollbrunnar utan livsdugliga parasiter (blå) och ett spektrum mellan med mellanliggande antalet livskraftiga parasiter. Fluorescensen är proportionell mot antalet levande celler och motsvarar den metaboliska aktiviteten för cellerna; resazurin dye (icke fluorescerande) omvandlas till den fluorescerande resorufin genom reduktionsreaktioner i metaboliskt aktiva celler. 34 I denna analys har inkubationstiden med cellviabiliteten reagens optimerats för L. mexicana. Inkubationstider med viabiliteten reagens kommer att variera för plattor såddes vid olika cellkoncentrationer eller med olika cellinjer (t ex metoden också kan användasmed däggdjursceller). Beroende av den exakta plattläsare användes, överväganden måste göras innan fluorescensmätningar tas. Eventuella luftbubblor i brunnar bör tas bort för att säkerställa korrekta avläsningar kan tas. Vissa platt läsare läser från botten av plattorna, i vilket fall flatbottnade plattor med 96 brunnar bör användas. Andra maskiner kan läsas från toppen av plattan, så locket av plattan bör avlägsnas före mätningen.
Slutligen, i framtiden, kan detta protokoll vara kompatibel med automatiserade syntes som är kapabla att göra många sekvenser parallellt. Dessutom är även möjligt syntesen av cykliska peptoider med denna metod. Detta protokoll bör ge forskare med praktisk syntesförfarande som kan användas för att få tillgång till nya peptoid ställningar med både lysin och arginin-monomerer, som kan vara till nytta i många tillämpningar, inklusive material eller läkemedel fält.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC) för finansiellt stöd (HLB). Vi tackar också Sridevi Maalika Ramanoudjame för hennes stöd under inspelningen av detta förfarande.
Polypropylene solid phase extraction cartridges with two frits | Crawford Scientific | 12131017 and 12131015 | 20 mL and 6 mL cartridges used in this preparation |
Trifluoroacetic acid | Tokyo Chemical Industry (Europe) | T0431-100g | >98%; CAUTION can cause severe burns and respiratory irritation |
N-N'-diisopropylcarbodiimide | Sigma Aldrich | 38370-100ML | >98%; CAUTION hazardous to eyes, skin and via respiratory inhalation, may also cause sensitisation |
Dimethylformamide | Fischer Scientific | 10346180 | HPLC grade; CAUTION suspected teratogen |
Acetonitrile | Fischer Scientific | 10407440 | HPLC grade |
Dichloromethane | Fischer Scientific | 10354263 | 99.8%; CAUTION suspected carcinogen |
Bromacetic acid | Sigma Aldrich | 17000-100G | >99%; ; CAUTION causes burns and hazardous to skin, eyes and respiratory tract |
(S)-(-)-alpha methylbenzylamine | Sigma Aldrich | 115568-100G | 98%; CAUTION harmful if swallowed, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nspe monomer |
N-Boc 1,4 diaminobutane | Tokyo Chemical Industry (Europe) | A1373-25g | >98%; CAUTION causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the NLys monomer |
N-Boc 1,2 diaminoethane | Tokyo Chemical Industry (Europe) | A1371-25g | >97%; CAUTION causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nae monomer |
1,2 diaminobutane | Sigma Aldrich | D13208-100G | 99%; CAUTION flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NhArg monomer |
1,4 diaminoethane | Sigma Aldrich | 03550-250ML | >99.5%; CAUTION flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NnArg monomer |
1H-pyrazole-1-carboxamidine HCl | Sigma Aldrich | 402516-10G | as HCl salt; CAUTION harmful if swallowed and may cause an allergic skin reaction, causes serious eye damage |
Hydrazine monohydrate | Sigma Aldrich | 207942-5G | reagent grade; CAUTION suspected carcinogen, fatal if inhaled and causes severe burns to skin and eyes |
2-acetyl dimedone | Novabiochem | 8510150005 | Dde-OH |
Rink Amide resin | Novabiochem | 8551190005 | 100-200 mesh, high loading |
Piperidine | Sigma Aldrich | 411027-1L | >99.5%, a controlled substance, so adequate permission must be obtained before purchase; CAUTION highly flammable liquid and vapour, harmful if swallowed and toxic in contact with skin or if inhaled, causes severe skin burns and eye damage, harmful to aquatic life with long lasting effects |
Triisopropylsilane | Sigma Aldrich | 233781-50G | 98%; CAUTION flammable liquid and vapour, causes skin irritation and serious eye irritation |
alamarBlue | ThermoFischer | DAL1025 | Not classified as hazardous |
Schneider's Insect Medium | Sigma Aldrich | S9895-1L | Powdered, medium must be made prior to use following manafacturers instructions; allow to warm to room temperature before use in biological assays |
96 well plates | VWR | 734-1793 | Flat bottom (to allow fluorescence measurement from the bottom), tissue-culture treated |
Solvent reservoirs | VWR | 613-1182 | Used with multi channel pipette |
Multi channel pipette | Eppendorf | 3122000043 | |
Pipette tips | Starlab Group | S1111-3810, S1113-1810, S1111-6810 | Volume of tip dependent on pipette used. 10 µL, 10 – 200 µL and 1000 µL recommended for assays |
25 cm3 cell culture flasks | VWR | 734-2312 | |
50 mL centrifuge tubes | VWR | 525-0791 | |
dimethylsulphoxide (molecular biology grade) | Sigma Aldrich | D8418-50ML | Not classified as hazardous |
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | ThermoFischer | 10082139-100mL | Gibco |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFischer | 15140148-20mL | Abbreviation: P/S |
Amphotericin B | Sigma Aldrich | 46006-100mg | Amphotericin B trihydrate, VetranalTM analytical standard |