A protocol to synthesize peptoids with mixed cationic functionality in the same sequence is presented (lysine- and arginine-type monomers). Subsequent testing of these compounds against Leishmania mexicana, the protozoan parasites that cause cutaneous leishmaniasis, is also described.
This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this procedure amino functionalized ‘lysine’ and guanido functionalized ‘arginine’ peptoid monomers can be included within the same peptoid sequence. This procedure uses on-resin (N-(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)ethyl) or Dde protection, orthogonal conditions to the Boc protection of lysine monomers. Subsequent deprotection allows an efficient on-resin guanidinylation reaction to form the arginine residues. The procedure is compatible with the commonly used submonomer method of peptoid synthesis, allowing simple peptoids to be made using common laboratory equipment and commercially available reagents. The representative synthesis, purification and characterization of two mixed peptoids is described. The evaluation of these compounds as potential anti-infectives in screening assays against Leishmania mexicana is also described. The protozoan parasite L. mexicana is a causative agent of cutaneous leishmaniasis, a neglected tropical disease that affects up to 12 million people worldwide.
Peptoids (या पाली एन -substituted glycines) पेप्टाइड mimetics कि पेप्टाइड्स करने के लिए इसी तरह की संपत्ति प्रदान करते हैं और इस तरह के रूप में तेजी से औषधीय और सामग्री अनुप्रयोगों के लिए जांच की जा रही के एक वर्ग के हैं। पेप्टाइड्स में, प्रत्येक अमीनो एसिड के पक्ष श्रृंखला एमाइड रीढ़ की α कार्बन से जुड़ा है; peptoids में पक्ष श्रृंखला रीढ़ की नाइट्रोजन परमाणु पर स्थानांतरित कर रहे हैं। महत्वपूर्ण बात, इस peptoids प्रोटियोलिसिस करने के लिए अधिक से अधिक प्रतिरोध देता है।
Peptoids सामान्यतः submonomer विधि जुकरमैन एट अल।, जहां peptoid monomers एक amine एक ठोस समर्थन और हैलोजन एक प्राथमिक अमाइन का उपयोग कर के बाद के विस्थापन से जुड़ी कार्यक्षमता के अनुक्रमिक haloacetylation द्वारा बनाया जा सकता है ने बीड़ा उठाया है का उपयोग कर संश्लेषित कर रहे हैं। 1 हमारे समूह ने हाल ही में विकसित किया गया है इस submonomer विधि के लिए एक अनुकूलन lysine- और arginine प्रकार peptoid अवशेषों च के लिए एक ही peptoid अनुक्रम में शामिल होने के लिए अनुमति देने के लिएirst समय। 2 यह मैनुअल ठोस चरण दृष्टिकोण संश्लेषण peptoid को व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों और आम प्रयोगशाला उपकरणों का उपयोग करता है, यह प्रयोगशालाओं के बहुमत के लिए सुलभ बना रही है। Peptoids ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया, ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया और कवक प्रजातियों है कि कई ज्ञात रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स करने के लिए तुलना कर रहे हैं की एक विस्तृत श्रृंखला के खिलाफ होनहार गतिविधियों को दिखाया गया है। 3-9
हमारे काम में, peptoids उपेक्षित उष्णकटिबंधीय रोग लीशमनियासिस के उपचार के लिए उपन्यास विरोधी संक्रामक यौगिकों के रूप में इस्तेमाल किया गया है। 5,10 Leishmaniasis दुनिया भर में 80 से अधिक देशों में स्थानिक है और यह अनुमान है कि 12 लाख से अधिक लोगों को विश्व स्तर पर संक्रमित हैं। 11 रोग प्रोटोजोआ परजीवी है कि एक sandfly के काटने से फैलता जाता है के कारण होता है। लीशमैनिया प्रजातियों त्वचीय लीशमनियासिस, एक शर्त है कि श्लेष्मा झिल्ली को scarring और नुकसान होता है, या जीवन के लिए खतरा पैदा कर सकता है आंत leishmaniasis, जो घातक अंग क्षति का कारण बनता है। कोई टीका इस बीमारी के लिए वर्तमान में उपलब्ध है और मौजूदा उपचार दवाओं है कि गंभीर साइड इफेक्ट की एक छोटी संख्या पर निर्भर हैं। इसके अलावा, मौजूदा दवाओं के लिए प्रतिरोध एक उभरती हुई और गंभीर समस्या इतनी नए उपचार सख्त प्रभावी रूप से भविष्य में लीशमनियासिस के इलाज के लिए की जरूरत है। 12-16
इन रोगाणुरोधी अनुप्रयोगों में, peptoids अक्सर cationic और हाइड्रोफोबिक monomers के एक मिश्रण के साथ amphipathic तैयार हो रहे हैं। 3,4 यह peptoids, बैक्टीरियल कोशिकाओं की ओर चयनात्मकता की एक डिग्री दे सकते हैं स्तनधारी कोशिकाओं को विषाक्तता को कम करने, और आणविक ट्रांसपोर्टरों के रूप में उनकी गतिविधि में सुधार करने के लिए । 17-20 साहित्य में विरोधी संक्रामक peptoids के बहुमत cationic पक्ष श्रृंखला है कि विशेष रूप से या तो अमीनो क्रियाशील लाइसिन प्रकार monomers या arginine प्रकार के अवशेष के शामिल होते हैं। पेप्टाइड peptoid काइमेरा, जहां cationic चेन एक के शामिल हैंMino एसिड लाइसिन या आर्जिनिन भी गतिविधि और विषाक्तता पर cationic समूहों के प्रभाव की जांच करने के लिए संश्लेषित किया गया है। 21-25
पाली lysine peptoids आसानी से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध Boc संरक्षित amines का उपयोग कर संश्लेषित किया जा सकता है। पाली arginine peptoids सूचना एक विधि है जो एक एजेंट के रूप में guanidinylation pyrazole-1-carboxamidine का उपयोग करता है का उपयोग किया जा सकता है। 18 बहरहाल, यह केवल बाद peptoid राल और पक्ष श्रृंखला पर Boc सुरक्षा हटा से cleaved किया गया है किया जा सकता है, तो अनुक्रम के भीतर हर लाइसिन प्रकार अवशेषों एक arginine अवशेषों में तब्दील हो जाता है। ठीक धुन करने के प्रयास में यौगिकों के रासायनिक और जैविक गुणों, हम एक तरीका है कि दोहरी cationic कार्यक्षमता (जैसे, एन लिस और एन Arg) पहली बार के लिए किसी भी peptoid अनुक्रम में शामिल होने की अनुमति देता है विकसित की है। 2
इस के साथ साथ, हम संश्लेषण, शुद्धि और TW के लक्षण वर्णन का वर्णनओ उपन्यास peptoids कि उसी क्रम में दोनों lysine- और arginine प्रकार अवशेष होते हैं। विधि एक guanidinylation अभिकर्मक के रूप में pyrazole-1-carboxamidine साथ राल पर orthogonal एन -Boc और एन -Dde संरक्षण का उपयोग करता है। इन peptoids की जैविक मूल्यांकन भी लीशमैनिया मेक्सिकाना, त्वचीय लीशमनियासिस की प्रेरणा का एजेंट के खिलाफ cytotoxicity assays में वर्णित है। इस दोहरी cationic कार्यक्षमता के साथ peptoids उपयोग करने के लिए और उनके जैविक गतिविधि का आकलन करने के लिए एक व्यावहारिक तरीका प्रदान करता है। यह उम्मीद है कि इस विधि से भविष्य में peptoid समुदाय द्वारा amphipathic peptoids के संश्लेषण सहायता करेगा।
Peptoids तेजी से इस तरह के उपन्यास चिकित्सा 3-5, सेल वितरण एजेंट के रूप में रासायनिक जीव विज्ञान और अनुप्रयोगों में औषधीय रसायन विज्ञान के क्षेत्र में अध्ययन किया जा रहा 18,20 और नैदानिक उपकरण। 29 आमतौर पर, इन दृश्यों पर रोगज़नक़ के लिए चयनात्मकता की एक डिग्री प्रदान करने के लिए cationic हैं स्तनधारी कोशिकाओं, कोशिका झिल्ली के माध्यम से घुसना और भी जलीय प्रणालियों में घुलनशीलता सहायता करने की क्षमता। वहाँ cationic peptoids कि साहित्य में पूरी तरह lysine- या arginine-अनुकरण करनेवाला अवशेष होते हैं के कई उदाहरण हैं। हालांकि, आज तक, peptoids कि उसी क्रम में इन cationic अवशेषों के दोनों शामिल के संश्लेषण के लिए एक उपयुक्त सिंथेटिक प्रक्रिया के अभाव के कारण रुकावट किया गया है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल मिश्रित cationic peptoids एक कुशल तरीके से संश्लेषित करने की अनुमति देता है और बहुत ही वांछनीय है के रूप में यह amphipathic peptoids के जैविक और रासायनिक गुणों मिलाना के लिए एक मार्ग प्रदान करता है।
NT "> हमारे विधि आमतौर पर इस्तेमाल किया submonomer peptoid संश्लेषण के लिए एक अनुकूलन का उपयोग करता है और उसी क्रम के भीतर दोनों lysine- और arginine प्रकार monomers के अलावा परमिट। यह कमरे के तापमान कपलिंग उपयोग करता है और समूह के रसायन शास्त्र की रक्षा तो यह इस पद्धति है कि अनुमान है स्थापित अनुसंधान समूहों के बहुमत के लिए उपयोगी हो जाएगा। arginine प्रकार अवशेषों के लिए ओर्थोगोनल संरक्षण जोड़ने के लिए, एक असुरक्षित Diamine मानक विस्थापन की शर्तों के तहत जोड़ा और फिर सुरक्षित है साथ डीडीई ओह। diamines की एक किस्म के हो सकते हैं एक 60 मिनट का युग्मन में इस्तेमाल किया जो लंबे समय से स्थापित करने के लिए, यानी, 1,6-diaminohexane क्रमश: 1,2-diaminoethane। डीडीई की रक्षा-ओह अच्छी तरह से DMF में घुल 2 से 6 कार्बन कार्बन से पक्ष श्रृंखला की अनुमति देता है और के लिए एक बहुत ही कुशल और चयनात्मक समूह की रक्षा है प्राथमिक amines। डीडीई-सुरक्षा समूह माध्यमिक amines अप्रभावित, जैसे, peptoid श्रृंखला के असुरक्षित एन टर्मिनस छोड़ देता है। 30 एक सीमा है syn के सभी किथीसिस मैन्युअल कार्य शुरू किया गया था; हालांकि, यह अनुमान है युग्मन की स्थिति विकसित स्वचालित पेप्टाइड / peptoid सिंथेसाइज़र के साथ प्रयोग के लिए विधि उत्तरदायी बनाना है।डीडीई-समूहों में से राल पर deprotection DMF में एक 2% hydrazine समाधान का उपयोग कर मुक्त amines कि pyrazole-1-carboxamidine का उपयोग कर राल पर guanidinylated जा सकती है छोड़ने के लिए किया जाता है। (यानी, प्रत्येक एन Arg प्रकार मोनोमर के लिए छह समकक्ष स्थापित करने के लिए) pyrazole-1-carboxamidine के छह समकक्ष और DIPEA के छह समकक्ष राल पर प्रति मुक्त अमाइन किया जाता है। फिर, यह प्रतिक्रिया भी कुशल है और pyrazole-1-carboxamidine अभिकर्मक DMF में अच्छा घुलनशीलता है। प्रतिक्रिया के पूरा होने में आम तौर पर कमरे के तापमान पर 60 मिनट के बाद नियंत्रण रेखा एमएस के माध्यम से देखा जाता है।
submonomer विधि की चंचलता को, प्राथमिक amines की एक विस्तृत विविधता विस्थापन चरण में इस्तेमाल किया जा सकता है कारण इतने शर्तों युग्मन effi बढ़ाने के लिए अनुकूलित करने की आवश्यकता हो सकती हैदक्षता और समग्र उत्पाद पैदावार या ऊपर चर्चा दृश्यों के लिए पवित्रता। 31, कोई विशेष परिस्थितियों सफल कपलिंग के लिए आवश्यक थे। हालांकि, अब विस्थापन बार या उच्च सांद्रता अमाइन समस्याग्रस्त विस्थापन (यानी, खराब न्युक्लेओफ़िलिक या sterically भारी amines के लिए) के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कुछ amines DMF में पूरी तरह से घुलनशील नहीं हो सकता है, जो मामले में यह बजाय submonomer संश्लेषण के लिए पिछले एक व्यापक विधि के रूप में एन -methyl-2-pyrrolidone (एनएमपी), या ठोस चरण प्रतिक्रियाओं के लिए अन्य उपयुक्त सॉल्वैंट्स में इन भंग करने की सिफारिश की है peptoids की। 32 monomers उस तरफ जंजीरों में असुरक्षित heteroatoms शामिल शामिल करने के लिए, chloroacetic एसिड का उपयोग एसिटिलीकरण अन्य समूहों द्वारा प्रभावी होना दिखाया गया है। 33 ही, दूसरे रेजिन अलग सी टर्मिनल functionalization साथ peptoids उपज के लिए इस विधि के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है। वांग रेजिन और 2-chlorotrityl क्लोराइड रेजिन नियमित रूप में इस्तेमाल कर रहे हैंpeptoids की submonomer संश्लेषण। उदाहरण के लिए, इस विधि को सफलतापूर्वक हमारे समूह में 2-chlorotrityl क्लोराइड राल के साथ इस्तेमाल किया गया है। रिंक Amide करने के लिए यहाँ पर चर्चा (विशिष्ट इस्तेमाल किया राल पर निर्भर) 2 अलग ठोस समर्थन करता है एक अलग लोडिंग प्रक्रिया की आवश्यकता होगी तो यह साहित्य के साथ जाँच की जानी चाहिए संश्लेषण से पहले।
पेप्टाइड संश्लेषण के लिए इसी प्रकार, राल peptoid बंद के अंतिम दरार के लिए शर्तों को भी विशिष्ट क्रम के लिए अनुकूलित किया जा सकता। इस प्रोटोकॉल में, एक TFA दरार कॉकटेल (triisopropylsilane और मैला ढोने वालों के रूप में पानी के साथ) का इस्तेमाल किया गया था। यहाँ प्रस्तुत peptoids केवल Boc संरक्षण, जो एक हद तक अस्थिर एसिड समूह है निहित। संरक्षित अवशेषों या उससे कम एसिड अस्थिर समूहों की रक्षा का एक बड़ा अनुपात के साथ दृश्यों की पूरी deprotection सुनिश्चित करने के लिए लंबे समय तक दरार बार आवश्यक हो सकता है (यानी, 2 घंटे से अधिक में दरार बार दृश्यों कि PBF या तृतीयक-बू रोकने के लिए सिफारिश कर रहे हैंTYL एस्टर संरक्षित समूहों)। वैकल्पिक मैला ढोने वालों को भी विशेष पक्ष श्रृंखला के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, ethanedithiol या 2-मर्केप्टोइथेनाल अक्सर पेप्टाइड्स है कि सिस्टीन या methionine तरह सल्फर युक्त पक्ष श्रृंखला में इस्तेमाल किया जाता है)।
जैविक प्रस्तुत परख एक मानक cytotoxicity परीक्षण है जो अलग-अलग सेल लाइनों सूट करने के लिए परिवर्तित किया जा सकता है। यह ध्यान रखें कि प्रत्येक 96 अच्छी तरह से थाली प्राप्त परिणामों में विश्वास की अनुमति देने के लिए पर्याप्त नियंत्रण को शामिल करना चाहिए महत्वपूर्ण है। इस मामले में, amphotericin बी के रूप में यह बीमारी का इलाज करने के लिए इस्तेमाल एक ज्ञात दवा है एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है और DMSO के रूप में इस परख के लिए यौगिक शेयरों बनाने के लिए इस्तेमाल विलायक है एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है। अन्य सेल लाइनों का इस्तेमाल किया जा रहा है, विकल्प, उपयुक्त नियंत्रण प्राप्त किया जाना चाहिए और उपयोग करने से पहले पुष्टि। एल मेक्सिकाना एक घंटे के लिए 100 और 2 माइक्रोन के बीच सांद्रता में peptoid साथ incubated है, और फिर परजीवी / peptoid समाधान से पतला हैरात ऊष्मायन के लिए दस में से एक कारक है (यानी, कुओं शुरू में 100 माइक्रोन के peptoid स्टॉक के साथ 10 माइक्रोन से पतला कर रहे हैं)।
सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक परख के अंत में अच्छी तरह से प्रत्येक (कुल अच्छी तरह से मात्रा का 10%) को जोड़ा गया है। एक दृश्य रंग परिवर्तन व्यवहार्य परजीवी (गुलाबी), नियंत्रण कुओं कोई व्यवहार्य परजीवी (नीला) और व्यवहार्य परजीवी के मध्यवर्ती संख्या के साथ जो स्पेक्ट्रम के साथ साथ कुओं के बीच देखा जाता है। प्रतिदीप्ति जीवित कोशिकाओं की संख्या के अनुपात में होती है और कोशिकाओं की चयापचय क्रिया से मेल खाती है; resazurin डाई (गैर फ्लोरोसेंट) metabolically सक्रिय कोशिकाओं में कमी प्रतिक्रियाओं द्वारा फ्लोरोसेंट resorufin में बदल जाती है। 34 इस परख में, सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक के साथ ऊष्मायन समय एल के लिए अनुकूलित किया गया है मेक्सिकाना। व्यवहार्यता अभिकर्मक प्लेटों के लिए अलग अलग होंगे साथ ऊष्मायन बार अलग सेल सांद्रता में या अलग सेल लाइनों (उदाहरण के लिए इस पद्धति का भी इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ वरीयता प्राप्तस्तनधारी कोशिकाओं के साथ)। इस्तेमाल किया सटीक प्लेट रीडर पर निर्भर करता है, विचार प्रतिदीप्ति माप लिया जाता है से पहले किए जाने की जरूरत है। कुओं में किसी भी हवाई बुलबुले सुनिश्चित करने के लिए सही रीडिंग ले जाया जा सकता हटाया जाना चाहिए। कुछ पाठकों की थाली प्लेटों के नीचे, जो मामले में फ्लैट 96 अच्छी तरह प्लेटें इस्तेमाल किया जाना चाहिए तली से पढ़ें। अन्य मशीनों प्लेट के ऊपर से पढ़ सकता है, तो थाली के ढक्कन माप से पहले हटा दिया जाना चाहिए।
अंत में, भविष्य में, इस प्रोटोकॉल स्वचालित सिंथेसाइज़र है कि समानांतर में कई दृश्यों बनाने में सक्षम हैं के साथ संगत हो सकता है। इसके अतिरिक्त, चक्रीय peptoids के संश्लेषण भी इस विधि का उपयोग संभव है। इस प्रोटोकॉल एक व्यावहारिक कृत्रिम प्रक्रिया है कि दोनों lysine- और arginine प्रकार monomers, जो सामग्री या औषधीय क्षेत्रों सहित कई अनुप्रयोगों में उपयोग की जा सकती है के साथ उपन्यास peptoid scaffolds उपयोग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है के साथ शोधकर्ताओं प्रदान करना चाहिए।
The authors have nothing to disclose.
हम वित्तीय सहायता के लिए इंजीनियरिंग और शारीरिक विज्ञान अनुसंधान परिषद (EPSRC) (HLB) धन्यवाद। हम भी इस प्रक्रिया के फिल्मांकन के दौरान उसकी सहायता के लिए श्रीदेवी Maalika Ramanoudjame धन्यवाद।
Polypropylene solid phase extraction cartridges with two frits | Crawford Scientific | 12131017 and 12131015 | 20 mL and 6 mL cartridges used in this preparation |
Trifluoroacetic acid | Tokyo Chemical Industry (Europe) | T0431-100g | >98%; CAUTION can cause severe burns and respiratory irritation |
N-N'-diisopropylcarbodiimide | Sigma Aldrich | 38370-100ML | >98%; CAUTION hazardous to eyes, skin and via respiratory inhalation, may also cause sensitisation |
Dimethylformamide | Fischer Scientific | 10346180 | HPLC grade; CAUTION suspected teratogen |
Acetonitrile | Fischer Scientific | 10407440 | HPLC grade |
Dichloromethane | Fischer Scientific | 10354263 | 99.8%; CAUTION suspected carcinogen |
Bromacetic acid | Sigma Aldrich | 17000-100G | >99%; ; CAUTION causes burns and hazardous to skin, eyes and respiratory tract |
(S)-(-)-alpha methylbenzylamine | Sigma Aldrich | 115568-100G | 98%; CAUTION harmful if swallowed, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nspe monomer |
N-Boc 1,4 diaminobutane | Tokyo Chemical Industry (Europe) | A1373-25g | >98%; CAUTION causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the NLys monomer |
N-Boc 1,2 diaminoethane | Tokyo Chemical Industry (Europe) | A1371-25g | >97%; CAUTION causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nae monomer |
1,2 diaminobutane | Sigma Aldrich | D13208-100G | 99%; CAUTION flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NhArg monomer |
1,4 diaminoethane | Sigma Aldrich | 03550-250ML | >99.5%; CAUTION flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NnArg monomer |
1H-pyrazole-1-carboxamidine HCl | Sigma Aldrich | 402516-10G | as HCl salt; CAUTION harmful if swallowed and may cause an allergic skin reaction, causes serious eye damage |
Hydrazine monohydrate | Sigma Aldrich | 207942-5G | reagent grade; CAUTION suspected carcinogen, fatal if inhaled and causes severe burns to skin and eyes |
2-acetyl dimedone | Novabiochem | 8510150005 | Dde-OH |
Rink Amide resin | Novabiochem | 8551190005 | 100-200 mesh, high loading |
Piperidine | Sigma Aldrich | 411027-1L | >99.5%, a controlled substance, so adequate permission must be obtained before purchase; CAUTION highly flammable liquid and vapour, harmful if swallowed and toxic in contact with skin or if inhaled, causes severe skin burns and eye damage, harmful to aquatic life with long lasting effects |
Triisopropylsilane | Sigma Aldrich | 233781-50G | 98%; CAUTION flammable liquid and vapour, causes skin irritation and serious eye irritation |
alamarBlue | ThermoFischer | DAL1025 | Not classified as hazardous |
Schneider's Insect Medium | Sigma Aldrich | S9895-1L | Powdered, medium must be made prior to use following manafacturers instructions; allow to warm to room temperature before use in biological assays |
96 well plates | VWR | 734-1793 | Flat bottom (to allow fluorescence measurement from the bottom), tissue-culture treated |
Solvent reservoirs | VWR | 613-1182 | Used with multi channel pipette |
Multi channel pipette | Eppendorf | 3122000043 | |
Pipette tips | Starlab Group | S1111-3810, S1113-1810, S1111-6810 | Volume of tip dependent on pipette used. 10 µL, 10 – 200 µL and 1000 µL recommended for assays |
25 cm3 cell culture flasks | VWR | 734-2312 | |
50 mL centrifuge tubes | VWR | 525-0791 | |
dimethylsulphoxide (molecular biology grade) | Sigma Aldrich | D8418-50ML | Not classified as hazardous |
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum | ThermoFischer | 10082139-100mL | Gibco |
Penicillin/Streptomycin | ThermoFischer | 15140148-20mL | Abbreviation: P/S |
Amphotericin B | Sigma Aldrich | 46006-100mg | Amphotericin B trihydrate, VetranalTM analytical standard |