JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Bioquímica

En effektiv metode til syntese af Peptoider med Blandet lysin-type / Arginin-type monomerer og evaluering af deres anti-Leishmania aktivitet

Published: November 02, 2016
doi:
10.3791/54750
, ,
1Department of Chemistry,Durham University, 2School of Medicine, Pharmacy and Health,Durham University

Summary

A protocol to synthesize peptoids with mixed cationic functionality in the same sequence is presented (lysine- and arginine-type monomers). Subsequent testing of these compounds against Leishmania mexicana, the protozoan parasites that cause cutaneous leishmaniasis, is also described.

Abstract

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this procedure amino functionalized ‘lysine’ and guanido functionalized ‘arginine’ peptoid monomers can be included within the same peptoid sequence. This procedure uses on-resin (N-(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)ethyl) or Dde protection, orthogonal conditions to the Boc protection of lysine monomers. Subsequent deprotection allows an efficient on-resin guanidinylation reaction to form the arginine residues. The procedure is compatible with the commonly used submonomer method of peptoid synthesis, allowing simple peptoids to be made using common laboratory equipment and commercially available reagents. The representative synthesis, purification and characterization of two mixed peptoids is described. The evaluation of these compounds as potential anti-infectives in screening assays against Leishmania mexicana is also described. The protozoan parasite L. mexicana is a causative agent of cutaneous leishmaniasis, a neglected tropical disease that affects up to 12 million people worldwide.

Introduction

Peptoider (eller poly- N-substituerede glyciner) er en klasse af peptid-mimetika, der tilbyder lignende egenskaber til peptider og som sådan er i stigende grad undersøgt for lægemidler og materialer applikationer. I peptider, er sidekæden af ​​hver aminosyre forbundet til α-carbonatomet af amidrygraden; i peptoider sidekæderne forskydes på nitrogenatomet i rygraden. Afgørende, dette giver peptoider større resistens over for proteolyse.

Peptoider almindeligvis syntetiseret under anvendelse af submonomer metode udviklet af Zuckermann et al., Hvor peptoid monomerer kan bygges ved sekventiel haloacetylation af en aminfunktionalitet bundet til en fast bærer og efterfølgende forskydning af halogen ved anvendelse af en primær amin. 1 Vores gruppe har for nylig udviklet en tilpasning til denne submonomer metode til at tillade lysin- og arginin-type peptoid rester til at være indbefattet inden for samme peptoid sekvens for fFØRSTE tid. 2 Denne manual fastfase-tilgang til peptoid syntese anvender kommercielt tilgængelige reagenser og Almindeligt laboratorieudstyr, hvilket gør det tilgængeligt for de fleste laboratorier. Peptoider er blevet vist at have lovende aktivitet over for et bredt spektrum af Gram-negative bakterier, gram-positive bakterielle og fungale arter, som er sammenlignelig med mange kendte antimikrobielle peptider. 3-9

I vores arbejde har peptoider blevet brugt som nye anti-infektiøse forbindelser til behandling af den oversete tropesygdom leishmaniasis. 5,10 leishmaniasis er endemisk i mere end 80 lande verden over, og det anslås, at over 12 millioner mennesker er smittet på verdensplan. 11 sygdom er forårsaget af parasitiske protozoer, der transmitteres ved bid af en sandfly. Leishmania arter kan forårsage kutan leishmaniasis, en tilstand, der fører til ardannelse og skader på slimhinder, eller livstruende visceral Leishmaniasis, som forårsager fatal organskade. Ingen vaccine er i øjeblikket tilgængelig for denne sygdom og eksisterende behandlinger er afhængige af et lille antal lægemidler, der har alvorlige bivirkninger. Desuden resistens over for eksisterende lægemidler er en ny og alvorligt problem så nye behandlinger desperat nødvendig for effektivt at behandle leishmaniasis i fremtiden. 12-16

I disse antimikrobielle anvendelser peptoider ofte designet til at være amfipatisk med en blanding af kationiske og hydrofobe monomerer. 3,4 Dette kan give peptoider en grad af selektivitet over bakterieceller, reducere toksiciteten overfor pattedyrsceller, og forbedre deres aktivitet som molekylære transportører . 17-20 størstedelen af den anti-infektive peptoider i litteraturen indeholde kationiske sidekæder, der udelukkende består af enten amino funktionaliseret lysin-type monomerer eller rester arginin-typen. Peptid-peptoid kimærer, hvor de kationiske kæder er sammensat af enmino syrer lysin eller arginin, er også blevet syntetiseret til at undersøge effekten af kationiske grupper på aktivitet og toksicitet. 21-25

Poly-lysin peptoider kan let syntetiseres under anvendelse af kommercielt tilgængelige Boc-beskyttede aminer. De poly-arginin peptoider rapporterede kan fremstilles ved anvendelse af en metode, som anvender pyrazol-1-carboxamidin som et guanidinylation middel. 18. Dette kan imidlertid kun foretages, efter peptoidet er blevet spaltet fra harpiksen og Boc-beskyttelse på sidekæder fjernet, så hver lysin-typen rest i sekvensen er omdannet til en argininrest. I et forsøg på at finjustere de kemiske og biologiske egenskaber af forbindelserne, vi udviklet en fremgangsmåde, som tillader dobbelt kationisk funktionalitet (f.eks, N Lys og N Arg), der skal indgå i et givet peptoid sekvens for første gang. 2

Heri beskriver vi syntesen, oprensning og karakterisering af two hidtil ukendte peptoider, der indeholder både lysin- og arginin-type rester i den samme sekvens. Fremgangsmåden anvender ortogonal N-Boc og N -Dde beskyttelse på harpiks med pyrazol-1-carboxamidin som et guanidinylation reagens. Den biologiske vurdering af disse peptoider er også beskrevet i cytotoksicitetsassays mod Leishmania mexicana, det agens af kutan leishmaniasis. Dette giver en praktisk metode til at få adgang peptoids med dual kationisk funktionalitet og vurdere deres biologiske aktivitet. Det forventes, at denne metode vil hjælpe syntesen af ​​amfipatiske peptoider som peptoide samfund i fremtiden.

Protocol

1. fastfasesyntese af Peptoider BEMÆRK: Peptoider syntetiseres manuelt ved hjælp af proceduren fra fast-fase peptoid syntese submonomer. Denne metode giver høj kobling effektivitet og gode endelige produkt udbytter. Syntese på fast fase giver også overskydende reaktanter fjernes let ved afslutningen af hvert trin, og fremgangsmåden er blevet modificeret her at tillade forskellige funktionaliserede kationiske monomerer (dvs. arginin-type og lysin-type rester) at være indbefattet inden for samme sekvens. 1,2 Syntese af et lineært peptoid Advarsel: Udfør sikkerhedsvurderinger, før du starter syntese. Udfør alle reaktioner i et stinkskab og slid personlige værnemidler som passende (dvs. engangs nitrilhandsker, sikkerhedsbriller og en lab coat). Vær særlig forsigtig, når du bruger følgende reagenser og opløsningsmidler. Dimethylformamid (DMF) er en mistænkt teratogen og dichloromethane (DCM) er kræftfremkaldende. N, N '-diisopropylcarbodiimide (DIC) og piperidin er farlige for øjne, hud, via luftvejene ved indånding og kan forårsage hudsensibilisering. Hydrazin er en mistænkt kræftfremkaldende, dødelig hvis det inhaleres og forårsager alvorlige forbrændinger på huden eller i øjnene. Bromeddikesyre er også farligt for hud, øjne og luftveje og kan forårsage forbrændinger ved kontakt. Trifluoreddikesyre (TFA) er en flygtig væske og kan forårsage alvorlige forbrændinger så håndtere med omhu. Kraftige handsker anbefales. Tilføj 0,12 g Fmoc-beskyttet Rink amid harpiks (0,1 mmol, typisk loading 0,7 mmol / g) til en øvre 20 ml polypropylen reaktionsbeholder med to fritter. Tilsæt 5 ml dimethylformamid (DMF) for at kvælde harpiksen og forlade fartøjet til at stå i mindst 60 minutter ved stuetemperatur. Dræne DMF under anvendelse af en fastfase-ekstraktion vakuum platform. At afbeskytte Fmoc-gruppen på den opsvulmede harpiks, tilsættes 2 ml piperidin-opløsning (20% i DMF v / v). Placer fartøjet påen shaker platform ved stuetemperatur (450 rpm) og omrystes i 5 min. Fjern opløsningen med vakuum station. Gentag Fmoc-afbeskyttelse med 2 ml piperidin opløsning og omrystes i 15 minutter ved stuetemperatur. Dræn løsningen som før. Resinen vaskes ved at tilsætte 2 ml DMF og blanding af harpiksen i 30 sek. Tøm DMF og gentag tre gange mere. For acetyleringen, tilsættes 1 ml bromeddikesyre-opløsning (0,6 M i DMF) og 0,2 ml N, N '-diisopropylcarbodiimide opløsning (DIC, 50% i DMF v / v). Efterlad reaktionsbeholder at ryste i 20 minutter ved stuetemperatur. Dræn løsningen og vask harpiksen med 2 ml DMF tre gange. For forskydningen, tilsættes 1 ml aminopløsning (1,5 M i DMF). Ryst harpiksen i 60 minutter ved stuetemperatur. Dræn løsningen og vask harpiksen med 2 ml DMF tre gange. For at tilføje en arginin-typen monomer Følg trin 1.7. Afhængig af den ønskede peptoid sekvens, forskellige aminervil blive tilføjet. Gentag trin 1.1.4 og 1.1.5. At inkludere en guanidin funktionaliseret monomer (dvs. N Arg), der tilsættes 1 ml ubeskyttet diamin-opløsning (1,5 M i DMF) til harpiksen og omrystes i 60 minutter ved stuetemperatur. Dræn løsningen og vask harpiksen med 2 ml DMF tre gange. Tilsæt 2-acetyldimedone (0,2 g, 1 mmol i 0,5 ml DMF, 10 ækvivalenter) for at tilføje Dde-gruppen til den frie primære amin og omrystes i 60 minutter ved stuetemperatur. Dræn løsningen og vask harpiksen med 2 ml DMF tre gange. Fortsæt submonomer syntese som i 1.1.4 til 1.1.7, indtil den ønskede sekvens er lavet. Der tilsættes 2 ml DMF for at vaske harpiksen og gentag tre gange. At afbeskytte Dde-gruppen på harpiks, tilsættes 4 ml 2% hydrazin-opløsning (i DMF v / v) og rystes i 3 minutter ved stuetemperatur. Dræn løsningen og gentag tre gange. Dræn løsningen og vask harpiksen med 2 ml DMF tre tIME'er. Tilføj pyrazol-1-carboxamidin (6 ækvivalenter pr fri amin, dvs. pr N Arg monomerer, i det minimale volumen af DMF) og N, N-diisopropylethylamin eller DIPEA (6 ækvivalenter pr fri amin) og omrystes ved stuetemperatur i 60 min . Dræn løsningen og vask harpiksen med 2 ml dichlormethan tre gange. Efterlad harpiksen at tørre i luft i 10 min, hvorpå harpiksen kan lagres indtil spaltning (afsnit 2). For at holde pause i syntesen, vask harpiksen med 2 ml DMF tre gange. Der tilsættes 2 ml DMF, tilproppes syntesen fartøj og henstår ved stuetemperatur i et stinkskab. BEMÆRK: Syntesen kan sættes på pause efter enhver forskydning trin (undtagen den anden forskydning trin som diketopiperaziner kan dannes). Sidekæde-afbeskyttelse og spaltning fra harpiks Foretage en test spaltes for at kontrollere status for syntese (renhed og masse) på noget tidspunkt under syntesen efter Displacement trin, tilsætning eller fjernelse af Dde-beskyttelsesgruppen eller efter den endelige sekvens er blevet foretaget. Overfør ca. 10 harpiksperler fra reaktionsbeholderen ind i et nyt 8 ml polypropylen frittet patron. Der tilsættes 1 ml trifluoreddikesyre spaltningscocktailen (indeholdende 95% TFA, 2,5% H2O, 2,5% triisopropylsilan) og rystes i 90 minutter ved stuetemperatur. Foretage TFA spaltningscocktailen fra harpiksen under anvendelse af frittet reaktionsbeholder til en 10 ml rundbundet kolbe. Fordampe spaltningscocktailen anvendelse af en rotationsinddamper og genopløse den resulterende olie i 1 ml acetonitril / vand til forelæggelse for LC-MS eller analytisk HPLC. For den endelige spaltning: i samme frittet polypropylen reaktion patron anvendes til syntese, tilsættes 4 ml TFA spaltningscocktailen (95% TFA, 2,5% H2O, 2,5% triisopropylsilan) og tildækkes fartøjet. Omrystes i 90 minutter ved stuetemperatur. Filter the TFA spaltningscocktailen fra harpiksen under anvendelse af frittet reaktionsbeholder i en 50 ml rundbundet kolbe. Fordampe spaltningscocktailen anvendelse af en rotationsfordamper. Efter TFA er fjernet, skal produktet opnået som en olie. Til hjælp TFA fjernelse fra denne råolie, tilsættes 2 ml vandfri diethylether og peptoidet bør udfældes. Enten fjerne diethylether via pipette og kassér eller fordampe under anvendelse af en rotationsfordamper. Gentag diethylether udfældning tre gange. Opløs det rå peptoid i 10 ml acetonitril / syrnet vand-opløsning (50% acetonitril, 0,1% TFA i vand v / v). Overførsel til en forud vejet beholder, fryses ved 20 ° C og lyofiliseres til et tørt pulver. 2. Karakterisering og oprensning BEMÆRK: peptoid syntese kan overvåges, og den endelige peptoid vurderet via analytisk revers-fase-HPLC under anvendelse af en C18-søjle og electrospray væske-chromatografi-massespektrometri (LC-MS). Alle HPLC opløsningsmidler af opløsningsmidler til LC-MS bør være frisklavet. analytisk HPLC Afvej 1 mg peptoid i et lille hætteglas. Tilsæt mindste mængde acetonitril til at opløse og fortyndes til 1 ml med vand. Sørg for, at peptoid er helt opløst. Der indsprøjtes 10 pi til analytisk HPLC (foreslået gradient 0 – 100% opløsningsmiddel B i løbet af 30 minutter, hvor opløsningsmiddel A = 95% vand, 5% acetonitril, 0,05% TFA og opløsningsmiddel B = 95% acetonitril, 5% vand, 0,03% TFA) , i henhold til producentens anvisninger. Visualiser UV-spektrum ved 220 nm. ESI LC-MS Lav 1 mg / ml peptoid opløsning som i trin 2.1.1. Injicer 1 pi til elektrospray LC-MS for at bestemme om den molekylære vægt af målet peptoid er til stede, efter fabrikantens instruktioner. Check målet masse af peptoide sekvens under anvendelse af en PeptOID regnemaskine, som pr vejledningen på lommeregneren. 26 Dette web hjælpeprogram giver også mulighed for overdragelse af eventuelle annullering / tilføjelse produkter set i massespektret. 26 Præparativ omvendt fase-HPLC Opløs rå peptoider i 2 ml syrnet vand / acetonitril (95% vand, 5% MeCN-, 0,1% TFA) og renses ved præparativ RP-HPLC ved anvendelse af fabrikantens protokol. Bestem gradienten af ​​elueringstiden opnået fra analytisk HPLC, og mængden injicerede vil afhænge kolonnedimensionerne. Visualisere under anvendelse af en detektor sat ved 220 nm. Opsaml fraktioner i 15 ml centrifugerør, fryse ved 20 ° C og lyofiliseres. Re-analysere fraktionerne ved LC-MS og analytisk HPLC ifølge producentens protokol. Rekombinere oprensede fraktioner. 3. Biologisk Test mod Leishmania Mexicana Parasitter Caution:. Sikkerhedsvurderinger skal udføres, før du starter syntese Leishmania mexicana er klassificeret en fare gruppe 2 patogen i Storbritannien og passende kontrolforanstaltninger skal være på plads før der begynder testning. Alt arbejde skal udføres i en klasse 2 mikrobiologiske sikkerhed kabinet og personlige værnemidler bæres som passende (dvs. nitrilhandsker, sikkerhedsbriller og en lab coat). Subkultur af parasitter Optø 1 ml -150 ° C frossen stamopløsning Leishmania mexicana M379 ved at placere hætteglasset i et 37 ° C vandbad i 30 sek. Overfør stamopløsning til 10 ml Schneiders Insect medium (ved pH 7,0 suppleret med 15% varmeinaktiveret føtalt bovint serum og 1% penicillin / streptomycin) i en 25 cm3 cellekultur kolbe med en ikke-ventileret hætte. Inkuber ved 26 ° C i 72 timer. Undersøg parasitter under mikroskop (400X forstørrelse) for at kontrollere tilstanden. they bør være insekt fase promastigoter, procykliske former i log-fase med mange delende celler. Oprethold procykliske promastigoter ved sub-dyrkning parasitter til en koncentration på 5 x 10 5 parasitter / ml hver tredje dag. Tæl celler under anvendelse af et Neubauer forbedret hæmocytometer. Transformation af L. mexicana insekt etape i pattedyr scene axenisk amastigote formular 27 Dag 0: Forbered 10 ml kultur af log stadie parasitter på 5 x 10 5 parasitter / ml i Schneiders Insect medium (ved pH 7,0 suppleret med 15% varmeinaktiveret føtalt bovint serum og 1% penicillin / streptomycin) i en 25 cm3 celle kultur kolbe med en ikke-ventileret hætte. Inkuber ved 26 ° C i 48 timer. Dag 3: Overfør 10 ml kultur til en 50 ml centrifugerør og centrifugeres ved 447 xg i 5 min. Hæld gamle medium og tilsæt 10 ml Schneiders Insect medium (ved pH 5,5 suppleret med 20% hspise-inaktiveret føtalt bovint serum og 1% penicillin / streptomycin). resuspenderes forsigtigt pellet af parasitter i det nye medie ved hjælp af en pipette. Tæl antallet af parasitter ved hjælp af et Neubauer forbedret hæmocytometer. Fortyndes til en koncentration på 5 x 10 5 parasitter / ml med pH 5,5 medium og overføres til en 25 cm3 celle dyrkningskolbe. Inkuber ved 26 ° C i ca. 6 dage. Dag 9: Undersøg parasitter under et mikroskop (400X). De bør være i den ikke-replikerende, infektiøs metacyclic promastigote fase. Tæl antallet af parasitter ved hjælp af et Neubauer forbedret hæmocytometer. Fortyndes til en koncentration på 5 x 10 5 parasitter / ml med pH 5,5 medium. Fjern 10 ml cellekultur og overførsel til cellekultur kolbe. Inkuber ved 32 ° C i 5 dage. Dag 14: Kontroller udseendet af parasitter under mikroskop (400X). De bør være i det patogene amastigote fase, der mangler flagel karaktermer inden for promastigoter, og klar til analyse. Cytotoksicitetsanalyse på L. Mexicana Axeniske amastigoter. BEMÆRK: Den biologiske afprøvning af peptoider anvender high-throughput assays udført i plader med 96 brønde. Denne protokol beskriver afprøvning af L. Mexicana Axeniske amastigoter, men identiske analyser kan også udføres på promastigote stadie parasitter i passende medier. Forbindelser inkuberes med parasitter i koncentrationer fra 3 – 100 uM i 60 minutter og derefter inkuberet i 24 timer efter en 10-fold fortynding. Resultater er opnået ved måling af fluorescensen af brønde efter inkubering med Resazurin-baserede cellernes levedygtighed opløsning (f.eks alamarBlue). Forbered sammensatte stamopløsninger. Afvejes 1 mg af det endelige rensede peptoid produkt ved hjælp af en analytisk balance. Derpå tilsættes en passende mængde af molekylærbiologisk kvalitet dimethylsulfoxid (DMSO) til en koncentration på 5 mM. Lav 6 pi alikvoter ognedfryses til -20 ° C. Forbered forbindelsesopløsningerne på 96 brønds plader (en anbefalet pladelayout kan ses i resultatafsnittet, figur 6) i tre eksemplarer 100-3 uM. Tilsæt 2 pi 5 mM stamopløsning af hver forbindelse i den øverste række (dvs. A). Tilføj 48 pi frisk Schneiders Insect medium (ved pH 5,5 og 20% ​​føtalt bovint serum (FBS), 1% penicillin / streptomycin (P / S)) til øverste række ved anvendelse af en multi-kanal pipette. Tilsæt 25 pi Schneiders Insect medium til alle andre rækker (B – F). Udfør en seriel fortynding ved pipettering 25 pi løsning fra den øverste række. Tilføj til rækken under og blandes. Udfør fortyndinger indtil den sidste række, hvor den sidste 25 pi opløsning skal kasseres. Brug amphotericin B (5 mM stamopløsninger) som en positiv kontrol og DMSO (2% opløsning) som en negativ kontrol i tre eksemplarer. Forbered parasit opløsning: overførsel kultur til et 50 ml centrifugerør og centrifugeres ved447 x g i 5 min. Hæld gamle medium og tilsættes 10 ml Schneiders Insect medium (ved pH 5,5 og 20% ​​FBS, 1% P / S). Forsigtigt pellet opløses af parasitter i det nye medie ved hjælp af en pipette og tælle bruge en Neubauer forbedret hæmocytometer. Fortynd kulturen til 8 x 10 6 parasitter / ml. Tilsæt 25 pi L. mexicana kultur til hver brønd. Pladerne inkuberes i 60 minutter ved 32 ° C. Fjern plade fra inkubatoren og fjerne 40 pi opløsning fra hver brønd. Tilføj 90 pi frisk medium og inkuberes i 24 timer ved 32 ° C. Tilsæt 10 pi Resazurin-baserede cellernes levedygtighed opløsning til hver brønd. Der inkuberes i 4 timer ved 32 ° C. Mål fluorescens under anvendelse af en pladelæser (λ ex = 540 nm, λ em = 600 nm), i henhold til producentens anvisninger. Analysere data ved at fjerne gennemsnitlige baggrund (fra medium kun brønde) og sammenligne fluorescensen af ​​brønde efter normalisering med hensyn til than DMSO kontrol.

Representative Results

Som et repræsentativt resultat, syntese og karakterisering af to 12 peptoider remanens indeholdende to lysin-type monomerer og to-arginin monomerer hver vil blive beskrevet. De efterfølgende resultater fra cytotoksicitet assay er også vist. To peptoider [(N nArg N spe N SPE) (N ae N spe N spe)] 2 (a) og [(N hArg N spe N SPE) (N Lys N spe N spe)] 2 (b) blev syntetiseret ved anvendelse 120 mg Rink amid harpiks hver (loading = 0,79 mmol / g). Alle acetylering og forskydning trin blev udført som beskrevet ovenfor, med alle købes kommercielt reagenser. For disse rester blev følgende aminer anvendt i fortrængningstrinet: N spe (S) – (-) – α-methylbenzylamin, N ae N – (tert-butoxycarbonyl) -1,2-diaminoethane, N Lys N – (tert-butoxycarbonyl) -1,4-diaminobutan. For argininderivatet rester blev følgende ubeskyttede diaminer koblet: N hArg 1,4-diaminobutan eller N nArg 1,2-diaminoethan, efterfulgt af mod-harpiks beskyttelse med 2-acetyldimedone (Dde-OH). Efter hele sekvensen var blevet syntetiseret, hydrazin afbeskyttelse af Dde giver frie aminer til guanidinylate. Figur 1. peptoid strukturer (a) [(N nArg N spe N SPE) (N ae N spe N spe)] 2 og (b) [(N hArg N spe N spe) (N <stro ng> Lys N spe N spe)] 2. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 2. Den anvendte metode til at syntetisere blandede arginin / lysin peptoider. I. Standard forskydning trin i submonomer metoden med diamin; ii. Tilsætning af Dde-OH, 90 minutter til at beskytte fri amin; iii. Yderligere tilføjelser til udvide peptoid kæde ved hjælp af submonomer metode; iv. Afbeskyttelse af Dde ved anvendelse af 2% hydrazin i DMF; . V Guanidinylation af fri amin på harpiksen med pyrazol-1-carboxamidin og DIPEA i DMF; vi. Sure spaltning fra harpiksen og afbeskyttelse af Boc-grupperne.large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal. Efter spaltning fra harpiksen og lyofilisering blev de rå produkter opnået som hvide pulvere: (a) 154 mg, (b) 163 mg. Produkter blev oprenset via RP-HPLC som beskrevet med højst 50 mg injektioner under anvendelse af en LC pumpe med en UV-vis detektor (λ = 250 nm) på en analytisk kolonne, 250 mm x 10 mm, 5 um; strømningshastighed = 2 ml / min. Fraktioner svarende til målet massen blev kombineret og opnået som hvide pulvere: (a) 54 mg (b) 65 mg, endelige udbytter på cirka 30% for fraktionerne> 90% ren. Slutforbindelsen identiteter efter oprensning blev bekræftet ved LC-MS (se figur 3) ved anvendelse af et tredobbelt kvadrupol massespektrometer udstyret med en UPLC og en fotodiodearraydetektor. Nøjagtig masse spektrometri blev foretaget under anvendelse af samme spektrometer på t han [M + 2H] 2+ ioner. Følgende beregnede og observerede masser blev fundet i tæt aftale (Figur 4): (a) beregnet = 896,0026 amu, observeret = 896,0038 amu; (B) beregnet = 952,0691 amu, observeret = 952,0730 amu. Figur 3. LC-MS for oprensede peptoider. (A) m / z = 1.792 og (b) m / z = 1.903. Hvor toppen er TIC, midterste LC-MS-spektret, bund UV kromatogram ved 220 nm. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 4. Nøjagtig masse spektrometri data for peptoider (a) og (b)."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/54750/54750fig4large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal. Produkt renhed blev vurderet ved anvendelse af en analytisk RP-HPLC (LC pumpe med en UV-vis detektor på en analytisk søjle, 4,6 mm x 100 mm, 3,5 um; strømningshastighed = 1 ml / min), og visualiseret ved 220 nm, absorbansen af amidrygraden. Figur 5a og 5b viser, at forbindelserne er homogene. Figur 5. Analytisk HPLC for de oprensede peptoider (a) og (b). Der er en gradient 0-100% B i løbet af 30 minutter, kolonne ovn ved 40 ° C (A = 95% H2O, 5% MeCN, 0,05 % TFA;. B = 95% MeCN, 5% H 2 O, 0,03% TFA) venligst click her for at se en større version af dette tal. De oprensede peptoider (a) og (b) blev testet i cytotoksicitetsanalyser mod L. Mexicana Axeniske amastigoter. Frosne lagre af L. mexicana blev optøet og transformeret til amastigote fase klar til assayet. 72 timer efter optøning, bør parasitterne være insekt etape promastigoter i deres procyklisk formular, i log-fase med mange delende celler. På dette stadium parasitterne kan transformeres til den amastigote trin under anvendelse af pH og temperatur skift beskrevet. 27 på dag 9 af transformation, vil parasitterne være i den ikke-replikerende infektiøst metacyclic promastigote fase. Endelig på dag 14, bør parasitterne være i den patogene amastigote fase, hvor parasitter mangler den karakteristiske flageller af promastigoter. 28 5 mM stamopløsninger af forbindelserne blev fremstillet i cellekulturkvalitet DMSO og testes i triplikater påmindst to gange for at sikre en robust datasæt blev opsamlet. En repræsentativ 96-brønds plade plan er vist i figur 6. Ved afslutningen af assayet blev cellelevedygtigheden reagens tilsat til hver brønd, og fluorescens blev målt som beskrevet til beregning af levedygtighed parasitter ved hver testet koncentration (se figur 7 ). ED50-værdier blev beregnet som peptoid (a)> 100 uM og peptoid (b) 37 uM hhv. Fejlsøjlerne plottet, viser variationen mellem brønde som en standardafvigelse, og det kan ses, at disse er rimelige for de fleste barer. Figur 6. Repræsentative 96 brønds plade plan for en cytotoksicitet assay på 2 peptoid opløsninger (herunder positive og negative kontroller). With + = medium (Schneiders Insect Medium, pH 5,5, 20% FBS, 1% P / S). L. mex. =8 x 10 6 / ml parasit kultur i Med +. AmphoB = 5 mM i DMSO. Peptoid = 5 mM stamopløsning i DMSO. Tomme brønde bør indeholde sterilt vand. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 7. Resultater fra cytotoksicitet assay mod L. Mexicana axenisk amastigote parasitter ved hjælp peptoid (a) og (b). Det kan ses, at peptoidet (b) er mere effektiv end peptoid (a) at reducere procentdelen af levedygtige parasitter, med begge forbindelser har en dosisafhængig virkning. Fejlsøjlerne afbildede viser variationen mellem brønde som en standardafvigelse. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Peptoider i stigende grad undersøges inden for den kemiske biologi og medicinske kemi felter i applikationer såsom nye lægemidler 3-5, celle levering agenter 18,20 og diagnostiske værktøjer. 29 Typisk er disse sekvenser er kationiske at give en grad af selektivitet for patogenet i pattedyrceller, evnen til at trænge gennem cellemembraner og også hjælpe opløselighed i vandige systemer. Der er talrige eksempler på kationiske peptoider, der indeholder udelukkende lysin- eller arginin-mimetiske rester i litteraturen. Men til dato, syntesen af ​​peptoider, som indeholder begge disse kationiske rester i den samme sekvens er blevet hæmmet af manglen på en egnet syntesefremgangsmåde. Protokollen beskrevet her tillader blandede kationiske peptoider at blive syntetiseret på en effektiv måde og er meget ønskeligt, da det giver en rute til at modulere de biologiske og kemiske egenskaber amfipatiske peptoids.

nt "> Vores metode anvender en tilpasning til den almindeligt anvendte submonomer peptoid syntese og muliggør tilføjelse af både lysin- og arginin-type monomerer inden for samme sekvens. Det bruger stuetemperatur koblinger og etableret beskyttelsesgruppe kemi så det forventes, at denne metode vil være nyttig for størstedelen af ​​forskningsgrupper. for at tilføje ortogonal beskyttelse af arginin-typen rest, tilsættes en ubeskyttet diamin under standard forskydning betingelser og beskyttes derefter i en 60-minutters kobling med Dde-OH. en række diaminer kan være anvendes der tillader sidekæder fra 2 carbonatomer til 6 carbonatomer lang til at blive installeret, dvs. 1,2-diaminoethan til 1,6-diaminohexan henholdsvis. Den beskyttende Dde-OH opløses godt i DMF og er en meget effektiv og selektiv beskyttelsesgruppe for primære aminer. DDE-beskyttelsesgruppe blade sekundære aminer upåvirket, f.eks den ubeskyttede N-terminalen af peptoid kæde. 30 En begrænsning er, at alle synafhandling blev foretaget manuelt; imidlertid forventes det, at de koblingsbetingelser udviklede gøre metoden medgørlige til anvendelse med automatiserede peptid / peptoid synthesizere.

Den på harpiks afbeskyttelse af Dde-grupper udføres ved anvendelse af en 2% hydrazin-opløsning i DMF at efterlade frie aminer, der kan guanidinylated på harpiksen ved anvendelse af pyrazol-1-carboxamidin. Seks ækvivalenter af pyrazol-1-carboxamidin og seks ækvivalenter DIPEA anvendes per fri amin på harpiksen (dvs. seks ækvivalenter for hver N Arg typen monomer, der skal installeres). Igen, denne reaktion er også effektiv og pyrazol-1-carboxamidin reagens har god opløselighed i DMF. Færdiggørelse af reaktionen typisk ses via LC-MS efter 60 minutter ved stuetemperatur.

På grund af den alsidighed submonomer fremgangsmåde kan en lang række primære aminer anvendes i fortrængningstrinet så betingelser kan skal optimeres for at forøge koblingen effeffektivitet og overordnede produkt udbytter eller renhed. 31 For sekvenserne beskrevet ovenfor, var det ikke nødvendigt med særlige betingelser for succesfulde koblinger. Imidlertid kunne længere forskydning gange eller højere koncentrationer amin anvendes til problematiske forskydninger (dvs. for dårligt nukleofile eller sterisk voluminøse aminer). Nogle aminer kan ikke fuldt opløselige i DMF, i hvilket tilfælde det anbefales at opløse disse i N-methyl-2-pyrrolidon (NMP), eller andre egnede opløsningsmidler til fastfase-reaktioner i stedet som i en tidligere samlet fremgangsmåde til submonomer syntese af peptoider. 32 til at optage monomerer, der indeholder ubeskyttede heteroatomer i sidekæderne, acetylering under anvendelse chloreddikesyre har vist sig at være effektiv ved andre grupper. 33 Endvidere kan andre harpikser anvendes med denne metode til opnåelse af peptoider med forskellige C-terminal funktionalisering. Wang-harpikser og 2-chlortritylchlorid harpikser anvendes rutinemæssigt isubmonomer syntese af peptoider. For eksempel har denne metode været brugt med held med 2-chlortritylchloridharpiks i vores gruppe. 2 forskellige faste bærere vil kræve en anden loading procedure til Rink amid diskuteret her (afhænger af den specifikke anvendte harpiks), så dette bør kontrolleres med litteraturen før syntese.

Svarende til peptidsyntese, kan betingelserne for den endelige spaltning af peptoidet off harpiks også optimeres for den specifikke sekvens. I denne protokol, blev en TFA spaltning cocktail bruges (med triisopropylsilan og vand som skraldemanden). De peptoider præsenteres her kun indeholdt Boc beskyttelse, der er et rimeligt syrelabil gruppe. For at sikre fuldstændig afbeskyttelse af sekvenser med en større andel af beskyttede rester eller mindre syrelabile beskyttelsesgrupper, længere spaltningsprodukter kan være nødvendigt (dvs. spaltnings gange på over 2 timer anbefales til sekvenser, som indeholder Pbf eller tertiær-buTyl ester beskyttede grupper). Alternative scavengers kan også anvendes til specialiserede sidekæder (fx ethandithiol eller 2-mercaptoethanol ofte anvendes i peptider, der har svovlholdige sidekæder såsom cystein eller methionin).

Den biologiske assay præsenteret er en standard cytotoksicitet test, som kan ændres til at passe til forskellige cellelinier. Det er vigtigt at bemærke, at hver plade med 96 brønde bør indeholde tilstrækkelig kontrol til at tillade tillid i de opnåede resultater. I dette tilfælde er amphotericin B anvendt som en positiv kontrol, da det er et kendt lægemiddel til behandling af sygdommen og DMSO anvendes som en negativ kontrol, da dette er det opløsningsmiddel, der anvendes til at gøre sammensatte lagre til assayet. Hvis der bruges andre cellelinjer, bør indhentes alternative, passende kontrol og valideres før brug. L. mexicana inkuberes med peptoidet ved koncentrationer mellem 100 og 2 uM i en time, og derefter parasitten / peptoide opløsning fortyndes meden faktor ti for inkubering natten over (dvs. brønde i første omgang med 100 pM peptoid lager fortyndes til 10 uM).

Den cellelevedygtigheden reagens tilsættes til hver brønd (10% af total brønd volumen) ved slutningen af ​​assayet. En synlig farveændring ses mellem brønde med levedygtige parasitter (pink), kontrol brønde uden levedygtige parasitter (blå) og et spektrum mellem med mellemliggende antal levedygtige parasitter. Fluorescensen er proportional med antallet af levende celler og svarer til den metaboliske aktivitet af cellerne; Resazurinfarvestof (ikke-fluorescerende) omdannes til den fluorescerende resorufin ved reduktionsreaktioner i metabolisk aktive celler. 34. I dette assay har inkubationstiden med cellelevedygtigheden reagens er optimeret til L. mexicana. Inkubationstider med levedygtigheden reagens vil variere for plader podet ved forskellige cellekoncentrationer eller med forskellige cellelinjer (fx også kan bruges denne metodemed pattedyrsceller). Afhængig af den nøjagtige pladelæser anvendes, skal foretages, inden fluorescensmålinger tages hensyn. Eventuelle luftbobler i brønde skal fjernes for at sikre, kan tages nøjagtige målinger. Nogle pladeaflæsere læse fra bunden af ​​plader, i hvilket tilfælde fladbundede plader med 96 brønde bør anvendes. Andre maskiner kan læses fra toppen af ​​pladen, så låget af pladen skal fjernes før måling.

Endelig i fremtiden, kan denne protokol være forenelig med automatiserede synthesizere, der er i stand til at gøre mange sekvenser parallelt. Derudover syntesen af ​​cykliske peptoider er også muligt ved hjælp af denne metode. Denne protokol skal give forskere med en praktisk syntetisk procedure, der kan bruges til at få adgang nye peptoid stilladser med både lysin- og arginin-type monomerer, som kan være til nytte i mange applikationer, herunder materialer eller medicinske områder.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker Engineering og Physical Sciences Research Council (EPSRC) om økonomisk støtte (HLB). Vi takker også Sridevi Maalika Ramanoudjame for hendes hjælp under indspilningen af ​​denne procedure.

Materials

Polypropylene solid phase extraction cartridges with two frits Crawford Scientific 12131017 and 12131015 20 mL and 6 mL cartridges used in this preparation
Trifluoroacetic acid Tokyo Chemical Industry (Europe) T0431-100g >98%; CAUTION can cause severe burns and respiratory irritation
N-N'-diisopropylcarbodiimide Sigma Aldrich 38370-100ML >98%; CAUTION hazardous to eyes, skin and via respiratory inhalation, may also cause sensitisation
Dimethylformamide Fischer Scientific 10346180 HPLC grade; CAUTION suspected teratogen
Acetonitrile Fischer Scientific 10407440 HPLC grade
Dichloromethane Fischer Scientific 10354263 99.8%; CAUTION suspected carcinogen
Bromacetic acid Sigma Aldrich 17000-100G >99%; ; CAUTION causes burns and hazardous to skin, eyes and respiratory tract
(S)-(-)-alpha methylbenzylamine Sigma Aldrich 115568-100G 98%; CAUTION harmful if swallowed, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nspe monomer
N-Boc 1,4 diaminobutane Tokyo Chemical Industry (Europe) A1373-25g >98%; CAUTION causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the NLys monomer
N-Boc 1,2 diaminoethane Tokyo Chemical Industry (Europe) A1371-25g >97%; CAUTION causes severe skin burns and eye damage, used to synthesise the Nae monomer
1,2 diaminobutane Sigma Aldrich D13208-100G 99%; CAUTION flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NhArg monomer
1,4 diaminoethane Sigma Aldrich 03550-250ML >99.5%; CAUTION flammable liquid and vapour, harmful if swallowed or inhaled, toxic in contact with skin, causes severe skin burns and eye damage, used in the synthesis of the NnArg monomer
1H-pyrazole-1-carboxamidine HCl Sigma Aldrich 402516-10G as HCl salt; CAUTION harmful if swallowed and may cause an allergic skin reaction, causes serious eye damage
Hydrazine monohydrate Sigma Aldrich 207942-5G reagent grade; CAUTION suspected carcinogen, fatal if inhaled and causes severe burns to skin and eyes
2-acetyl dimedone Novabiochem 8510150005 Dde-OH
Rink Amide resin Novabiochem 8551190005 100-200 mesh, high loading 
Piperidine Sigma Aldrich 411027-1L >99.5%, a controlled substance, so adequate permission must be obtained before purchase; CAUTION highly flammable liquid and vapour, harmful if swallowed and toxic in contact with skin or if inhaled, causes severe skin burns and eye damage, harmful to aquatic life with long lasting effects
Triisopropylsilane Sigma Aldrich 233781-50G 98%; CAUTION flammable liquid and vapour, causes skin irritation and serious eye irritation
alamarBlue ThermoFischer  DAL1025 Not classified as hazardous
Schneider's Insect Medium Sigma Aldrich S9895-1L Powdered, medium must be made prior to use following manafacturers instructions; allow to warm to room temperature before use in biological assays
96 well plates VWR 734-1793 Flat bottom (to allow fluorescence measurement from the bottom), tissue-culture treated
Solvent reservoirs VWR 613-1182 Used with multi channel pipette
Multi channel pipette Eppendorf 3122000043
Pipette tips Starlab Group S1111-3810, S1113-1810, S1111-6810 Volume of tip dependent on pipette used. 10 µL, 10 – 200 µL and 1000 µL recommended for assays
25 cm3 cell culture flasks VWR 734-2312
50 mL centrifuge tubes VWR 525-0791
dimethylsulphoxide (molecular biology grade) Sigma Aldrich D8418-50ML Not classified as hazardous
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum ThermoFischer  10082139-100mL Gibco
Penicillin/Streptomycin ThermoFischer  15140148-20mL Abbreviation: P/S
Amphotericin B Sigma Aldrich 46006-100mg Amphotericin B trihydrate, VetranalTM analytical standard
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. Efficient method for the preparation of peptoids oligo(N-substituted glycines) by submonomer solid-phase synthesis. J. Am. Chem. Soc. 114, 10646-10647 (1992).
  2. Bolt, H. L., Cobb, S. L. A practical method for the synthesis of peptoids containing both lysine-type and arginine-type monomers. Org. Biomol. Chem. 14, 1211-1215 (2016).
  3. Mojsoska, B., Zuckermann, R. N., Jenssen, H. Structure-activity relationship study of novel peptoids that mimic the structure of antimicrobial peptides. Antimicrob Agents Chemother. , (2015).
  4. Chongsiriwatana, N. P., et al. Peptoids that mimic the structure, function, and mechanism of helical antimicrobial peptides. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 2794-2799 (2008).
  5. Eggimann, G. A., Bolt, H. L., Denny, P. W., Cobb, S. L. Investigating the Anti-leishmanial Effects of Linear Peptoids. Chem Med Chem. 10, 233-237 (2015).
  6. Kapoor, R., et al. Antimicrobial Peptoids Are Effective against Pseudomonas aeruginosa Biofilms. Antimicrob. Agents Chemother. 55, 3054-3057 (2011).
  7. Ryge, T. S., Frimodt-Moller, N., Hansen, P. R. Antimicrobial activities of twenty lysine-peptoid hybrids against clinically relevant bacteria and fungi. Chemotherapy. 54, 152-156 (2008).
  8. Huang, M. L., Benson, M. A., Shin, S. B. Y., Torres, V. J., Kirshenbaum, K. Amphiphilic Cyclic Peptoids That Exhibit Antimicrobial Activity by Disrupting Staphylococcus aureus Membranes. Eur. J. Org. Chem. , 3560-3566 (2013).
  9. Huang, M. L., Shin, S. B. Y., Benson, M. A., Torres, V. J., Kirshenbaum, K. A Comparison of Linear and Cyclic Peptoid Oligomers as Potent Antimicrobial Agents. Chem Med Chem. 7, 114-122 (2012).
  10. Bolt, H. L., Eggimann, G. A., Denny, P. W., Cobb, S. L. Enlarging the Chemical Space of Anti-leishmanials: a Structure-Activity Relationship Study of Peptoids against Leishmania mexicana, a Causative Agent of Cutaneous Leishmaniasis. Med Chem Comm. , (2016).
  11. Chon, S. Y., et al. Antibiotic overuse and resistance in dermatology. Dermatologic therapy. 25, 55-69 (2012).
  12. Alvar, J., et al. Leishmaniasis Worldwide and Global Estimates of Its Incidence. PLOS ONE. 7, (2012).
  13. Croft, S. L., Barrett, M. P., Urbina, J. A. Chemotherapy of trypanosomiases and leishmaniasis. Trends Parasitol. 21, 508-512 (2005).
  14. Kedzierski, L. Leishmaniasis Vaccine: Where are We Today?. J Global Infect Dis. 2, 177-185 (2010).
  15. Croft, S. L., Sundar, S., Fairlamb, A. H. Drug resistance in leishmaniasis. Clin Microbiol Rev. 19, 111-126 (2006).
  16. Huang, W., et al. Learning from Host-Defense Peptides: Cationic, Amphipathic Peptoids with Potent Anticancer Activity. PLOS ONE. 9, (2014).
  17. Wender, P. A., et al. The Design, Synthesis, and Evaluation of Molecules That Enable or Enhance Cellular Uptake: Peptoid Molecular Transporters. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 97, 13003-13008 (2000).
  18. Schröder, T., et al. Peptoidic Amino- and Guanidinium-Carrier Systems: Targeted Drug Delivery into the Cell Cytosol or the Nucleus. J. Med. Chem. 51, 376-379 (2008).
  19. Kömel, D. K., et al. Cell-penetrating peptoids: Introduction of novel cationic side chains. Eur. J. Med. Chem. 79, 231-243 (2014).
  20. Hein-Kristensen, L., Knapp, K. M., Franzyk, H., Gram, L. Bacterial membrane activity of α-peptide/β-peptoid chimeras: Influence of amino acid composition and chain length on the activity against different bacterial strains. BMC Microbiology. 11, 1-12 (2011).
  21. Su, Y., Doherty, T., Waring, A. J., Ruchala, P., Hong, M. Roles of Arginine and Lysine Residues in the Translocation of a Cell-Penetrating Peptide from (13)C, (31)P and (19)F Solid-State NMR. Biochem. 48, 4587-4595 (2009).
  22. Andreev, K., et al. Guanidino groups greatly enhance the action of antimicrobial peptidomimetics against bacterial cytoplasmic membranes. BBA Biomembranes. 1838, 2492-2502 (2014).
  23. Foged, C., et al. Cellular uptake and membrane-destabilising properties of alpha-peptide/beta-peptoid chimeras: lessons for the design of new cell-penetrating peptides. BBA Biomembranes. 1778, 2487-2495 (2008).
  24. Vedel, L., et al. Antiplasmodial and prehemolytic activities of alpha-peptide-beta-peptoid chimeras. Chem Bio Chem. 8, 1781-1784 (2007).
  25. Lear, S., Cobb, S. L. Pep-Calc.com: a set of web utilities for the calculation of peptide and peptoid properties and automatic mass spectral peak assignment. J Computer-Aided Mol Des. , 1-7 (2016).
  26. Bates, P. A. Complete developmental cycle of Leishmania mexicana in axenic culture. Parasitol. 108, 1-9 (1994).
  27. Gossage, S. M., Rogers, M. E., Bates, P. A. Two separate growth phases during the development of Leishmania in sand flies: implications for understanding the life cycle. Int J Parasitology. 33, 1027-1034 (2003).
  28. Seo, J., Lee, B. C., Zuckermann, R. N., Ducheyne, P. . Comp Biomaterials. 2, 53-76 (2011).
  29. Nash, I. A., Bycroft, B. W., Chan, W. C. Dde – A selective primary amine protecting group: A facile solid phase synthetic approach to polyamine conjugates. Tetrahedron Lett. 37, 2625-2628 (1996).
  30. Culf, A. S., Ouellette, R. J. Solid-phase synthesis of N-substituted glycine oligomers (alpha-peptoids) and derivatives. Molecules. 15, 5282-5335 (2010).
  31. Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Solid-phase Submonomer Synthesis of Peptoid Polymers and their Self-Assembly into Highly-Ordered Nanosheets. J Vis Exp. , e3373 (2011).
  32. Burkoth, T. S., Fafarman, A. T., Charych, D. H., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. Incorporation of unprotected heterocyclic side chains into peptoid oligomers via solid-phase submonomer synthesis. J. Am. Chem. Soc. 125, 8841-8845 (2003).
  33. Nakayama, G. R., Caton, M. C., Nova, M. P., Parandoosh, Z. Assessment of the Alamar Blue assay for cellular growth and viability in vitro. J Immunol Methods. 204, 205-208 (1997).

Tags

PeptoidsLysineArginineAnti-leishmanial ActivityCutaneous LeishmaniasisLeishmania MexicanaSubmonomer SynthesisFmoc-protected ResinPiperidineBromoacetic AcidDICAmine Solution

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Bolt, H. L., Denny, P. W., Cobb, S. L. An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity. J. Vis. Exp. (117), e54750, doi:10.3791/54750 (2016).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image