对于拟肽与他们抗利什曼原虫活性混合赖氨酸型/精氨酸型单体及评价合成的有效方法

类肽的1固相合成注：拟肽是使用固相拟肽合成的submonomer步骤手动合成。该方法允许高耦合效率和良好的最终产品的收率。上的固相合成也允许过量反应物可以在各步骤结束时容易地除去，并且该方法已在这里修改，以允许不同的官能化阳离子单体（ 即，精氨酸型和赖氨酸型残基）被包括在同一个序列1,2 线性拟肽的合成 注意：在开始之前，合成开展安全评估。开展在通风橱中的所有反应，并穿戴适当的个人防护装备合适的（ 即一次性丁腈手套，防护眼镜和白大褂）。使用以下试剂和溶剂时要特别当心。二甲基甲酰胺（DMF）中是一种可疑的致畸以及dichloromethane（DCM）是一种致癌物。N，N'-diisopropylcarbodiimide（DIC）和哌啶是通过呼吸道吸入危害眼睛，皮肤，并且可能会引起皮肤过敏。肼是一种可疑致癌物质，吸入致命，并导致严重灼伤皮肤或眼睛。溴乙酸也是危险的皮肤，眼睛和呼吸道，并可能导致在接触时灼伤。三氟乙酸（TFA）是一种挥发性液体，可引起严重烧伤这么小心处理。建议使用重型手套。 0.12克Fmoc保护的Rink酰胺树脂（0.1毫摩尔，典型负载0.7毫摩尔/克）添加到封端20毫升聚丙烯反应容器中具有两个玻璃料。加入5毫升二甲基甲酰胺（DMF），以使树脂溶胀并离开该容器静置在室温下至少60分钟。采用固相萃取真空平台沥干DMF。 向脱保护的溶胀树脂Fmoc基团，加入2毫升哌啶溶液（在DMF中20节％/ v）中。上放置容器在室温下（450转），并摇动器平台摇动5分钟。除去经由真空站中的溶液。 重复Fmoc去保护用2ml哌啶溶液中，摇动，在室温下15分钟。作为前沥干解决方案。 加入2毫升DMF并混合树脂30秒洗涤树脂。漏DMF中，并重复三次。 对于乙酰化，加入1毫升溴乙酸溶液（0.6 M在DMF中）和0.2毫升N，N-'-diisopropylcarbodiimide溶液（DIC，50％的DMF体积/体积）。离开反应容器摇动，在室温下20分钟。排出溶液，并用2毫升DMF三次洗涤树脂。 对位移，加入1毫升的胺溶液（在DMF中的1.5M）。摇动，在室温下60分钟的树脂。排出溶液，并用2毫升DMF三次洗涤树脂。 要添加精氨酸型单体，按照步骤1.7。根据所需的拟肽序列，不同的胺将被添加。 重复步骤1.1.4和1.1.5。 以包括胍官能单体（ 即 ，N-精氨酸），加入1 ml无保护的二胺溶液（在DMF中的1.5M），以树脂和动摇在室温下60分钟。 排出溶液，并用2毫升DMF三次洗涤树脂。 添加2- acetyldimedone（0.2克，1毫摩尔以0.5毫升DMF，10当量）于DDE组添加到游离的伯胺和摇晃，在室温下60分钟。排出溶液，并用2毫升DMF三次洗涤树脂。 如在1.1.4至1.1.7直到所需序列是由继续submonomer合成。加入2毫升DMF洗涤树脂，并重复三次。 去保护在树脂上的DDE基，加入4毫升2-％肼溶液（在DMF体积/体积）并摇动在室温下3分钟。排出溶液，并重复三次。 排出溶液，并用2毫升DMF3吨洗涤树脂输入法。 添加吡唑-1-甲脒（每游离胺6当量， 即每Ñ精氨酸单体，在DMF中的最小体积）和N，N-二异丙基乙胺或DIPEA（每游离胺6当量），并在室温下摇晃60分钟。 排出溶液并用2ml二氯甲烷三次洗涤树脂。离开树脂在空气中干燥10分钟，然后将树脂可以存储直到切割（部分2）。 暂停的合成，洗涤树脂用2毫升DMF三次。加入2毫升DMF，塞住合成容器并在通风橱中在室温下离开。 注：后（可形成除了第二移动一步，二酮哌嗪）的任何位移步骤合成可以暂停。 侧链脱保护和从树脂切割 承接测试切割到DISPLA后合成过程中的任何点退房合成（纯度和质量）的进展情况水泥的步骤，加入或去除DDE保护基团的最终序列或之后已经取得进展。 传送从反应容器中约10树脂珠粒成全新的8 15mL的聚丙烯多孔盒。 加入1毫升三氟乙酸裂解混合物（含有95％TFA，2.5％的H 2 O，2.5％三异丙基硅烷）和摇动，在室温下90分钟。 使用烧结反应容器到10ml圆底烧瓶中过滤从树脂中的TFA裂解混合物。 用旋转蒸发器蒸发的裂解混合物和重新溶解得到的油在1毫升乙腈/水以提交LC-MS或HPLC分析。 为最终裂解：在用于合成的相同多孔聚丙烯反应盒，加入4毫升的TFA裂解混合物（95％TFA，2.5％的H 2 O，2.5％三异丙基硅烷）的并覆盖容器。摇动，在室温下90分钟。 第筛选从树脂使用烧结反应容器到50毫升圆底烧瓶中ëTFA裂解混合液。 蒸发用旋转蒸发器的裂解混合物。为TFA已被删除后，产品应为油来获得。这个原油有助于TFA除去，加入2毫升无水二乙醚和拟肽应该沉淀。 无论是通过吸移管除去乙醚并丢弃或用旋转蒸发器蒸发。重复乙醚沉淀三次。 溶解粗拟肽在10ml乙腈/酸化水溶液（50％乙腈，0.1％TFA的水体积/体积）。转移到一个预先称重的容器中，冷冻在20℃冻干，干燥粉末。 2.表征与纯化注：拟肽合成可以监测和使用C18柱和埃尔通过分析型反相HPLC评估最终拟肽ectrospray液体色谱质谱（LC-MS）。对于LC-MS溶剂的所有HPLC溶剂应新鲜配制。 分析HPLC 称取1毫克拟肽的小型玻璃小瓶中。添加乙腈的最小体积溶解并稀释至1毫升的水。确保拟肽完全溶解。 注入10微升至分析HPLC（建议梯度0 – 100％溶剂B经30分钟，其中溶剂A = 95％水，5％乙腈，0.05％TFA，溶剂B = 95％乙腈，5％水，0.03％TFA） ，根据制造商的说明。 在220nm可视UV光谱。 ESI LC-MS 使1mg / ml的拟肽溶液如在步骤2.1.1。 注入1微升到电喷LC-MS，以确定是否在目标拟肽的分子量存在，使用制造商的说明。 检查拟肽序列的质量目标使用PEPToid的计算器，按照计算器上的指示。26这个web实用程序还允许在质谱看到任何删除/添加的产品的分配。26 制备型反相HPLC 溶解粗的拟肽于2ml酸化水/乙腈（95％水，5％的MeCN，0.1％TFA），并使用制造商的方案通过制备型RP-HPLC纯化。确定由分析型HPLC和注入将取决于柱尺寸的量获得的洗提​​时间的梯度。 可视化使用检测器设定在220纳米。 收集在15ml离心管级分，冷冻于20℃和冷冻干燥。 重新分析用LC-MS，并根据制造商的协议分析型HPLC级分。重组纯化分数。 3.抗利什曼原虫寄生墨西哥生物试验驹化：安全评估必须在开始合成前进行利什曼原虫墨西哥被归类于英国和适当的控制措施危险群2病原体必须到位，在开始测试之前。所有工作必须在2级微生物安全柜和佩戴适当的（ 例如，丁腈手套，防护眼镜和白大褂）足够的个人防护装备进行。 寄生虫的亚文化 通过将小瓶在37℃水浴中进行30秒除霜1毫升-150℃下冷冻的储存墨西哥利什曼原虫 M379。 原液与非通气帽转移至10ml施耐德的昆虫培养基（在补充有15％热灭活的胎牛血清和1％青霉素/链霉素pH 7.0）中在25毫升细胞培养物烧瓶中。 孵育在26℃下72小时。 检查显微镜下（放大400倍）的寄生虫检查的条件。钍安永应该是昆虫阶段前鞭毛体，对数生长期procyclic形式与许多分裂的细胞。 维持由子培养寄生虫procyclic前鞭毛体以5×10 5个寄生虫/ ml的每三天的浓度。算使用Neubauer改进血球细胞。 L.改造墨西哥昆虫阶段到哺乳动物阶段无菌无鞭毛体形式27 在一个25毫升的细胞在Schneider的昆虫介质5×10 5个寄生虫/ ml的准备日志阶段寄生虫的10毫升培养物（在补充有15％热灭活的胎牛血清和1％青霉素/链霉素pH 7.0）中：0天培养瓶用非通风盖。 孵育在26℃下48小时。 第3天：将10毫升培养到50ml离心管中并离心447 xg离心5分钟。 倒掉旧培养基，并加入10 mL施耐德的昆虫媒介（在补充20％H pH值5.5吃灭活的胎牛血清和1％青霉素/链霉素）。轻轻悬浮用吸管在新介质寄生虫沉淀。 算使用Neubauer改进血球寄生虫的数目。稀释到pH值为5.5中，并转移到一个25毫升细胞培养瓶5×10 5个寄生虫/ ml的浓度。 孵育在26℃下约6天。 第9天：检查显微镜（400X）下的寄生虫。它们应该在非复制，感染亚循环前鞭毛体的阶段。 算使用Neubauer改进血球寄生虫的数目。稀释到pH值为5.5中5×10 5个寄生虫/ ml的浓度。 移除10部ml细胞培养并转移到细胞培养瓶中。孵育在32℃下5天。 第14天：检查寄生虫的外观显微镜（400X）下。它们应该在致病无鞭毛体阶段，缺乏鞭毛字符前鞭毛体的信息研究所，并准备检测。 在L.细胞毒性测定墨西哥无菌无鞭毛体。 注：类肽的生物测试使用在96孔板中进行高通量测定。这个协议描述L的测试墨西哥无菌无鞭毛，但相同的测定也可以在适当的媒介鞭毛体阶段寄生虫进行。化合物与寄生虫培养的浓度从3 – 100μM的60分钟，然后温育之后10倍稀释24小时。结果通过与基于刃天青细胞存活率溶液（ 例如 ，的AlamarBlue）温育后测量的孔的荧光获得的。 制备化合物储备溶液。称出1毫克使用分析天平最终纯化拟肽产物。分子生物学级二甲基亚砜（DMSO）中的适当体积加至5mM的浓度。使6微升等份冷冻在-20℃。 在一式三份的96孔板（推荐板布局中可以看到的结果部分， 图6）制备化合物溶液从100到3微米。加入2微升的各个化合物的5毫米原液在顶行（ 即 A）英寸使用多通道移液器（在pH 5.5和20％牛胎儿血清（FBS），1％青霉素/链霉素（P / S））中添加48微升新鲜施耐德的昆虫媒介顶行。 25微升施耐德的昆虫媒介添加到所有其他行（B – F）。 执行由从顶行分注25微升溶液系列稀释。添加到行下面，混匀。进行稀释，直到最后一行，在过去的25微升溶液应被丢弃。 用两性霉素B（5mM的股票）作为阳性对照和DMSO（2％溶液），为一式三份的阴性对照。 准备寄生虫的解决方案：转移文化50毫升离心管和离心447×g离心5分钟。倒出旧培养基并且加入10 mL施耐德的昆虫培养基（在pH 5.5和20％FBS，1％P / S）。 轻轻溶解用吸管在新介质寄生虫的颗粒和使用N​​eubauer改进血球计数。稀释文化，8×10 6寄生虫/毫升。 加入25微升L.墨西哥文化到每口井。在32℃孵育板60分钟。 从培养箱中取出盘子并从各孔中除去40微升溶液。 添加90微升新鲜培养基并在32℃孵育24小时。 添加10微升基于刃天青-细胞存活率溶液每个孔中。在32℃孵育4小时。 用酶标仪测量荧光（λEX = 540纳米，λEM = 600纳米），按照制造商的说明。通过除去平均背景（从平台仅孔）并相对于到t正常化后的孔的荧光进行比较分析数据他DMSO对照。