Produzione semplici ed efficaci e Purificazione di topo mielina Oligodendrocyte glicoproteina di encefalomielite autoimmune sperimentale Studi

La sclerosi multipla è una malattia umana caratterizzata da infiammazione cronica e neurodegenerazione del sistema nervoso centrale che è pensato per essere guidato da una risposta autoimmune diretta verso la mielina. La perdita di mielina e gli assoni nel tempo comporta il graduale declino cognitivo e motorio funzione ^1. "Encefalomielite autoimmune sperimentale" è un termine generico per i modelli animali di malattia autoimmune rivolta mielina del SNC. Come MS umani, EAE è tipicamente caratterizzato da infiltrazione di cellule immunitarie del sistema nervoso centrale e, in alcuni casi, demielinizzazione ^2. Tuttavia, il grado in cui un dato modello di EAE assomiglia MS umana in parte dipende dalle specie o ceppo utilizzati e della complessità della risposta autoimmune anti-mielina sottostante.

autoimmunità anti-mielina può essere indotta sperimentalmente in vari modi, ma il metodo più comune utilizzato oggi è quello di immunizzare i topi con una breve peptide di aminoacidi imitando il CD4 immunodominante <sup> + T epitopo cellule di una proteina mielina. Questo rappresenta il requisito minimo per indurre una risposta patogena. Forse il più comune di questi è un peptide di 21 aminoacidi derivato da myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG _35-55), che viene utilizzato per indurre EAE in topi C57BL / 6 ^3. Tuttavia, per alcuni scopi sperimentali è desiderabile o addirittura necessario per immunizzare con antigeni proteici più grandi e in effetti ci sono molti vantaggi a questo oltre l'immunizzazione con breve peptide. Innanzitutto, a causa della restrizione MHC, piccoli peptidi sono generalmente efficaci solo in una gamma molto limitata di ceppi, mentre antigeni proteici grandi corrispondenti sia l'intera proteina o un dominio specifico possono essere elaborati normalmente per presentarli in diversi ceppi di topi inbred o anche in diverse specie ^4. In secondo luogo, un antigene proteico più grande è in grado di indurre una risposta immunitaria più complesso incorporando più tipi di linfociti nel riconoscimento dell'antigene, piuttosto che limiting riconoscimento dell'antigene alle cellule T CD4 ^+. Ad esempio, le cellule B tramite il loro recettore delle cellule B (BCR) interagiscono direttamente con tutto piuttosto che elaborati proteine. Noi e altri hanno dimostrato che le cellule B attivate da MOG _35-55 immunizzazione non riconoscono la proteina MOG ^5. Dato che le cellule B sono stati recentemente dimostrato di giocare un ruolo patogenetico nella SM umano ^6, modelli EAE che incorporano le cellule B in patologia autoimmune sono sempre più importanti.

Nonostante i vantaggi dell'utilizzo di antigeni proteici grandi per indurre EAE, rimangono poche fonti disponibili in commercio per tali proteine. Infatti, mentre i peptidi corti come MOG _35-55 possono essere sintetizzati molto rapidamente e ad un costo relativamente basso, le opzioni commerciali per proteina MOG sono limitati e costo sostanzialmente più acquistare. Tuttavia, ci sono diversi vettori di espressione disponibili per i gruppi di ricerca per generare MOG dominio extracellulare (MOG) _1-125 stessi. However, tutti i sistemi di espressione che abbiamo identificato in letteratura sono basati su vecchie tecnologie che sono state sostituite con sistemi di espressione più efficienti ^7. Inoltre, la maggior parte sono basati su ratto o umano MOG ^8. Per alcune ricerche di autoimmunità in topi, un antigene basato sulla autoantigene del mouse MOG è preferibile. Infine, tutte le proteine MOG-based che abbiamo individuato, sia commerciale o come vettori di espressione, sono proteine di fusione contenenti amminoacidi supplementari alla base MOG _1-125. Questi includono un tag per la purificazione e di solito altre sequenze così, molte delle quali con una funzione siamo stati in grado di identificare.

Per far fronte a queste limitazioni, abbiamo generato una proteina di fusione romanzo basato sul mouse MOG dominio extracellulare fuso a un tag contenente tioredossina per combattere l'insolubilità noto di MOG proteine ^5. La sequenza di tag contiene anche una sequenza 6xHis di purificazione e di una proteasi TEV CLEsito Avage che permette la rimozione completa di tutte le sequenze di tag, se desiderato. Questo è l'unico metodo che siamo consapevoli di generare puro proteina MOG _1-125. Per facilitare la produzione di grandi quantità di proteine, la sequenza MOG _1-125 era codone ottimizzato per l'espressione batterica e la proteina di fusione _tag MOG è stato inserito nel sistema di espressione pET-32. Qui, descriviamo in dettaglio il protocollo per produrre e purificare MOG proteine _tag, e puro MOG _1-125, utilizzando attrezzature non specializzati a disposizione maggior parte dei laboratori di immunologia.