Deneysel Otoimmün ENSEFALOMYELİT Çalışmaları Basit ve Etkin Üretim ve Fare Miyelin oligodendrosit Glikoprotein saflaştırılması
Summary
We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.
Abstract
Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.
Introduction
MS kronik enflamasyon ve miyelin yönelik otoimmün yanıtı tarafından tahrik düşünülmektedir CNS nörodejenerasyon ile karakterize edilen bir insan hastalıktır. Zamanla miyelin ve akson kaybının bilişsel ve motor fonksiyon 1 kademeli bir düşüş ile sonuçlanır. "Deneysel Otoimmün ENSEFALOMYELİT" MSS miyelin yönelik otoimmün hastalık hayvan modelleri için bir terimdir. İnsan MS gibi, EAE tipik haliyle, bazı durumlarda, merkezi sinir sisteminin, bağışıklık hücresi infiltrasyonu ile karakterize edilir, demiyelinasyon 2. Ancak, herhangi bir EAE modeli kısmen insan MS benzer derecesi kullanılan türü veya suşu ve altta yatan anti miyelin otoimmün yanıtın karmaşıklığına bağlıdır.
Anti-miyelin otoimmünite deneysel çeşitli yollarla bağlı ama günümüzde en yaygın kullanılan yöntem, immünodominant CD4 taklit eden amino asitlerin kısa bir peptid ile farelere bağışıklık kazandırılması olan edilebilir <sBir miyelin protein> + T hücre epitopu kadar. Bu patojenik tepkisi oluşturmak için minimum gerekliliği temsil eder. Belki de bu en yaygın C57BL / 6 fareleri 3 EAE ikna etmek için kullanılır (MOG 35-55) miyelin oligodendrosit glikoproteinin türetilen 21 amino asitli bir peptittir. Bununla birlikte, bazı deneysel amaçlar için daha büyük bir protein antijenleri ve hatta kısa bir peptit ile bağışıklık kazandırma üzerine, bu çeşitli avantajları vardır ile bağışıklık kazandırmak için arzu edilebilir ve hatta gereklidir. Bütün proteinini veya bunun spesifik bir alan adı temsil daha büyük protein antijenleri, farklı türlerde da birden fazla fare soylannda sunum için, normal olarak işleme ya da süre önce, MHC kısıtlaması nedeniyle, kısa peptidler genellikle suşu çok sınırlı aralıkta etkilidirler 4. İkinci olarak, daha büyük bir protein antijeni, antijen tanıma lenfosit daha fazla türde içeren daha karmaşık bir bağışıklık tepkisi indüklemek yerine sınırlandırıcı edebilenCD4 + T hücreleri g antijen algılama. Örneğin, B hücre reseptörleri (BCR) yoluyla B hücrelerinin bütün yerine işlenmiş protein ile doğrudan etkileşenler. Biz ve diğerleri MOG proteini 5 tanımaz MOG 35-55 bağışıklama ile aktive olduğu B hücreleri göstermiştir. B hücreleri, en son, insan MS 6 patojenik bir rol oynadığı gösterilmiştir olduğundan, otoimmün patolojisinde B hücrelerini içermektedir EAE modelleri giderek önem kazanmaktadır.
EAE uyarılması için daha büyük bir protein antijenlerinin kullanmanın avantajlarına rağmen, bu proteinler için birkaç Ticari kaynaklar orada kalır. MOG 35-55 gibi kısa peptidler çok hızlı ve nispeten düşük bir maliyetle sentezlenebilir Nitekim, MOG proteini ticari seçenekler satın almak için sınırlı ve maliyet önemli ölçüde daha fazladır. Bununla birlikte, MOG dışı alanını oluşturmak için araştırma grupları için çeşitli ekspresyon vektörleri (MOG 1-125) kendileri vardır. however, biz literatürde belirledik ifade sistemlerinin tüm beri daha verimli ifade sistemleri 7 ile yerini almış eski teknolojilere dayanmaktadır. Bundan başka, pek çok fare ya da insan MOG 8 dayanmaktadır. Farelerde otoimmünite bazı araştırmalar için, fare MOG oto dayalı bir antijen tercih edilir. Son olarak, ticari ya da sentezleme vektörü olarak Ya tespit tüm MOG tabanlı proteinler, MOG 1-125 tabanına ek amino asitleri ihtiva eden füzyon proteinleridir. Bunlar tespit koyamadık birçok fonksiyonu ile hangi yanı arıtma ve genellikle diğer dizileri için bir etiket içerir.
Bu sınırlamaları gidermek için, biz MOG proteini 5 bilinen çözülemezliğini mücadele için tioredoksin içeren bir etikete kaynaşmış fare MOG hücre dışı alanına dayalı yeni bir füzyon proteini oluşturulur. takı sekansı da saflaştırma ve bir TEV proteaz cle bir 6xHis dizisini içeriristenirse, tüm etiket dizilerinin tümüyle kaldırılmasını sağlar avage sitesi. Bu saf MOG 1-125 protein üretmek için farkında tek yöntemdir. Bol miktarda protein üretimini kolaylaştırmak için, MOG 1-125 sekansı, bakteriyel ekspresyon için kodon optimizasyonu ve MOG künye füzyon proteini, pET-32 ekspresyon sistemi içine sokulmuştur. Burada, en immünoloji laboratuarlarında mevcut olmayan özel ekipman kullanılarak, üretmek ve MOG etiketi protein ve saf MOG 1-125 arındırmak için detaylı protokol açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, MOG etiket protein ve nasıl MOG işareti proteiniyle saf MOG 1-125 oluşturmak için üretimi için bir protokol tanımlanmıştır. Bu protokol standardı His-tag bazlı protein saflaştırma yöntemleri, hem de eski MOG bazlı protein 15 oluşturulması için daha önce tarif edilen protokol ile ilgili hem de dayanır. Burada tarif edilmemiş olsa da, MOG etiketi proteinin birincil kullanımı protein antijeni ile bağışıklık kazandırma yoluyla EAE o…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Multiple Sclerosis Society of Canada. RWJ is the recipient of the Waugh Family MS Society of Canada Doctoral Studentship Award.
Materials
| BL21 E.coli– pet32-MOGtag | Kerfoot lab | These bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request. | |
| LB broth miller | Bioshop | LBL407.1 | |
| Ampicillin | bio basic | AB0028 | Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C. |
| IPTG | Bioshop | IPT002.5 | Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C. |
| Chicken-egg lysozyme | Bioshop | LYS702.10 | Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C. |
| Triton-X100 | Sigma | T-8532 | |
| Phosphate buffered saline | life technologies | 20012-027 | Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient. |
| Sodium chloride | Bioshop | SOD004.1 | |
| Tris-HCl | Bioshop | TRS002.1 | |
| Imidazole | Bioshop | IMD508.100 | |
| Guanidine-HCl | Sigma | G3272 | The quality must be greater than 98% purity. |
| 0.5M EDTA | bioshop | EDT111.500 | |
| Nickel (II) sulfate | Bioshop | NIC700.500 | |
| His bind resin | EMD Millipore | 69670-3 | Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C |
| Anhydrous ethanol | Commercial Alcohols | P016EAAN | Dilute with water as needed. |
| Glacial acetic acid | Bioshop | ACE222.1 | |
| Sodium acetate trihydrate | Bioshop | SAA305.500 | |
| bovine serum albumin standard | bio-rad | 500-0206 | |
| Bio-rad protein assay dye reagent concentrate | bio-rad | 500-0006 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate | Fisher scientific | BP120-500 | |
| Tris-base | Bioshop | TRS001.1 | |
| 7000 MW Snakeskin dialysis tubing | Thermoscientific | 68700 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148-25ml | This reagent should not be handled outside of a fume hood. |
| AcTEV protease | lifetechnologies | 12575-015 | Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17 |
| Polyethyleneglycol 3350 | Bioshop | PEG335.1 | |
| polyethyleneglycol 8000 | Bioshop | PEG800.1 | |
| Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate | ebioscience | 44-2404-21 | |
| Sonicator | Fisher scientific | FB-120-110 | |
| Eon microplate spectrometer | Biotek | 11-120-611 | This equipment uses the Gen5 data analysis software. |
| Gen5 data analysis software | BioTek | ||
| sodium dodecyl sulphate | Bioshop | SDS001 | |
| bromophenol blue | Bioshop | BRO777 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001 | |
| Protein desalting columns | Thermoscientific | 89849 | |
| Glycine | Bioshop | GLN001 | |
| precast 12% polyacrylamide gel | bio-rad | 456-1045 | |
| Rapid stain reagent | EMD Millipore | 553215 | |
| Gel dock EZ imager | bio-rad | 1708270 | |
| White Light Sample Tray | bio-rad | 1708272 | Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains |
| Protein ladder | bio-rad | 1610375 |
Referências
- Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
- Baxter, A. G. The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis. Nat Rev Immunol. 7 (11), 904-912 (2007).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
- Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1 (2), 22 (2014).
- Dang, A. K., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. B cell recognition of myelin oligodendrocyte glycoprotein autoantigen depends on immunization with protein rather than short peptide, while B cell invasion of the CNS in autoimmunity does not. J Neuroimmunol. 278, 73-84 (2015).
- Barun, B., Bar-Or, A. Treatment of multiple sclerosis with anti-CD20 antibodies. Clin Immunol. 142 (1), 31-37 (2012).
- Bettadapura, J., Menon, K. K., Moritz, S., Liu, J., Bernard, C. C. Expression, purification, and encephalitogenicity of recombinant human myelin oligodendrocyte glycoprotein. J Neurochem. 70 (4), 1593-1599 (1998).
- Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice. J Immunol. 171 (1), 462-468 (2003).
- . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J Vis Exp. , (2016).
- . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2016).
- Hamada, H., Arakawa, T., Shiraki, K. Effect of additives on protein aggregation. Curr Pharm Biotechnol. 10 (4), 400-407 (2009).
- Dang, A. K., Tesfagiorgis, Y., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. Meningeal Infiltration of the Spinal Cord by Non-Classically Activated B Cells is Associated with Chronic Disease Course in a Spontaneous B Cell-Dependent Model of CNS Autoimmune Disease. Front Immunol. 6, 470 (2015).
- LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
- Raines, R. T., McCormick, M., Van Oosbree, T. R., Mierendorf, R. C. The S.Tag fusion system for protein purification. Methods Enzymol. 326, 362-376 (2000).
- Amor, S., et al. Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice. J Immunol. 153 (10), 4349-4356 (1994).
- Kostallas, G., Lofdahl, P. A., Samuelson, P. Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay. PLoS ONE. 6 (1), e16136 (2011).
- Litzenburger, T., et al. B lymphocytes producing demyelinating autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice. J Exp Med. 188 (1), 169-180 (1998).
- Zhang, H. Y., et al. Separation and purification of Escherichia coli-expressed human thymosin-alpha1 using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography. Protein Expr Purif. 77 (2), 140-145 (2011).
- Tegel, H., Ottosson, J., Hober, S. Enhancing the protein production levels in Escherichia coli with a strong promoter. FEBS J. 278 (5), 729-739 (2011).
- Akirav, E. M., Bergman, C. M., Hill, M., Ruddle, N. H. Depletion of CD4(+)CD25(+) T cells exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis induced by mouse, but not rat, antigens. J Neurosci Res. 87 (15), 3511-3519 (2009).
- Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).
- Blommel, P. G., Fox, B. G. A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease. Protein Expr Purif. 55 (1), 53-68 (2007).
