Production et purification de souris myéline oligodendrocyte glycoprotéine simple et efficace pour auto-immune expérimentale encéphalomyélite études
Summary
We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.
Abstract
Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.
Introduction
La SEP est une maladie humaine chronique caractérisée par une inflammation et les maladies neurodégénératives du système nerveux central qui est censée être entraînée par une réponse auto-immune dirigée vers la myéline. La perte de la myéline et des axones au fil du temps le résultat de la baisse progressive de la fonction cognitive et motrice 1. "Auto-immune expérimentale encéphalomyélite" est un terme générique pour les modèles animaux de la maladie auto-immune dirigée vers la myéline du SNC. Comme MS humaine, EAE est généralement caractérisée par une infiltration de cellules immunitaires du système nerveux central et, dans certains cas, 2 démyélinisation. Cependant, la mesure dans laquelle un modèle EAE donné ressemble à MS humaine dépend en partie de l'espèce ou de la souche utilisée et de la complexité de la réponse auto-immune anti-myéline sous-jacente.
autoimmunité anti-myéline peut être induite expérimentalement de plusieurs façons, mais la méthode la plus couramment utilisée aujourd'hui consiste à immuniser des souris avec un peptide court d'acides aminés mimant le CD4 immunodominant <sup> + T épitope d'une protéine de myéline. Cela représente le minimum requis pour induire une réponse pathogène. Peut-être le plus commun de ces derniers est un peptide de 21 acides aminés dérivée de la myéline oligodendrocyte glycoprotéine (MOG 35-55), qui est utilisé pour induire l' EAE chez les souris C57BL / 6 3. Toutefois, pour certaines fins expérimentales, il est souhaitable, voire nécessaire, pour immuniser avec de plus grands antigènes protéiques et en effet il y a plusieurs avantages à cette immunisation avec plus de peptide court. Tout d'abord, en raison de la restriction du CMH, des peptides courts ne sont généralement efficaces dans une gamme très limitée de souches, tandis que les grands antigènes protéiques représentant soit l'ensemble de la protéine ou d'un domaine spécifique peuvent être traitées normalement pour la présentation sur plusieurs souches de souris consanguines ou même chez différentes espèces 4. En second lieu, un antigène de protéine plus grande est capable d'induire une réponse immunitaire plus complexe comportant plusieurs types de lymphocytes dans la reconnaissance des antigènes, plutôt que limiting reconnaissance de l' antigène aux lymphocytes T CD4 +. Par exemple, les cellules B via leur récepteur des cellules B (BCR) interagissent directement avec la protéine entière plutôt que de traiter. Nous et d' autres ont montré que les cellules B activées par MOG 35-55 vaccination ne reconnaissent pas la protéine MOG 5. Comme les cellules B ont été récemment démontré à jouer un rôle pathogène dans MS humaine 6, les modèles EAE qui incorporent les cellules B en pathologie auto – immune sont de plus en plus importante.
Malgré les avantages de l'utilisation de plus grandes protéines d'antigènes pour induire l'EAE, il reste peu de sources disponibles dans le commerce pour de telles protéines. En effet, alors que les peptides courts comme MOG 35-55 peuvent être synthétisés très rapidement et à un coût relativement faible, les options commerciales pour la protéine MOG sont limitées et le coût nettement plus à l' achat. Néanmoins, il existe plusieurs vecteurs d'expression disponibles pour les groupes de recherche pour générer MOG domaine extracellulaire (MOG 1-125) eux – mêmes. However, tous les systèmes d'expression que nous avons identifiés dans la littérature sont basées sur les technologies plus anciennes qui ont depuis été remplacés par des systèmes d'expression plus efficaces 7. En outre, la plupart sont basées sur le rat ou humain MOG 8. Pour certaines enquêtes d'auto-immunité chez la souris, un antigène sur la base du autoantigène MOG de la souris est préférable. Enfin, toutes les protéines à base de MOG que nous avons identifiés, qu'ils soient commerciaux ou sous forme de vecteurs d'expression, sont des protéines de fusion contenant des acides aminés supplémentaires à la base MOG 1-125. Ceux-ci comprennent une étiquette pour la purification et le plus souvent d'autres séquences ainsi, dont beaucoup avec une fonction que nous étions incapables d'identifier.
Pour répondre à ces limitations, nous avons généré une nouvelle protéine de fusion sur la base du MOG domaine extracellulaire de la souris fusionnée à une étiquette contenant la thiorédoxine pour lutter contre l'insolubilité connu de la protéine MOG 5. La séquence de balise contient également une séquence 6xHis pour la purification et une protéase TEV cleSite Avage qui permet l'élimination complète de toutes les séquences marqueur, si on le souhaite. Ceci est la seule méthode que nous sommes conscients de pour générer pur protéine MOG 1-125. Afin de faciliter la production de grandes quantités de protéine, dont la séquence a été MOG 1-125 codon optimisé pour l' expression bactérienne et la protéine marqueur de fusion MOG a été insérée dans le système d'expression pET-32. Ici, nous décrivons en détail le protocole pour produire et purifier MOG protéine étiquette, et MOG pur 1-125, en utilisant un équipement non spécialisé disponible pour la plupart des laboratoires d'immunologie.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous avons décrit un protocole pour la production de MOG protéine étiquette et comment générer MOG pur 1-125 de la protéine MOG d'étiquette. Ce protocole est basé à la fois sur la base des procédés de purification de protéines His-tag standard, ainsi qu'un protocole décrit précédemment pour la production d'une protéine à base de MOG âgée 15. Bien qu'il ne soit pas décrit ici, l'utilisation primaire de la protéine MOG tag…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Multiple Sclerosis Society of Canada. RWJ is the recipient of the Waugh Family MS Society of Canada Doctoral Studentship Award.
Materials
| BL21 E.coli– pet32-MOGtag | Kerfoot lab | These bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request. | |
| LB broth miller | Bioshop | LBL407.1 | |
| Ampicillin | bio basic | AB0028 | Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C. |
| IPTG | Bioshop | IPT002.5 | Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C. |
| Chicken-egg lysozyme | Bioshop | LYS702.10 | Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C. |
| Triton-X100 | Sigma | T-8532 | |
| Phosphate buffered saline | life technologies | 20012-027 | Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient. |
| Sodium chloride | Bioshop | SOD004.1 | |
| Tris-HCl | Bioshop | TRS002.1 | |
| Imidazole | Bioshop | IMD508.100 | |
| Guanidine-HCl | Sigma | G3272 | The quality must be greater than 98% purity. |
| 0.5M EDTA | bioshop | EDT111.500 | |
| Nickel (II) sulfate | Bioshop | NIC700.500 | |
| His bind resin | EMD Millipore | 69670-3 | Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C |
| Anhydrous ethanol | Commercial Alcohols | P016EAAN | Dilute with water as needed. |
| Glacial acetic acid | Bioshop | ACE222.1 | |
| Sodium acetate trihydrate | Bioshop | SAA305.500 | |
| bovine serum albumin standard | bio-rad | 500-0206 | |
| Bio-rad protein assay dye reagent concentrate | bio-rad | 500-0006 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate | Fisher scientific | BP120-500 | |
| Tris-base | Bioshop | TRS001.1 | |
| 7000 MW Snakeskin dialysis tubing | Thermoscientific | 68700 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148-25ml | This reagent should not be handled outside of a fume hood. |
| AcTEV protease | lifetechnologies | 12575-015 | Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17 |
| Polyethyleneglycol 3350 | Bioshop | PEG335.1 | |
| polyethyleneglycol 8000 | Bioshop | PEG800.1 | |
| Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate | ebioscience | 44-2404-21 | |
| Sonicator | Fisher scientific | FB-120-110 | |
| Eon microplate spectrometer | Biotek | 11-120-611 | This equipment uses the Gen5 data analysis software. |
| Gen5 data analysis software | BioTek | ||
| sodium dodecyl sulphate | Bioshop | SDS001 | |
| bromophenol blue | Bioshop | BRO777 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001 | |
| Protein desalting columns | Thermoscientific | 89849 | |
| Glycine | Bioshop | GLN001 | |
| precast 12% polyacrylamide gel | bio-rad | 456-1045 | |
| Rapid stain reagent | EMD Millipore | 553215 | |
| Gel dock EZ imager | bio-rad | 1708270 | |
| White Light Sample Tray | bio-rad | 1708272 | Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains |
| Protein ladder | bio-rad | 1610375 |
Referências
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