ייצור טיהור פשוט ויעיל של עכבר המיאלין Oligodendrocyte גליקופרוטאין עבור ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis מחקרים
Summary
We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.
Abstract
Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.
Introduction
טרשת נפוצה היא מחלה אנושית מאופיינת בדלקת כרונית ניווניות של מערכת העצבים של מערכת העצבים המרכזית אשר נחשב להיות מונע על ידי תגובה אוטואימונית מכוונת המיאלין. ההפסד של המיאלין אקסונים לאורך הזמן לגרום לירידה ההדרגתית של מנוע קוגניטיבית פונקצית 1. "Encephalomyelitis אוטואימונית ניסויית" הוא מונח כללי עבור במודלים של בעלי חיים של מחלה אוטואימונית מכוונת המיאלין במערכת העצבים המרכזית. כמו MS האדם, EAE מאופיין בדרך כלל על ידי חדירה של תאי מערכת החיסון של מערכת העצבים המרכזית, ובמקרים מסוימים, demyelination 2. עם זאת, את המידה שבה נתון כל מודל EAE דומה האדם MS בחלקו תלוי המין או זן בשימוש ועל המורכבות של תגובה אוטואימונית נגד המיאלין הבסיסי.
אוטואימוניות נגד המיאלין יכולות להיגרם באופן ניסיוני במספר דרכים, אך השיטה הנפוצה ביותר בשימוש כיום היא לחסן עכברים עם פפטיד קצר של חומצות אמינו מחק את CD4 immunodominant <sעד> + epitope תא T של חלבון המיאלין. זה מייצג את הדרישה המינימלית כדי לעורר תגובה פתוגניים. אולי הנפוצות ביותר של אלה הוא פפטיד חומצה 21 אמינו נגזר גליקופרוטאין oligodendrocyte המיאלין (ש"א 35-55), אשר משמש כדי לגרום EAE ב C57Bl / 6 עכברים 3. עם זאת, עבור כמה מטרות ניסוי רצוי או אפילו צורך לחסן עם אנטיגנים חלבון גדולים ואכן ישנם מספר יתרונות לכך על חיסון עם פפטיד קצר. ראשית, בגלל הגבלת MHC, פפטידים קצרים הם בדרך כלל יעילים רק בטווח מצומצם מאוד של זנים, בעוד אנטיגנים חלבון גדולים המייצגים גם את החלבון השלם או תחום מסוים יכולים להיות מעובד בדרך כלל לצורך הציג זני עכבר מרובים טהור או אפילו במינים שונים 4. שנית, אנטיגן חלבון גדול מסוגל גרימת תגובה חיסונית מורכבת יותר שילוב סוגים נוספים של הלימפוציטים הכרת אנטיגן, ולא limitinהכרת אנטיגן גרם לתאי T מסוג CD4 +. לדוגמא, תאי B באמצעות קולטן תא B שלהם (BCR) אינטראקציה ישירה עם שלם ולא חלבון מעובד. אנחנו ואחרים הראו תאי B מופעל על ידי חיסון MOG 35-55 אינם מכירים MOG חלבון 5. מאחר ותאי B הודגמו לאחרונה לשחק תפקיד פתוגניים האדם MS 6, מודלים EAE המשלבים תאי B בפתולוגיה אוטואימוניות חשובים יותר ויותר.
למרות היתרונות של שימוש אנטיגנים חלבון גדול יותר כדי לגרום EAE, נותרו כמה מקורות זמינים מסחרית עבור חלבונים כאלה. ואכן, בעוד פפטידים קצרים כמו MOG 35-55 יכול להיות מסונתזים מהר מאוד ובעלות נמוכה יחסית, האפשרויות המסחריות לחלבון MOG מוגבלות עלות משמעותית יותר לרכוש. עם זאת, ישנם מספר וקטורי ביטוי זמין עבור קבוצות מחקר כדי ליצור תחום תאי ש"א (ש"א 1-125) עצמם. However, כל מערכות הביטוי שזיהינו בספרות מבוססת על טכנולוגיות ישנות יותר כי הוחלפו מאז עם מערכות ביטוי יעילות יותר 7. יתר על כן, רובם מבוססים על MOG חולדה או אדם 8. עבור חקירות כמה אוטואימיוניות בעכברים, אנטיגן מבוסס על autoantigen העכבר MOG עדיף. לבסוף, כל חלבונים המבוססים MOG שזיהינו, או המסחריים או כמו וקטורי ביטוי, הם חלבוני היתוך המכילים חומצות אמינו נוספות לבסיס MOG 1-125. אלה כוללים תג לטיהור ובדרך כלל רצפים אחרים גם כן, רבים מהם עם פונקציה לא הצלחנו לזהות.
כדי לטפל במגבלות אלה, שעוררנו חלבון היתוך רומן המבוסס על תחום MOG העכבר התאי התמזג תג המכיל thioredoxin כדי להילחם insolubility הידוע של MOG חלבון 5. רצף תג גם מכיל רצף 6xHis לטיהור וכן CLE פרוטאז TEVavage אתר המאפשר עבור הסרה מלאה של כל רצפי תג, אם תרצה בכך. זוהי השיטה היחידה שאנו מודעים לייצר חלבון MOG 1-125 טהור. כדי להקל על ייצור של כמויות גדולות של חלבון, רצף MOG 1-125 היה קודון אופטימיזציה עבור ביטוי חיידקים חלבון היתוך תג MOG הוכנס למערכת הביטוי PET-32. כאן אנו מתארים בפרוטרוט את הפרוטוקול לייצר ולטהר חלבון תג MOG, וטהור MOG 1-125, תוך שימוש בציוד שאינו מתמחה לרשות ברוב מעבדות אימונולוגיה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הנה, יש לנו תיאר פרוטוקול לייצור חלבון תג MOG וכיצד ליצור MOG טהור 1-125 מן החלבון תג MOG. פרוטוקול זה מבוסס הוא על שיטות טיהור חלבונים מבוססות תקן שלו-תג, כמו גם פרוטוקול שתואר לעיל עבור הדור של חלבון MOG מבוסס מבוגר 15. למרות זאת הוא לא תיאר כאן, השימוש ה?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Multiple Sclerosis Society of Canada. RWJ is the recipient of the Waugh Family MS Society of Canada Doctoral Studentship Award.
Materials
| BL21 E.coli– pet32-MOGtag | Kerfoot lab | These bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request. | |
| LB broth miller | Bioshop | LBL407.1 | |
| Ampicillin | bio basic | AB0028 | Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C. |
| IPTG | Bioshop | IPT002.5 | Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C. |
| Chicken-egg lysozyme | Bioshop | LYS702.10 | Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C. |
| Triton-X100 | Sigma | T-8532 | |
| Phosphate buffered saline | life technologies | 20012-027 | Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient. |
| Sodium chloride | Bioshop | SOD004.1 | |
| Tris-HCl | Bioshop | TRS002.1 | |
| Imidazole | Bioshop | IMD508.100 | |
| Guanidine-HCl | Sigma | G3272 | The quality must be greater than 98% purity. |
| 0.5M EDTA | bioshop | EDT111.500 | |
| Nickel (II) sulfate | Bioshop | NIC700.500 | |
| His bind resin | EMD Millipore | 69670-3 | Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C |
| Anhydrous ethanol | Commercial Alcohols | P016EAAN | Dilute with water as needed. |
| Glacial acetic acid | Bioshop | ACE222.1 | |
| Sodium acetate trihydrate | Bioshop | SAA305.500 | |
| bovine serum albumin standard | bio-rad | 500-0206 | |
| Bio-rad protein assay dye reagent concentrate | bio-rad | 500-0006 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate | Fisher scientific | BP120-500 | |
| Tris-base | Bioshop | TRS001.1 | |
| 7000 MW Snakeskin dialysis tubing | Thermoscientific | 68700 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148-25ml | This reagent should not be handled outside of a fume hood. |
| AcTEV protease | lifetechnologies | 12575-015 | Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17 |
| Polyethyleneglycol 3350 | Bioshop | PEG335.1 | |
| polyethyleneglycol 8000 | Bioshop | PEG800.1 | |
| Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate | ebioscience | 44-2404-21 | |
| Sonicator | Fisher scientific | FB-120-110 | |
| Eon microplate spectrometer | Biotek | 11-120-611 | This equipment uses the Gen5 data analysis software. |
| Gen5 data analysis software | BioTek | ||
| sodium dodecyl sulphate | Bioshop | SDS001 | |
| bromophenol blue | Bioshop | BRO777 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001 | |
| Protein desalting columns | Thermoscientific | 89849 | |
| Glycine | Bioshop | GLN001 | |
| precast 12% polyacrylamide gel | bio-rad | 456-1045 | |
| Rapid stain reagent | EMD Millipore | 553215 | |
| Gel dock EZ imager | bio-rad | 1708270 | |
| White Light Sample Tray | bio-rad | 1708272 | Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains |
| Protein ladder | bio-rad | 1610375 |
Referências
- Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
- Baxter, A. G. The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis. Nat Rev Immunol. 7 (11), 904-912 (2007).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
- Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1 (2), 22 (2014).
- Dang, A. K., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. B cell recognition of myelin oligodendrocyte glycoprotein autoantigen depends on immunization with protein rather than short peptide, while B cell invasion of the CNS in autoimmunity does not. J Neuroimmunol. 278, 73-84 (2015).
- Barun, B., Bar-Or, A. Treatment of multiple sclerosis with anti-CD20 antibodies. Clin Immunol. 142 (1), 31-37 (2012).
- Bettadapura, J., Menon, K. K., Moritz, S., Liu, J., Bernard, C. C. Expression, purification, and encephalitogenicity of recombinant human myelin oligodendrocyte glycoprotein. J Neurochem. 70 (4), 1593-1599 (1998).
- Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice. J Immunol. 171 (1), 462-468 (2003).
- . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J Vis Exp. , (2016).
- . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2016).
- Hamada, H., Arakawa, T., Shiraki, K. Effect of additives on protein aggregation. Curr Pharm Biotechnol. 10 (4), 400-407 (2009).
- Dang, A. K., Tesfagiorgis, Y., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. Meningeal Infiltration of the Spinal Cord by Non-Classically Activated B Cells is Associated with Chronic Disease Course in a Spontaneous B Cell-Dependent Model of CNS Autoimmune Disease. Front Immunol. 6, 470 (2015).
- LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
- Raines, R. T., McCormick, M., Van Oosbree, T. R., Mierendorf, R. C. The S.Tag fusion system for protein purification. Methods Enzymol. 326, 362-376 (2000).
- Amor, S., et al. Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice. J Immunol. 153 (10), 4349-4356 (1994).
- Kostallas, G., Lofdahl, P. A., Samuelson, P. Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay. PLoS ONE. 6 (1), e16136 (2011).
- Litzenburger, T., et al. B lymphocytes producing demyelinating autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice. J Exp Med. 188 (1), 169-180 (1998).
- Zhang, H. Y., et al. Separation and purification of Escherichia coli-expressed human thymosin-alpha1 using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography. Protein Expr Purif. 77 (2), 140-145 (2011).
- Tegel, H., Ottosson, J., Hober, S. Enhancing the protein production levels in Escherichia coli with a strong promoter. FEBS J. 278 (5), 729-739 (2011).
- Akirav, E. M., Bergman, C. M., Hill, M., Ruddle, N. H. Depletion of CD4(+)CD25(+) T cells exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis induced by mouse, but not rat, antigens. J Neurosci Res. 87 (15), 3511-3519 (2009).
- Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).
- Blommel, P. G., Fox, B. G. A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease. Protein Expr Purif. 55 (1), 53-68 (2007).
