Eenvoudige en efficiënte productie en zuivering van de Muis myeline oligodendrocyt-glycoproteïne voor experimentele auto-immune Encephalomyelitis Studies
Summary
We describe a simple protocol using only basic lab equipment to generate and purify large quantities of a fusion protein that contains mouse Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein. This protein can be used to induce experimental autoimmune encephalomyelitis driven by both T and B cells.
Abstract
Multiple sclerosis (MS) is a chronic inflammatory disease of the central nervous system (CNS), thought to occur as a result of autoimmune responses targeting myelin. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is the most common animal model of CNS autoimmune disease, and is typically induced via immunization with short peptides representing immunodominant CD4+ T cell epitopes of myelin proteins. However, B cells recognize unprocessed protein directly, and immunization with short peptide does not activate B cells that recognize the native protein. As recent clinical trials of B cell-depleting therapies in MS have suggested a role for B cells in driving disease in humans, there is an urgent need for animal models that incorporate B cell-recognition of autoantigen. To this end, we have generated a new fusion protein containing the extracellular domain of the mouse version of myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) as well as N-terminal fusions of a His-tag for purification purposes and the thioredoxin protein to improve solubility (MOGtag). A tobacco etch virus (TEV) protease cleavage site was incorporated to allow the removal of all tag sequences, leaving only the pure MOG1-125 extracellular domain. Here, we describe a simple protocol using only standard laboratory equipment to produce large quantities of pure MOGtag or MOG1-125. This protocol consistently generates over 200 mg of MOGtag protein. Immunization with either MOGtag or MOG1-125 generates an autoimmune response that includes pathogenic B cells that recognize the native mouse MOG.
Introduction
MS is een menselijke ziekte gekenmerkt door chronische ontsteking en neurodegeneratie van het CZS die wordt gedacht te worden veroorzaakt door een auto-immuunreactie gericht myeline. Het verlies van myeline en axonen na verloop van tijd leiden tot een geleidelijke afname van de cognitieve en motorische functie 1. "Experimentele auto-immune Encefalomyelitis" is een overkoepelende term voor diermodellen van auto-immuunziekten gericht CNS myeline. Als menselijke MS, EAE wordt doorgaans gekenmerkt door infiltratie van immuuncellen van het centrale zenuwstelsel en in sommige gevallen, demyelinisatie 2. De mate waarin een bepaalde EAE model lijkt op menselijke MS mede afhankelijk van de soort of stam gebruikt en de complexiteit van het onderliggende anti-myeline auto-immuunreactie.
Anti-myeline autoimmuniteit kan experimenteel worden geïnduceerd op verschillende manieren, maar de meest gebruikte methode tegenwoordig gebruikt om muizen te immuniseren met een korte peptide van aminozuren nabootsen van de immunodominante CD4 <sup> + T cel epitoop van een myeline-eiwit. Dit is het minimum vereiste om een pathogene respons te induceren. Misschien is de meest voorkomende van deze is een 21 aminozuur peptide afgeleid van myeline oligodendrocyt glycoproteïne (MOG 35-55), die wordt gebruikt om EAE te induceren in C57BL / 6 muizen 3. Voor sommige experimentele doeleinden wenselijk of zelfs noodzakelijk om immuniseren met grotere eiwitantigenen en inderdaad zijn er verschillende voordelen aan deze via immunisatie met korte peptide. Ten eerste omdat MHC beperking korte peptiden gewoonlijk alleen effectief in een zeer beperkt aantal stammen, terwijl grotere eiwitantigenen die ofwel het gehele eiwit of een specifiek domein kan normaal worden voor de presentatie in verschillende soorten verwerkt meerdere inteelt muizenstammen of 4. Ten tweede, een groter eiwit antigeen kan induceren een meer complexe immuunrespons waarin meer soorten lymfocyten in antigenherkenning, plaats limiting antigeenherkenning aan CD4 + T-cellen. Bijvoorbeeld, B-cellen via hun B-cel receptor (BCR) communiceren rechtstreeks met geheel in plaats van verwerkte dierlijke eiwitten. Wij en anderen hebben aangetoond dat B-cellen geactiveerd door MOG 35-55 immunisatie niet herkent MOG eiwitten 5. Aangezien B-cellen werden onlangs aangetoond dat een pathogene rol spelen bij menselijke MS 6, EAE modellen die B-cellen bevatten bij auto pathologie steeds belangrijker.
Ondanks de voordelen van grotere eiwitantigenen EAE te induceren, blijven er enkele commercieel beschikbare bronnen voor dergelijke eiwitten. Inderdaad, terwijl korte peptiden zoals MOG 35-55 snel en tegen relatief lage kosten kunnen worden gesynthetiseerd, de commerciële mogelijkheden MOG eiwitten zijn beperkt en de kosten aanzienlijk te schaffen. Toch zijn er een aantal expressievectoren beschikbaar voor onderzoeksgroepen om MOG extracellulair domein te genereren (MOG 1-125) zelf. however, alle expressiesystemen die we hebben geïdentificeerd in de literatuur zijn gebaseerd op oudere technologie die sindsdien zijn vervangen door efficiëntere expressiesystemen 7. Daarnaast bieden de meeste zijn gebaseerd op ratten of mensen MOG 8. Voor sommige onderzoeken van auto-immuniteit bij muizen, een antigeen op basis van de muis MOG autoantigeen voorkeur. Tenslotte alle MOG-gebaseerde eiwitten die we hebben geïdentificeerd, commerciële of als expressievectoren, zijn fusie-eiwitten die additionele aminozuren aan de MOG 1-125 base. Deze omvatten een tag voor zuivering en meestal andere sequenties ook, waarvan vele een functie we konden identificeren.
Om deze beperkingen te pakken, genereerden wij een nieuwe fusie-eiwit op basis van de muis MOG extracellulaire domein gefuseerd aan een label met thioredoxine de bekende onoplosbaarheid van MOG eiwit 5 bestrijden. De tag sequentie bevat ook een 6xHis sequentie voor zuivering en een TEV protease kelAvage plaats dat zorgt voor de volledige verwijdering van tagsequenties, indien gewenst. Dit is de enige methode die we ons bewust van de zuivere MOG 1-125-eiwit te genereren. Om de productie van grote hoeveelheden eiwit te vergemakkelijken, de MOG 1-125 sequentie is codon-geoptimaliseerd voor bacteriële expressie en MOG tag fusie-eiwit werd in de pET-32 expressiesysteem ingebracht. Hier beschrijven we in detail het protocol te produceren en te zuiveren MOG tag eiwit en pure MOG 1-125, met behulp van niet-gespecialiseerde apparatuur beschikbaar voor de meeste immunologie laboratoria.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier hebben we een protocol beschreven voor de productie van MOG tag eiwit en hoe zuiver MOG 1-125 van de MOG tag eiwit te genereren. Dit protocol is gebaseerd op zowel standaard His-tag eiwitten zuiveringswerkwijzen, en een eerder beschreven protocol voor het genereren van een oudere MOG-eiwitten 15. Hoewel het hier niet wordt beschreven, het primaire gebruik van de MOG tag eiwit is om EAE te induceren door middel van immunisatie met eiwitantigeen. Een protocol bes…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a grant from the Multiple Sclerosis Society of Canada. RWJ is the recipient of the Waugh Family MS Society of Canada Doctoral Studentship Award.
Materials
| BL21 E.coli– pet32-MOGtag | Kerfoot lab | These bacteria are required to make the MOGtag protein. Glycerol stocks of these bacteria are available upon request. | |
| LB broth miller | Bioshop | LBL407.1 | |
| Ampicillin | bio basic | AB0028 | Reconsititute the powder into 50% ethanol/ 50% H2O at 100 mg/ml. Store at -20 °C. |
| IPTG | Bioshop | IPT002.5 | Reconsititute the powder into H2O at 1M and store at -20 °C. |
| Chicken-egg lysozyme | Bioshop | LYS702.10 | Reconstitute in H2O at 50 mg/ml and store at -80 °C. |
| Triton-X100 | Sigma | T-8532 | |
| Phosphate buffered saline | life technologies | 20012-027 | Commercial phosphate buffered saline is not required, any standard lab made phosphate buffered saline is sufficient. |
| Sodium chloride | Bioshop | SOD004.1 | |
| Tris-HCl | Bioshop | TRS002.1 | |
| Imidazole | Bioshop | IMD508.100 | |
| Guanidine-HCl | Sigma | G3272 | The quality must be greater than 98% purity. |
| 0.5M EDTA | bioshop | EDT111.500 | |
| Nickel (II) sulfate | Bioshop | NIC700.500 | |
| His bind resin | EMD Millipore | 69670-3 | Store in 20% ethanol 80% H2O at 4 °C |
| Anhydrous ethanol | Commercial Alcohols | P016EAAN | Dilute with water as needed. |
| Glacial acetic acid | Bioshop | ACE222.1 | |
| Sodium acetate trihydrate | Bioshop | SAA305.500 | |
| bovine serum albumin standard | bio-rad | 500-0206 | |
| Bio-rad protein assay dye reagent concentrate | bio-rad | 500-0006 | |
| Ethylenediamine tetraacetic acid, disodium salt dihydrate | Fisher scientific | BP120-500 | |
| Tris-base | Bioshop | TRS001.1 | |
| 7000 MW Snakeskin dialysis tubing | Thermoscientific | 68700 | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma | M3148-25ml | This reagent should not be handled outside of a fume hood. |
| AcTEV protease | lifetechnologies | 12575-015 | Producing your own TEV protease can be accomplished using (https://www.addgene.org/8827/) and purified as in reference 17 |
| Polyethyleneglycol 3350 | Bioshop | PEG335.1 | |
| polyethyleneglycol 8000 | Bioshop | PEG800.1 | |
| Nunc MaxiSorp flat-bottom 96 well plate | ebioscience | 44-2404-21 | |
| Sonicator | Fisher scientific | FB-120-110 | |
| Eon microplate spectrometer | Biotek | 11-120-611 | This equipment uses the Gen5 data analysis software. |
| Gen5 data analysis software | BioTek | ||
| sodium dodecyl sulphate | Bioshop | SDS001 | |
| bromophenol blue | Bioshop | BRO777 | |
| Glycerol | Bioshop | GLY001 | |
| Protein desalting columns | Thermoscientific | 89849 | |
| Glycine | Bioshop | GLN001 | |
| precast 12% polyacrylamide gel | bio-rad | 456-1045 | |
| Rapid stain reagent | EMD Millipore | 553215 | |
| Gel dock EZ imager | bio-rad | 1708270 | |
| White Light Sample Tray | bio-rad | 1708272 | Used along with gel dock EZ imager for coomassie blue stains |
| Protein ladder | bio-rad | 1610375 |
Referências
- Compston, A., Coles, A. Multiple sclerosis. Lancet. 372 (9648), 1502-1517 (2008).
- Baxter, A. G. The origin and application of experimental autoimmune encephalomyelitis. Nat Rev Immunol. 7 (11), 904-912 (2007).
- Bittner, S., Afzali, A. M., Wiendl, H., Meuth, S. G. Myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG35-55) induced experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in C57BL/6 mice. J Vis Exp. (86), (2014).
- Shetty, A., et al. Immunodominant T-cell epitopes of MOG reside in its transmembrane and cytoplasmic domains in EAE. Neurol Neuroimmunol Neuroinflamm. 1 (2), 22 (2014).
- Dang, A. K., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. B cell recognition of myelin oligodendrocyte glycoprotein autoantigen depends on immunization with protein rather than short peptide, while B cell invasion of the CNS in autoimmunity does not. J Neuroimmunol. 278, 73-84 (2015).
- Barun, B., Bar-Or, A. Treatment of multiple sclerosis with anti-CD20 antibodies. Clin Immunol. 142 (1), 31-37 (2012).
- Bettadapura, J., Menon, K. K., Moritz, S., Liu, J., Bernard, C. C. Expression, purification, and encephalitogenicity of recombinant human myelin oligodendrocyte glycoprotein. J Neurochem. 70 (4), 1593-1599 (1998).
- Oliver, A. R., Lyon, G. M., Ruddle, N. H. Rat and human myelin oligodendrocyte glycoproteins induce experimental autoimmune encephalomyelitis by different mechanisms in C57BL/6 mice. J Immunol. 171 (1), 462-468 (2003).
- . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Molecular Cloning. J Vis Exp. , (2016).
- . JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Restriction Enzyme Digests. J Vis Exp. , (2016).
- Hamada, H., Arakawa, T., Shiraki, K. Effect of additives on protein aggregation. Curr Pharm Biotechnol. 10 (4), 400-407 (2009).
- Dang, A. K., Tesfagiorgis, Y., Jain, R. W., Craig, H. C., Kerfoot, S. M. Meningeal Infiltration of the Spinal Cord by Non-Classically Activated B Cells is Associated with Chronic Disease Course in a Spontaneous B Cell-Dependent Model of CNS Autoimmune Disease. Front Immunol. 6, 470 (2015).
- LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
- Raines, R. T., McCormick, M., Van Oosbree, T. R., Mierendorf, R. C. The S.Tag fusion system for protein purification. Methods Enzymol. 326, 362-376 (2000).
- Amor, S., et al. Identification of epitopes of myelin oligodendrocyte glycoprotein for the induction of experimental allergic encephalomyelitis in SJL and Biozzi AB/H mice. J Immunol. 153 (10), 4349-4356 (1994).
- Kostallas, G., Lofdahl, P. A., Samuelson, P. Substrate profiling of tobacco etch virus protease using a novel fluorescence-assisted whole-cell assay. PLoS ONE. 6 (1), e16136 (2011).
- Litzenburger, T., et al. B lymphocytes producing demyelinating autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice. J Exp Med. 188 (1), 169-180 (1998).
- Zhang, H. Y., et al. Separation and purification of Escherichia coli-expressed human thymosin-alpha1 using affinity chromatography and high-performance liquid chromatography. Protein Expr Purif. 77 (2), 140-145 (2011).
- Tegel, H., Ottosson, J., Hober, S. Enhancing the protein production levels in Escherichia coli with a strong promoter. FEBS J. 278 (5), 729-739 (2011).
- Akirav, E. M., Bergman, C. M., Hill, M., Ruddle, N. H. Depletion of CD4(+)CD25(+) T cells exacerbates experimental autoimmune encephalomyelitis induced by mouse, but not rat, antigens. J Neurosci Res. 87 (15), 3511-3519 (2009).
- Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).
- Blommel, P. G., Fox, B. G. A combined approach to improving large-scale production of tobacco etch virus protease. Protein Expr Purif. 55 (1), 53-68 (2007).
