Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.
알츠하이머 병은 고령화에 영향을 미치는 신경 퇴행성 질환이다. 질병의 주요 신경 병리학 적 특징은 아밀로이드 – 베타의 과잉 생산과 고통받는 사람들의 뇌 영역에서 아밀로이드 베타 플라크의 증착이다. 지난 몇 년 동안 과학자들은 아밀로이드 – 베타 병리를 복제하려고 많은 알츠하이머 병 마우스 모델을 생성했다. 불행히도, 마우스 모델은 선택적 질환 특징을 모방. 신경 세포 사망, 알츠하이머 병 환자의 뇌에서 현저한 효과가 현저 이들 마우스에서 부족하다. 뉴런 가장 독성임이 입증되었다 아밀로이드 – 베타의 형태 – – 따라서, 우리 등은 직접 아밀로이드 – 베타의 수용성 올리고머 종을 주입하는 방법을 채용 한 stereotaxically 뇌로. 이 보고서에서 우리는 선택 뇌 영역에 아밀로이드 – 베타 수준을 증가의 수술 기법을 문서화하는 남성 C57BL / 6J 마우스를 사용합니다.콜린성 회로에 의해 접속되어 기저 전뇌와 함께이 뇌 구조체가 변성 질환의 영역 중 하나 나타내므로 투여 대상은 해마의 치아 이랑이다. 브로카의 대각선 대역의 수직 사지에서 세포 사멸 및 콜린성 뉴런 손실에 수반하는 증가가있을 정위 주입을 통해 치아 이랑에서 아밀로이드 베타 상승의 결과, 1 주 내에 치아 이랑에서 신경 세포 손실의 증가를 나타내 기저 전뇌의. 이러한 효과는 2 주까지 관찰된다. 우리의 데이타는 현재 아밀로이드 베타 주입 모델은 단기간에 특정 영역의 신경 세포 사멸을 해결하기위한 대안이 마우스 모델을 제공한다는 것을 시사한다. 이 모델의 이점은 아밀로이드 – 베타가 시공간하게 증가 될 수 있다는 것이다.
아밀로이드 – 베타 (Aβ 1-42)으로 구성되어 아밀로이드 플라크 예금, 알츠하이머 병 (AD)의 병리의 핵심 기능입니다. 많은 연구는 신경 세포의 죽음, 시냅스 영양 장애, 손실 및 기능 장애를 유발 재조합 올리고머 Aβ 1-42의 높은 독성 수준을 보여 주었다; 뿐만 아니라 학습과 기억 적자 1-4으로. 영향을받는 뇌 영역은 해마, 대뇌 피질, 그리고 기저 전뇌와 편도체 (5, 6)와 같은 피질 하 구조를 포함한다. 지금까지 광고의 Aβ 1-42 병리학을 시뮬레이션하려고 여러 형질 전환 마우스 모델이있다. 변형에 따라이 동물은 AD의 선택 병리학 적 기능을 검사에 유용하다는 것을 증명한다. 불행하게도,이 트랜스 제닉 라인들, 및 APP23 5XFAD 제외한 이들 마우스는 완전히 신경 손실, AD의 핵심 양태를 복제하지 않는다. 심지어 APP23 및 5XFAD에서 관찰되는 신경 세포의 손실, 신경 세포의 죽음 obser와VED는 몇 가지 선택 지역 7,8에, 미묘한 나이 의존하고 분리 하였다.
야생형 마우스의 뇌에 Aβ 올리고머 1-42의 직접 주입 amyloidopathy 1,9,10의 신경 세포 죽음의 측면을 복제 생체 모델의 우수한을 제공합니다. 일반적으로 사용되는 형질 전환 마우스 모델과 달리 Aβ 올리고머 1-42 주입 모델은 급성 공간 및 시간 방식으로 Aβ에게 1-42 수준을 높이기에 이상적입니다. 이 모델 야생형 마우스를 사용하는 장점은 트랜스 제닉 마우스에 도입 라인 돌연변이 잠재적 보상 또는 부작용을 제거한다. 과거의 연구는 해마에 Aβ 1-42의 독성 수준을 주입하여 일주 (1)의 내부에 주입 부위의 근방에서 신경 세포 사멸을 유도하는 것으로 나타났다. 또한, Aβ 1-42은 콜린성 뉴런 (11) 기저 전뇌 독성 관찰과 일관성이 있음을해마에 프로젝트 콜린성 신경 세포 (BFCN) 인구는 효과적으로 뇌에서 고립 된 신경 회로의 시험을 허용, 생쥐에서 베타 – 아밀로이드 주입 1,10 다음 7~14일 내 20-50% 감소된다. 대부분의 제어 / 차량 및 올리고머 Aβ 1-42 솔루션 해마 (12)의 치아 이랑에 동측 BFCN 프로젝트 때문에 비교가 좌우 반구 (1) 사이에 만들어 질 수 뇌의 양쪽에 주입 될 수있다.
이 보고서에서 우리는 성인 야생 형 C57BL / 6J 마우스에 대한 자세한 수술과 주사 방법을 제공 할 것입니다. 이 마우스 변형 때문에 연구의 광범위한 사용으로 선택된다. 기술적으로, 임의의 뇌 영역은 그러나 여기서 우리는이 기술을 설명하기 위해 대상으로 해마의 치아 이랑을 사용, 주입 대상이 될 수있다.
1) 무균 기술을 사용합니다 : 실험자 또는 외과 의사가 반드시 성공적으로 Aβ 1-42 주사를 달성하기 위해 2) 올바르게 정확한 좌표와 관심의 뇌 영역을 식별; 3) 적절 AP 및 ML 축 평준화 뇌 정위 프레임에 마우스를 보호 할 수; 4) 정밀 미세 조작기를 작동 할 수있는 능력을 가지고; 5) 적절한 수술 치료를 보장합니다. 이러한 주요 단계는 다음 경우 마우스없이 관찰 감염으로 수술을 생존해야한?…
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 신경 질환의 국립 연구소에 의해 지원과 뇌졸중 알츠하이머 병 연구 투자 노화 (CMT에) NS081333, 알츠하이머 협회 보조금 NIRG-10-171721과 (어에) 정신 건강 보조금 MH096702의 국립 연구소 및 국립 연구소를 부여했다 (YYJ과 JB에) 컬럼비아 대학 파일럿 부여 AG008702에서 센터.
Ketamine HCl (100mg/ml) | Henry Schein Medical | 1049007 | 100 mg ketamine per 1 kg animal |
Xylazine (20mg/ml) | Henry Schein Medical | not available | 10 mg xylazine per 1 kg animal |
Buprenex (0.3mg/ml) | Henry Schein Medical | 1217793 | 0.1 mg buprenex per 1 kg animal |
Aβ1-42 | David Teplow/UCLA | not available | 100 μM; This amyloid was used in the paper |
Aβ1-42 | Bachem | H-1368 | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-80B | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
Scrambled Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-46B | Can be used as control peptide for comparing Aβ1-42 |
NU4 Antibody (Oligomeric Amyloid Antibody) | Gift from William Klein/Northwestern U. | not available | 1:2000 dilution |
Anti-Amyloid Oligomeric Antibody (Polyclonal Rabbit) | EMD Millipore | AB9234 | May be used in place of Nu4; needs to be tested by the end user |
6E10 Antibody (Monoclonal Mouse) (Amyloid Antibody) | Biolegend | sig-39320 | 1:1000 dilution |
ChAT Antibody (Polyclonal Goat) | Millipore | AB144P | 1:100 dilution |
DeadEnd Fluorometric TUNEL system | Promega | G3250 | Follow manufacturer's directions for use |
Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Use when coverslipping slides |
Fluorogold | Fluorochrome, LLC | not available | 2% solution |
Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | For making 70% ethanol for sanitizing and disinfecting |
Novex 10-20% Tricine gel | Life Technologies | EC6625BOX | For separating Aβ1-42 |
Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Life Technologies | LC1675 | For running 10-20% Tricine gels |
Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Life Technologies | LC3675 | For transferring 10-20% Tricine gels |
SuperSignal Western Blot Enhancer | Thermo Scientific | 46640 | For enhancing Aβ1-42 signal; follow manufacturer's protocol |
Protran BA79 Nitrocellulose Blotting Membrane, 0.1 μm | GE Healthcare Life Sciences | 10402088 | For transferring 10-20% Tricine gels |
Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | Electrophoresis aparatus for running 10-20% Tricine gels |
GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores |
Refresh Optive Lubricant Eye Drops | Allergan | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores; Can be used in place of GenTeal |
Betadine | Stoelting | 50998 | For sanitizing and disinfecting |
Round/Tapered Spatula | VWR | 82027-490 | For opening animal mouth |
Bulldog Serrefines Clamps (Jaw Dims. 9X1.6mm; Length 28mm) | Fine Science Tools | 18050-28 | Optional; For keeping scalp skin apart during injection |
Straight Fine Scissors (Cutting edge 25mm; Length 11.5cm) | Fine Science Tools | 14060-11 | For cutting scalp |
#3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
#11 Surgical Blade | Fine Science Tools | 10011-00 | For making scalp incision |
Student Standard Pattern Forcep (Tip Dims. 2.5×1.5mm; Length 11.5cm) | Fine Science Tools | 91100-12 | For holding scalp closed during suturing |
Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | For shaving hair |
T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific | TP-700 | For warming animal during surgery |
Resusable Warmining Pad (5" x 10") | Kent Scientific | TPZ-0510FEA | For attaching it to the T/Pump warm water recirculator to warm the animal during surgery |
Cordless Micro Drill | Stoelting | 58610 | Use 0.8mm steel burrs to drill holes in the skull |
Lab Standard Stereotaxic Instrument with Mouse & Neonatal Rat Adaptor | Stoelting | 51615 | |
Just for Mouse Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51730 | Can use this in place of Stoelting Cat. #51615 |
Quintessential Stereotaxic Injector | Stoelting | 53311 | |
Dry Glass Bead Sterilizer | Stoelting | 50287 | For sterilizing stainless steel instruments |
Sterile Surgical Drape (18" x 26") | Stoelting | 50981 | |
Hamilton Syringe 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL | Hamilton Company | 7637-01 | For brain injection; use different syringes for different solutions |
29 Gauge Needle, Small Hub RN NDL | Hamilton Company | 7803-06 | For attaching to the Hamilton syringe for brain injection |
1 ml BD Tuberculin Syringes | VWR | BD309659 | For administering anesthesia and saline |
30 Gauge Needle (0.5") | VWR | BD305106 | For administering anesthesia and saline |
Portable Electronic CS Series Scale (Ohaus) | VWR | 65500-202 | For weighing animals to determine anesthesia dose |
Hot plate (Top Plate Dims. 7.25×7.25in) | VWR | 47751-148 | For warming animals post-surgery |
Sofsilk Silk Suture C-1 Cutting 3/8, 12 mm | Covidien | S1173 | For closing wound |
Vetbond Tissue Adhesive (3M) | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | Optional: for aiding in wound closure; Use with suture. |
Cotton-Tipped Wooden-Shaft Sterile Applicators | Fisher scientific | 22-029-488 | For cleaning and drying surgical wound |
Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For collecting brain sections |
VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm | VWR | 48393241 | For mounting microscope slides |
Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter 0.2 μm | Fisher Scientific | 194-2520 | For sterilizing saline solution |
Sterile dual tip skin markers by Viscot Medical | Medline | VIS1422SRL91 | For marking coordinates on the skull |