Fare Hippocampus içine Oligomerik Amiloid-beta Stereotaksik İnfüzyon
Summary
Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.
Abstract
Alzheimer hastalığı, yaşlanma nüfusu etkileyen nörodejeneratif bir hastalıktır. Hastalığın önemli bir nöropatolojik özellik amiloid-beta aşırı üretim ve etkilenen bireylerin beyin bölgelerinde amiloid beta plakların birikmesidir. Yıllar boyunca bilim adamları, amiloid beta patolojiyi çoğaltmak girişiminde sayısız Alzheimer hastalığı fare modelleri yarattı. Ne yazık ki, fare modelleri, sadece seçici bir şekilde hastalık özelliklerini taklit eder. Nöronal ölüm, Alzheimer hastalığı olan hastaların beyinlerinde belirgin bir etki fark bu farelerde yoksundur. Nöronlar en zehirli olduğu kanıtlanmıştır amiloid-beta biçimleri – – Bu nedenle, biz ve diğerleri doğrudan amiloid-beta çözünür oligomerik türler beslerken bir yöntem istihdam var stereotaxically beyin içine. Bu yazıda seçkin bir beyin bölgesi amiloid beta seviyelerinin arttırılması, bu cerrahi teknik belgelemek için erkek C57BL / 6J fareler kullanmaktadır.Kolinerjik devre ile bağlıdır bazal ön ile birlikte bu beyin yapısı, hastalığın dejenerasyon alanlarından biri temsil ettiği infüzyon hedef hipokampusun dentat girus olduğunu. Broca diyagonal bant dikey bacak hücre ölümü ve kolinerjik nöron kaybı eşlik eden bir artış iken, stereotaksik infüzyon yoluyla dentat girus amiloid-beta yükseltilmesi sonucu, 1 hafta içinde, dentat girus nöron kaybına yükselerek Bazal önbeyin. Bu etkiler 2 haftaya kadar gözlenir. Elde ettiğimiz veriler mevcut amiloid beta infüzyon modeli, kısa vadede bölgeye özgü nöron ölümünü ele alternatif fare modeli sağladığını göstermektedir. Bu modelin avantajı amiloid-beta mekansal ve zamansal biçimde yüksek olmasıdır.
Introduction
Amiloid-beta (Aβ 1-42) oluşan amiloid lekesi yatakları, Alzheimer hastalığı (AD) patolojisinde önemli bir özelliğidir. Birçok çalışma nöron ölümünü, sinaptik distrofi, kayıp ve disfonksiyonu ortaya rekombinant oligomerik Aβ 1-42 o yüksek veya toksik seviyelere göstermiştir; yanı sıra, öğrenme ve hafıza açıkları 1-4 olarak. Etkilenen beyin bölgeleri hipokampus, korteks ve bazal ön beyin ve amigdala 5,6 gibi subkortikal yapılar yer alıyor. Bugüne kadar, AD Aβ 1-42 patoloji simüle girişiminde birden transgenik fare modelleri vardır. Zorlanma bağlı bu hayvanlar AD seçkin patolojik özelliklerini inceleyerek yararlı olduğunu kanıtlayabilir. Ne yazık ki, 2 transgenik kuşaklar, APP23 ve 5XFAD hariç olmak üzere, bu fareler, tam nöronal kayıp, MS önemli bir yönünü çoğaltma olmadı. Hatta APP23 ve 5XFAD gözlenen nöronal kayıp, nöronal ölüm glikozu ileved birkaç seçme bölgelere 7,8 kadar, ince yaşa bağımlı ve izole oldu.
vahşi tip fare beyin oligomerik Aβ 1-42 doğrudan infüzyon amyloidopathy 1,9,10 nöronal ölüm yönü çoğaltır in vivo modelinde mükemmel içerir. Yaygın olarak kullanılan transgenik fare modellerinin aksine oligomerik Aβ 1-42 infüzyon modeli akut bir mekansal ve zamansal bir şekilde Aβ 1-42 seviyesini yükseltmektir için idealdir. Bu model için, vahşi tip fareler kullanılarak avantajı transgenik fare hatları tanıtılan mutasyon potansiyel dengeleme ya da yan etkileri ortadan kaldırır. Son çalışmalar, hipokampusa Aβ 1-42 toksik düzeylerini beslerken 1 hafta 1 içinde enjeksiyon bölgesinde çok yakın nöron ölümünü ortaya çıkarır göstermiştir. Dahası, Aβ 1-42 kolinerjik nöronların 11 bazal ön beyin için toksik gözlem ile tutarlı olduğunuhipokampus için projeler kolinerjik nöron (BFCN) nüfus etkin bir beyinde izole nöronal devrenin sınavları için izin farelerde, beta-amiloid infüzyon 1,10 izleyen 7-14 gün içinde% 20-50 azalır. Çoğunlukla, kontrol / araç ve oligomerik Aβ 1-42 çözümler hipokampus 12 dentat girus için ipsilateral BFCN projesi yana karşılaştırmalar, sol ve sağ hemisfer 1 arasında yapılacak izin beynin her iki tarafında enjekte edilebilir.
Bu yazıda erişkin vahşi tip C57BL / 6J fareler için detaylı bir ameliyat ve enjeksiyon metodoloji sağlayacaktır. Bu fare suşu nedeniyle araştırma geniş kullanım seçilir. Teknik olarak, herhangi bir beyin bölgesi, ancak burada tekniği açıklamak için bir hedef olarak hipokampusun dentat girus kullanır, infüzyon için hedeflenebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
1) aseptik teknik kullanır;: deneyci veya cerrah olmalıdır başarılı Aβ 1-42 enjeksiyon elde etmek için 2) doğru doğru koordinatlar ile çıkar beyin bölgesini belirlemek; 3) düzgün AP ve ML ekseninde tesviye beyni stereotaksik çerçeve fare sabitlemek mümkün; 4) hassas mikromanipülatör çalıştırmak için yeteneği var; 5) Uygun post-operatif bakım sağlamak. Bu önemli adımlar takip edilirse, fare gözlemlenebilir enfeksiyonu ile ameliyat hayatta gerekir.
<e…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Nörolojik Bozukluklar Enstitüsü tarafından desteklenen ve İnme Alzheimer Hastalığı Araştırma finanse Yaşlanma üzerine (CMT kadar) NS081333, Alzheimer Derneği hibe NIRG-10-171721 ve (UH kadar) Ruh Sağlığı Hibe MH096702 Ulusal Enstitüsü ve Ulusal Enstitüsü hibe edildi (YYJ ve JB) Columbia Üniversitesi, pilot hibe AG008702 de merkezi.
Materials
| Ketamine HCl (100mg/ml) | Henry Schein Medical | 1049007 | 100 mg ketamine per 1 kg animal |
| Xylazine (20mg/ml) | Henry Schein Medical | not available | 10 mg xylazine per 1 kg animal |
| Buprenex (0.3mg/ml) | Henry Schein Medical | 1217793 | 0.1 mg buprenex per 1 kg animal |
| Aβ1-42 | David Teplow/UCLA | not available | 100 μM; This amyloid was used in the paper |
| Aβ1-42 | Bachem | H-1368 | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-80B | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Scrambled Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-46B | Can be used as control peptide for comparing Aβ1-42 |
| NU4 Antibody (Oligomeric Amyloid Antibody) | Gift from William Klein/Northwestern U. | not available | 1:2000 dilution |
| Anti-Amyloid Oligomeric Antibody (Polyclonal Rabbit) | EMD Millipore | AB9234 | May be used in place of Nu4; needs to be tested by the end user |
| 6E10 Antibody (Monoclonal Mouse) (Amyloid Antibody) | Biolegend | sig-39320 | 1:1000 dilution |
| ChAT Antibody (Polyclonal Goat) | Millipore | AB144P | 1:100 dilution |
| DeadEnd Fluorometric TUNEL system | Promega | G3250 | Follow manufacturer's directions for use |
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Use when coverslipping slides |
| Fluorogold | Fluorochrome, LLC | not available | 2% solution |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | For making 70% ethanol for sanitizing and disinfecting |
| Novex 10-20% Tricine gel | Life Technologies | EC6625BOX | For separating Aβ1-42 |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Life Technologies | LC1675 | For running 10-20% Tricine gels |
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Life Technologies | LC3675 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| SuperSignal Western Blot Enhancer | Thermo Scientific | 46640 | For enhancing Aβ1-42 signal; follow manufacturer's protocol |
| Protran BA79 Nitrocellulose Blotting Membrane, 0.1 μm | GE Healthcare Life Sciences | 10402088 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | Electrophoresis aparatus for running 10-20% Tricine gels |
| GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores |
| Refresh Optive Lubricant Eye Drops | Allergan | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores; Can be used in place of GenTeal |
| Betadine | Stoelting | 50998 | For sanitizing and disinfecting |
| Round/Tapered Spatula | VWR | 82027-490 | For opening animal mouth |
| Bulldog Serrefines Clamps (Jaw Dims. 9X1.6mm; Length 28mm) | Fine Science Tools | 18050-28 | Optional; For keeping scalp skin apart during injection |
| Straight Fine Scissors (Cutting edge 25mm; Length 11.5cm) | Fine Science Tools | 14060-11 | For cutting scalp |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Surgical Blade | Fine Science Tools | 10011-00 | For making scalp incision |
| Student Standard Pattern Forcep (Tip Dims. 2.5×1.5mm; Length 11.5cm) | Fine Science Tools | 91100-12 | For holding scalp closed during suturing |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | For shaving hair |
| T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific | TP-700 | For warming animal during surgery |
| Resusable Warmining Pad (5" x 10") | Kent Scientific | TPZ-0510FEA | For attaching it to the T/Pump warm water recirculator to warm the animal during surgery |
| Cordless Micro Drill | Stoelting | 58610 | Use 0.8mm steel burrs to drill holes in the skull |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument with Mouse & Neonatal Rat Adaptor | Stoelting | 51615 | |
| Just for Mouse Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51730 | Can use this in place of Stoelting Cat. #51615 |
| Quintessential Stereotaxic Injector | Stoelting | 53311 | |
| Dry Glass Bead Sterilizer | Stoelting | 50287 | For sterilizing stainless steel instruments |
| Sterile Surgical Drape (18" x 26") | Stoelting | 50981 | |
| Hamilton Syringe 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL | Hamilton Company | 7637-01 | For brain injection; use different syringes for different solutions |
| 29 Gauge Needle, Small Hub RN NDL | Hamilton Company | 7803-06 | For attaching to the Hamilton syringe for brain injection |
| 1 ml BD Tuberculin Syringes | VWR | BD309659 | For administering anesthesia and saline |
| 30 Gauge Needle (0.5") | VWR | BD305106 | For administering anesthesia and saline |
| Portable Electronic CS Series Scale (Ohaus) | VWR | 65500-202 | For weighing animals to determine anesthesia dose |
| Hot plate (Top Plate Dims. 7.25×7.25in) | VWR | 47751-148 | For warming animals post-surgery |
| Sofsilk Silk Suture C-1 Cutting 3/8, 12 mm | Covidien | S1173 | For closing wound |
| Vetbond Tissue Adhesive (3M) | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | Optional: for aiding in wound closure; Use with suture. |
| Cotton-Tipped Wooden-Shaft Sterile Applicators | Fisher scientific | 22-029-488 | For cleaning and drying surgical wound |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For collecting brain sections |
| VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm | VWR | 48393241 | For mounting microscope slides |
| Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter 0.2 μm | Fisher Scientific | 194-2520 | For sterilizing saline solution |
| Sterile dual tip skin markers by Viscot Medical | Medline | VIS1422SRL91 | For marking coordinates on the skull |
Referências
- Baleriola, J., et al. Axonally Synthesized ATF4 Transmits a Neurodegenerative Signal across Brain Regions. Cell. 158 (5), 1159-1172 (2014).
- Haass, C., Selkoe, D. J. Soluble protein oligomers in neurodegeneration: lessons from the Alzheimer’s amyloid beta-peptide. Nature reviews. Molecular cell biology. 8 (2), 101-112 (2007).
- Knowles, J. K., et al. The p75 neurotrophin receptor promotes amyloid-beta(1-42)-induced neuritic dystrophy in vitro and in vivo. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (34), 10627-10637 (2009).
- Troy, C. M., et al. beta-Amyloid-induced neuronal apoptosis requires c-Jun N-terminal kinase activation. Journal of neurochemistry. 77 (1), 157-164 (2001).
- Crews, L., Rockenstein, E., Masliah, E. APP transgenic modeling of Alzheimer’s disease: mechanisms of neurodegeneration and aberrant neurogenesis. Brain structure & function. 214 (2-3), 111-126 (2010).
- Gotz, J., Ittner, L. M. Animal models of Alzheimer’s disease and frontotemporal dementia. Nature reviews. Neuroscience. 9 (7), 532-544 (2008).
- Calhoun, M. E., et al. Neuron loss in APP transgenic mice. Nature. 395 (6704), 755-756 (1998).
- Oakley, H., et al. Intraneuronal beta-amyloid aggregates, neurodegeneration, and neuron loss in transgenic mice with five familial Alzheimer’s disease mutations: potential factors in amyloid plaque formation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26 (40), 10129-10140 (2006).
- Jean, Y. Y., et al. Caspase-2 is essential for c-Jun transcriptional activation and Bim induction in neuron death. The Biochemical journal. 455 (1), 15-25 (2013).
- Sotthibundhu, A., et al. Beta-amyloid(1-42) induces neuronal death through the p75 neurotrophin receptor. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28 (15), 3941-3946 (2008).
- Kar, S., Quirion, R. Amyloid beta peptides and central cholinergic neurons: functional interrelationship and relevance to Alzheimer’s disease pathology. Progress in brain research. 145, 261-274 (2004).
- Leranth, C., Frotscher, M. Organization of the septal region in the rat brain: cholinergic-GABAergic interconnections and the termination of hippocampo-septal fibers. The Journal of comparative neurology. 289 (2), 304-314 (1989).
- Fa, M., et al. Preparation of oligomeric beta-amyloid 1-42 and induction of synaptic plasticity impairment on hippocampal slices. Journal of visualized experiments : JoVE. (41), (2010).
- Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2001).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of visualized experiments : JoVE. (65), (2012).
- Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. Journal of visualized experiments : JoVE. (4), (2007).
- Jin, M., et al. Soluble amyloid beta-protein dimers isolated from Alzheimer cortex directly induce Tau hyperphosphorylation and neuritic degeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (14), 5819-5824 (2011).
- Lambert, M. P., et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (11), 6448-6453 (1998).
- Masters, C. L., Selkoe, D. J. Biochemistry of amyloid beta-protein and amyloid deposits in Alzheimer disease. Cold Spring Harbor perspectives in medicine. 2 (6), a006262 (2012).
- Chakrabarti, M., et al. Estrogen receptor agonists for attenuation of neuroinflammation and neurodegeneration. Brain research bulletin. 109C, 22-31 (2014).
- Cirrito, J. R., et al. In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).
- Puzzo, D., et al. Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28 (53), 14537-14545 (2008).
- Puzzo, D., et al. Endogenous amyloid-beta is necessary for hippocampal synaptic plasticity and memory. Annals of. 69 (5), 819-830 (2011).
- Akpan, N., et al. Intranasal delivery of caspase-9 inhibitor reduces caspase-6-dependent axon/neuron loss and improves neurological function after stroke. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 31 (24), 8894-8904 (2011).
- Fulmer, C. G., et al. Astrocyte-derived BDNF supports myelin protein synthesis after cuprizone-induced demyelination. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 34 (24), 8186-8196 (2014).
- Thakker-Varia, S., et al. The neuropeptide VGF is reduced in human bipolar postmortem brain and contributes to some of the behavioral and molecular effects of lithium. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (28), 9368-9380 (2010).
- Greferath, U., et al. Enlarged cholinergic forebrain neurons and improved spatial learning in p75 knockout mice. The European journal of neuroscience. 12 (3), 885-893 (2000).
- Brashear, H. R., Zaborszky, L., Heimer, L. Distribution of GABAergic and cholinergic neurons in the rat diagonal band. Neurociência. 17 (2), 439-451 (1986).
- Clarke, D. J. Cholinergic innervation of the rat dentate gyrus: an immunocytochemical and electron microscopical study. Brain research. 360 (1-2), 349-354 (1985).
- Garcia-Osta, A., Alberini, C. M. Amyloid beta mediates memory formation. Learning & memory. 16 (4), 267-272 (2009).
