Stereotaktische Infusion von oligomeren Amyloid-beta in die Maus-Hippocampus
Summary
Here, we present a protocol for direct stereotaxic brain infusion of amyloid-beta. This methodology provides an alternative in vivo mouse model to address the short-term effects of amyloid-beta on brain neurons.
Abstract
Alzheimer-Krankheit ist eine neurodegenerative Erkrankung, die die Alterung der Bevölkerung. Ein wesentliches Merkmal der neuropathologischen Erkrankungen ist die Überproduktion von Amyloid-beta und die Ablagerung von Amyloid-beta-Plaques in Hirnregionen der betroffenen Individuen. Im Laufe der Jahre haben Wissenschaftler zahlreiche Alzheimer Mausmodelle, die die Amyloid-beta-Pathologie zu replizieren versuchen generiert. Leider sind die Maus-Modellen nur selektiv imitieren die Krankheitsmerkmale. Neuronalen Tod, ein bekannter Effekt im Gehirn von Alzheimer-Patienten wird spürbar fehlt in diesen Mäusen. Formen von Amyloid-beta, die nachweislich die meisten Neuronen toxisch zu sein – – stereotaktisch in das Gehirn Daher haben wir und andere ein Verfahren zum direkten Infusion löslichen oligomeren Spezies von Amyloid-beta beschäftigt. In diesem Bericht verwenden wir männliche C57BL / 6J-Mäusen, diese Operationstechnik zur Erhöhung Amyloid-beta Ebenen in einer ausgewählten Region des Gehirns zu dokumentieren. DieInfusions Ziel dem Gyrus dentatus des Hippocampus, weil diese Gehirnstruktur, zusammen mit dem basalen Vorderhirns, die durch das cholinerge Schaltung verbunden ist, für einen der Bereiche der Degeneration bei der Krankheit. Die Ergebnisse der Hebe Amyloid-beta im Gyrus dentatus über stereotaktischen Infusions offenbaren Steigerungen Verlust von Nervenzellen im Gyrus dentatus innerhalb von 1 Woche, während es einen entsprechenden Anstieg in Zelltod und cholinergen Neuronenverlust in der vertikalen Schenkel des diagonalen Bandes von Broca des basalen Vorderhirns. Diese Effekte werden bis zu 2 Wochen beobachtet. Unsere Daten weisen darauf hin, dass die aktuelle Beta-Amyloid-Infusion Modell bietet eine alternative Maus-Modell zu Region spezifische Neuronen Tod in einem kurzfristig anzugehen. Der Vorteil dieses Modells ist, dass Amyloid-beta in einer räumlichen und zeitlichen Weise erhöht werden.
Introduction
Amyloid Plaque-Ablagerungen, die von Amyloid-beta (1-42 A & bgr;) zusammengesetzt sind, sind ein wesentliches Merkmal der Pathologie der Alzheimer-Krankheit (AD). Zahlreiche Studien haben gezeigt, dass hohe oder toxischen Mengen von rekombinantem oligomeren Aß 1-42 entlocken neuronalen Tod, synaptic Dystrophie, Verlust und Funktionsstörung; sowie Lern- und Gedächtnisdefizite 1-4. Hirnregionen betroffen sind der Hippocampus, die Rinde, und subkortikalen Strukturen wie dem basalen Vorderhirns und der Amygdala 5,6. Bis heute gibt es mehrere transgene Mausmodelle, die den A & bgr; 1-42 Pathologie von AD zu simulieren versucht. Je nach Belastung diese Tiere als nützlich erweisen bei der Prüfung wählen pathologischen Merkmale von AD zu sein. Leider mit Ausnahme von 2 transgenen Linien, APP23 und 5XFAD, diese Mäuse nie vollständig replizieren Neuronenverlust, ein wichtiger Aspekt der AD. Auch mit dem in APP23 und 5XFAD beobachtet Neuronenverlust, der neuronalen Tod Observed war subtil, altersabhängig und isoliert, um ein paar ausgewählte Regionen 7,8.
Die direkte Infusion von oligomeren Aß 1-42 in den Wildtyp-Maus Gehirn bietet eine hervorragende In-vivo-Modell, das die neuronalen Tod Aspekt amyloidopathy 1,9,10 repliziert. Im Gegensatz zu den üblicherweise verwendeten transgenen Mausmodellen die oligomere Aß 1-42 Infusions Modell ist ideal für akut erheb Aß 1-42 Ebenen in einem räumlichen und zeitlichen Weise. Der Vorteil der Verwendung von Wildtyp-Mäusen für dieses Modell vermeidet Potentialausgleich oder Nebenwirkungen von den in transgenen Mauslinien eingeführten Mutationen. Frühere Studien haben gezeigt, dass die Infusion toxischen Mengen von Aß 1-42 in den Hippocampus auslöst Neuron Tod in der Nähe der Injektionsstelle innerhalb von 1 Woche 1. Darüber hinaus, in Übereinstimmung mit der Beobachtung, dass A & bgr; 1-42 ist giftig für cholinerge Neuronen des basalen Vorderhirns 11cholinergen Neuron (BFCN) Bevölkerung, die zum Hippocampus projiziert wird 20-50% innerhalb von 7-14 Tagen folgende Beta-Amyloid-Infusion 1,10 in Mäusen verringert, so dass effektiv für die Prüfungen von isolierten neuronalen Schaltkreise im Gehirn. Da BFCN Projekt ipsilateral zu der Gyrus dentatus des Hippocampus 12, zum größten Teil Steuer- / Fahrzeug und oligomeren A & bgr; 1-42-Lösungen können auf jeder Seite des Gehirns erlaubt Vergleiche zwischen den linken und rechten Hemisphären 1 erfolgen injiziert werden.
In diesem Bericht werden wir eine detaillierte chirurgische und Einspritzmethode für Erwachsenen-Wildtyp C57BL / 6J-Mäusen. Dieser Mausstamm ist wegen seiner breiten Einsatz in der Forschung ausgewählt. Technisch gesehen kann jeder Hirnregion Infusionsrichtet sein, aber hier werden wir den Gyrus dentatus des Hippocampus als Ziel verwenden, um die Technik zu veranschaulichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um eine erfolgreiche Aß 1-42 Injektion erreichen der Experimentator oder Chirurg muss: 1) Verwenden Sie aseptische Technik; 2) richtig das Gehirn Region von Interesse mit genauen Koordinaten zu identifizieren; 3) in der Lage sein, um die Maus richtig zu sichern in der stereotaktischen Rahmen mit dem Gehirn in den AP und ML-Achse nivelliert; 4) die Fähigkeit, den Mikromanipulator mit Präzision zu arbeiten; 5) eine ordnungsgemäße post-operative Betreuung. Wenn diese Taste Schritte befolgt werden die Maus s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom Nationalen Institut für neurologische Erkrankungen und Schlaganfall unterstützt gewähren NS081333 (CMT), Alzheimer-Gesellschaft Zuschuss nirgens-10-171721 und National Institute of Mental Health Zuschuss MH096702 (bis UH) und National Institute on Aging geförderte Alzheimer-Forschung Center an der Columbia University Pilot Zuschuss AG008702 (bis YYJ und JB).
Materials
| Ketamine HCl (100mg/ml) | Henry Schein Medical | 1049007 | 100 mg ketamine per 1 kg animal |
| Xylazine (20mg/ml) | Henry Schein Medical | not available | 10 mg xylazine per 1 kg animal |
| Buprenex (0.3mg/ml) | Henry Schein Medical | 1217793 | 0.1 mg buprenex per 1 kg animal |
| Aβ1-42 | David Teplow/UCLA | not available | 100 μM; This amyloid was used in the paper |
| Aβ1-42 | Bachem | H-1368 | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-80B | Can be used in place of amyloid from the Teplow lab |
| Scrambled Aβ1-42 | American Peptide | 62-0-46B | Can be used as control peptide for comparing Aβ1-42 |
| NU4 Antibody (Oligomeric Amyloid Antibody) | Gift from William Klein/Northwestern U. | not available | 1:2000 dilution |
| Anti-Amyloid Oligomeric Antibody (Polyclonal Rabbit) | EMD Millipore | AB9234 | May be used in place of Nu4; needs to be tested by the end user |
| 6E10 Antibody (Monoclonal Mouse) (Amyloid Antibody) | Biolegend | sig-39320 | 1:1000 dilution |
| ChAT Antibody (Polyclonal Goat) | Millipore | AB144P | 1:100 dilution |
| DeadEnd Fluorometric TUNEL system | Promega | G3250 | Follow manufacturer's directions for use |
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | Use when coverslipping slides |
| Fluorogold | Fluorochrome, LLC | not available | 2% solution |
| Absolute Ethanol (200 proof) | Fisher Scientific | BP2818-4 | For making 70% ethanol for sanitizing and disinfecting |
| Novex 10-20% Tricine gel | Life Technologies | EC6625BOX | For separating Aβ1-42 |
| Novex Tricine SDS Running Buffer (10X) | Life Technologies | LC1675 | For running 10-20% Tricine gels |
| Novex Tris-Glycine Transfer Buffer (25X) | Life Technologies | LC3675 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| SuperSignal Western Blot Enhancer | Thermo Scientific | 46640 | For enhancing Aβ1-42 signal; follow manufacturer's protocol |
| Protran BA79 Nitrocellulose Blotting Membrane, 0.1 μm | GE Healthcare Life Sciences | 10402088 | For transferring 10-20% Tricine gels |
| Xcell SureLock Mini-Cell | Life Technologies | EI0001 | Electrophoresis aparatus for running 10-20% Tricine gels |
| GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores |
| Refresh Optive Lubricant Eye Drops | Allergan | not available | For keeping the mouse eyes moist during surgery; can be found in local pharmacy stores; Can be used in place of GenTeal |
| Betadine | Stoelting | 50998 | For sanitizing and disinfecting |
| Round/Tapered Spatula | VWR | 82027-490 | For opening animal mouth |
| Bulldog Serrefines Clamps (Jaw Dims. 9X1.6mm; Length 28mm) | Fine Science Tools | 18050-28 | Optional; For keeping scalp skin apart during injection |
| Straight Fine Scissors (Cutting edge 25mm; Length 11.5cm) | Fine Science Tools | 14060-11 | For cutting scalp |
| #3 Scalpel Handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| #11 Surgical Blade | Fine Science Tools | 10011-00 | For making scalp incision |
| Student Standard Pattern Forcep (Tip Dims. 2.5×1.5mm; Length 11.5cm) | Fine Science Tools | 91100-12 | For holding scalp closed during suturing |
| Trimmer Combo Kit | Kent Scientific | CL9990-1201 | For shaving hair |
| T/Pump Warm Water Recirculator | Kent Scientific | TP-700 | For warming animal during surgery |
| Resusable Warmining Pad (5" x 10") | Kent Scientific | TPZ-0510FEA | For attaching it to the T/Pump warm water recirculator to warm the animal during surgery |
| Cordless Micro Drill | Stoelting | 58610 | Use 0.8mm steel burrs to drill holes in the skull |
| Lab Standard Stereotaxic Instrument with Mouse & Neonatal Rat Adaptor | Stoelting | 51615 | |
| Just for Mouse Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51730 | Can use this in place of Stoelting Cat. #51615 |
| Quintessential Stereotaxic Injector | Stoelting | 53311 | |
| Dry Glass Bead Sterilizer | Stoelting | 50287 | For sterilizing stainless steel instruments |
| Sterile Surgical Drape (18" x 26") | Stoelting | 50981 | |
| Hamilton Syringe 50 ml, Model 705 RN SYR, NDL | Hamilton Company | 7637-01 | For brain injection; use different syringes for different solutions |
| 29 Gauge Needle, Small Hub RN NDL | Hamilton Company | 7803-06 | For attaching to the Hamilton syringe for brain injection |
| 1 ml BD Tuberculin Syringes | VWR | BD309659 | For administering anesthesia and saline |
| 30 Gauge Needle (0.5") | VWR | BD305106 | For administering anesthesia and saline |
| Portable Electronic CS Series Scale (Ohaus) | VWR | 65500-202 | For weighing animals to determine anesthesia dose |
| Hot plate (Top Plate Dims. 7.25×7.25in) | VWR | 47751-148 | For warming animals post-surgery |
| Sofsilk Silk Suture C-1 Cutting 3/8, 12 mm | Covidien | S1173 | For closing wound |
| Vetbond Tissue Adhesive (3M) | Santa Cruz Biotechnology | sc-361931 | Optional: for aiding in wound closure; Use with suture. |
| Cotton-Tipped Wooden-Shaft Sterile Applicators | Fisher scientific | 22-029-488 | For cleaning and drying surgical wound |
| Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | For collecting brain sections |
| VWR Micro Cover Glass 24 X 50 mm | VWR | 48393241 | For mounting microscope slides |
| Thermo Scientific Nalgene Syringe Filter 0.2 μm | Fisher Scientific | 194-2520 | For sterilizing saline solution |
| Sterile dual tip skin markers by Viscot Medical | Medline | VIS1422SRL91 | For marking coordinates on the skull |
Referências
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