8 gün yaşlı bir fare Sinir retina% 4 jelatin bloğunun üstünde olduğunu. Vibratome ile fotoreseptör tabakası (200 um), izole edildikten sonra, fotoreseptör kültür mekanik ve enzimatik ayrışma sonrasında tohumlanır. fotoreseptör moleküler ve biyokimyasal analizler ya da transplantasyon için kullanılabilir.
Retina ışığın yönünü dikkate retina en uzak kısmında retina pigmente epitel ile, fotoreseptör gelen katmanlar nöronlar ile temas halinde her iki çubuklar ve koniler mimarisi düzenledi santral sinir sisteminin bir parçasıdır ve En yakın mesafe ganglion hücreleri. Bu mimari vibratome kesit tarafından fotoreseptör tabakasının ayrılmasına izin verir. 8 gün yaşlı bir fare disseke nöral retina düz gömülü aşağı bakacak% 20 jelatin fotoreseptör tabakasının bir dilimin üstüne% 4 jelatin. Bir Vibratome ve iki ucu keskin jilet kullanarak, 100 mikron kalınlığında iç retina kesilir. Bu bölüm, gangliyon hücreleri ve özellikle iki kutuplu hücreler üzerindeki iç katman içermektedir. Fotoreseptörleri içeren dış retina 200 mikron kurtarıldı önce 15 mikron bir aracı bölümü atılır. jelatin, 37 ° C'de ısıtma ile ayrılmaktadır. Dış tabakanın adet doğmuş iyileşmesini olan37 ° C'de 20 dakika boyunca aktive edilmiş papain 2 birimleri ile Ringer çözeltisi 500 ul monte edilir. Reaksiyon Dulbecco Modifiye Edilmiş Eagle Ortamı (DMEM) içinde 500 ul% 10 fetal dana serumu (FCS) eklenerek durdurulur, DNAz I daha sonra 25 adet serum çıkarmak için oda sıcaklığında santrfuj birkaç kez yıkanır ilave edilir ve hücreler içinde tekrar süspansiyon haline getirilmiştir 500 DMEM ul / cm2, 1 x 10 5 hücre tohumlanır. in vitro olarak 5 gün büyütülür ve bunların canlılığı ölü / canlı deney kullanılarak atılır. Kültür saflığı ilk deney sırasında mikroskop altında incelenmesi ile belirlenir. saflık sonra tohumlama ve histolojik slayt üzerinde hücreleri tespit ve bir tavşan poliklonal anti-SAG, bir fotoreseptör işaretleyici ve fare monoklonal anti-RHO, bir çubuk fotoreseptör spesifik marker kullanarak analiz tarafından onaylanmıştır. Seçenek olarak ise, fotoreseptör (% 97 çubuklar) geni veya protein ifadesi analizi için ve nakli için de kullanılabilir.
Retina omurgalılar arasında korunmuş mimarisi vardır, merkezi sinir sisteminin bir parçasıdır. nöral retina nöronlar gelen ışığın, gözün arkasındaki retina pigment epiteli (RPE) ile yakın temas içinde fotoreseptör tabakası için en uzak olan, tabakalar halinde düzenlenmiştir. Çubuk ve koni photorecptors foton yakalama opsin duyarlı moleküller güveniyor ışığa duyarlı hücreler vardır. Bu moleküller, RPE 1 yönünde işaret fotoreseptör dış kesiminde bulunan, hücresel bir yapıya disk membranları üzerine sarılmaktadır. Genellikle çok erken fotoreseptör dejenerasyonlar durumlarında etkilenir bu yapı,% 10, her gün oranında yenilenir. yani söz konusu iç tabaka fotoreseptör, çift kutuplu, amakrin ve yatay hücrelerde olarak ganglion hücrelerinde alınan sinyal hesaplamak diğer nöronların çoğunu içerir. Onların akson ile bu sonOptik sinir olan bir kiriş oluşturur. Bu katman hücreleri, iç pleksiform tabakası 2 dışında bulunduğunda biyologlar vadeli yerinden amacrine hücrelerini kullandık o kadar korunmuş olduğunu. Nöronların Katmanlar radyal Müller glial hücreler bir armatürün içinde dağıtılır. Bipolar hücreler ganglion hücrelerinin fotoreseptörleri bağlantı. Bunlar, dış pleksiform katman ve iç pleksiform katman arasında yer alır. ganglion hücrelerinin iki kutuplu hücreler ile bağlantılı olarak iç pleksiform tabakasını oluşturur. amacrin hücreler iki kutuplu hücreler ve gangliyon hücreleri arasındaki iç pleksiform tabakasındaki bulunan ilişki hücre olarak adlandırılmaktadır. dış pleksiform tabakasını yatay hücreleri içerir. Merkezi sinir sisteminin nöronal tabakaların Bu yararlı düzenleme bir vibratome kullanarak düz monte retina dilme iç hücre tabakasından fotoreseptör tabakasının ayrılmasına izin verir.
Başlangıçta, bu teknik, aktarma için fotoreseptörleri izole etmek için kullanılmıştırrd1 farede insan retinitis pigmentosa (RP) 3'ün bir model göz splantation. rd1 fare çubuk-spesifik fosfodiesteraz p alt-birimi için kodlayan Pde6b geninde bir resesif mutasyonu taşır. İnsanlarda 4 RP bu gen sonucu Resesif mutasyonlar. Çubuk fotoreseptör dejenere sonra, hasta gece görüş kaybeder, ve, mutasyona uğramış gen ifade ikinci adım olarak dejenere yok şaşırtıcı koni fotoreseptör. Kozalak renkli görme ve görme keskinliği için gerekli olduğundan, hastalar giderek kör olur ve hastalık için etkili bir tedavi henüz gelişmemiştir. Vahşi tip fare, konakçı fare koni dejenerasyonu fotoreseptör tabaka aşılanmasıyla, 3,5 geciktirilir. çubuklar ve iki kutuplu hücreler arasındaki sinaptik bağlantı sadece r belirli bir aşamasında elde edilebilir, çünkü rod-koni dejeneratif modelinde kayıp çubuklar nakli ile ikame edilmiş olabilirNRL ifade 6 başlangıcı ile işaretlenmiş etinal gelişme. Fotoreseptörlerin tabakası RPE ve fotoreseptör kalan, koni sadece% 3 tekabül dış retina arasında, çubuk-az rd1 retinanın alt-retinal cerrahi alanda tarafından tanıtıldı. İki hafta ameliyat sonrası, normal bir fotoreseptör tabakası ile nakledilen hayvandan koni% 40, ya da sahte-işletilen hayvan iç retina hücrelerinin normal bir tabaka ile nakledilen hayvan kıyasla hayatta. koni hayatta kalma topografisi, yayılmış, aşılanmış dokunun pozisyonunda bulunan mutasyona uğramış retinanın, tüm yüzey üzerinde bir koruyucu etki yayılabilir molekül 7 bağlı olduğunu gösterir.
Sonra, koruyucu etkisi çubuklar 8,9 ile proteinin sekresyonunu alır hale geldiğini doğrulamak için, bir ko-kültür sistemi olarak koşullandırılmış kültür ortamları kullanmışlardır. Biz bu proteinin expre olacağını varsayımındaolmayan bir hücre özerk bir şekilde 10 çubuklar koruyucu sinyal kaybı ile ikincil koni dejenerasyon tetikleyecek hastalığın ilk aşamasında kendi ölüm çubuklar tarafından ve sürekli ve özellikle popülasyonunda ifade. Çünkü primatlarda koni aracılı merkezi görme önemi bu varsayılan protein RP için son derece alakalı tedavi aracı olacaktır. RP konileri korunması teorik 11 kör olmak, dünya çapında 1,5 milyon hastanın toplam önleyecektir. Bir retina cDNA kütüphanesinden 12 Çubuk türetilmiş Koni Canlılık Faktörü (RdCVF) kodlayan bir cDNA'nın belirlenmesi için yüksek içerik tarama yaklaşımı ve bir koni zenginleştirilmiş kültür modeli kullandık. RdCVF, ilginç bir şekilde, redoks homeostazı 13 yer alan, söz konusu tioredoksin proteinleri için kodlayan genin homolog olan NXNL1 geninin splayslanmış ürünüdür. genin ikinci eklenmiş bir ürün RdCVFL hedefine oksidatif d karşı Tau proteini koruyan bir enzimdir14 Amage. RdCVF İdaresi koni ikincil dejenerasyonu ve bir resesif onların görme fonksiyonunun kaybı ve RP 12,15 baskın modelini önler. Bu, yenilikçi tedavi stratejisinin 16 iki önemli yönlerini gösterir. İlk olarak, bir gen, bağımsız bir şekilde, RP vakaların çoğunda uygulanabilir. İkincisi, rekabet faktörü aksine CNTF, RdCVF sağkalım görme fonksiyonunun 17 bakım ile ilişkilidir. Fonksiyonel etkisinin olmaması RP hastalara 18 CNTF'nin yönetiminin klinik yarar yokluğu nedeni açıklayabilir. RdCVF in vitro koni kurtarma RdCVF bağışıklık sistemindeki 12 inhibe beri çubuk ve koni arasındaki önemli yaşam sinyalinin bir büyük olasılıkla. Buna ek olarak, çubuk-türevli koni canlılığı geninin bozulması, oksidatif stres 19 disfonksiyon ve duyarlılık fotoseptör yol açar.
kullanımıfotoreseptör tabakası RdCVF belirlenmesi kökeni ve nörodejeneratif hastalıklar 20 katılan yeni redoks sinyali olduğunu. Bu yazıda izole etmek ve fotoreseptör tabakadan kültür hücreleri RdCVF bölgesinin aktivitesinin karakterize edilmesi için kullanılan bir protokol açıklar. fotoreseptör 5-7 gün 21 kültür içinde muhafaza edilebilir. Bu teknik aynı zamanda fotoreseptör spesifik genlerin ekspresyonunu incelemek için kullanılabilir.
Retina biyoloji bir model organdır. Retinanın incelenmesi biyoloji 6 büyük keşiflere yol açtı. İlk tümör baskılayıcı gen RB1 kökeni yer almaktadır. Bu sevenless Oğlu ile etkileşim yoluyla reseptör tirozin kinaz ve MAP kinazlar arasındaki moleküler bağlantıyı ortaya koymaktadır. Bu Pax6, organ morfogenezisi ilk ana kontrol genin bulunmasından yer aldı. Bu, yaşa bağlı makula dejenerasyonu (YBMD) ile Kompleman faktör H (CFH'lik) genetik dernek merkezinde genom dernek ekranında (GWAS) tarafından tanımlanan ilk hastalık yatkınlık geni olduğunu. Son olarak, Leber konjenital amaurosis için ilk başarılı gen tedavisi neden, herhangi bir insan ilk düzeltici gen terapisi deneme hastalığı kalıtsal. bu organ yapısı çoğu omurgalı türünde muhafaza edilir. In vivo manipülasyon için onun erişilebilirlik yüzde bu parçası üzerinde fonksiyonel genomik soruşturmalar erken teşvik etmiştirSinir sistemini ral.
Biz vibratome kesit ile retinanın iç tabakasından fotoreseptör tabakasını ayırmak nasıl burada göstermek. Bu adım, saf fotoreseptör kültürleri elde etmek çok önemlidir. Bizim diseksiyon protokolü RPE hücreleri tarafından kontaminasyon çok olası hale getirir.
Büyük zorluklardan biri bölümüne doğru iç ve dış retina gerekli olan retinanın düzleşme olduğunu. retinanın kesit kemirgenler gibi küçük çaplı retina iyi ve bu çap güncel mevcut malzeme ile teknik bir kısıtlamadır.
Retina bir örnek üzerinde uygulama için, biyolojik olarak anlamlı bir deney başlamadan önce önerilir. Bu mRNA ve protein, her iki ekspresyon çalışma yapmak üzere malzeme kullanılarak, kültürlenmiş fotoreseptör hücrelerinin elde edilen temsili sonuçlar yöntemini açıklamaktadır. İfade çalışmaları da sezeryan üzerinde alternatif olarak yapılabilirns lazer yakalama mikro-kesim ile elde edilen, ama kültürleri en vibratome kesitlerinin kullanılarak gerçekleştirilir. Biz tam bir farklı strateji ile mikrodiseksiyon lazer tekniği kullanılmış olabilir. Ama, kültür için mikrodiseksiyon aparatı ile fotoreseptör tabakası toplamak, bu fiksatif önlemek için gerekli olacak ve bu anlamlı mevcut metodoloji karmaşık hale olacaktır.
Biz retinitis pigmentosa modellerinde fotoreseptör dejenerasyonu sırasında vibratome bölümlerde gen ve protein ifade kinetik incelemeyi amaçlayan bir protokol geliştiriyoruz. Biz protokol ayrıntılı açıklaması retina biyoloji alanındaki araştırmacılara yararlı olabilir, ve en başta proteomik ve metabolomic çalışmalar için inanıyoruz.
The authors have nothing to disclose.
Igal Gery and David Hicks for anti-SAG antibodies. Ram Fridlich for reading the manuscript.
Name of Material / Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Cytidine 5′-diphosphocholin* | Sigma-Aldrich | C0256 | 4.7 µM Cytidine 5′-diphosphocholin |
Cytidine 5′-diphosphoethanolamine* | Sigma-Aldrich | C0456 | 2.7 µM Cytidine 5′-diphosphoethanolamine |
Linoleïc acid/ bovine serum albumin (BSA)* | Sigma-Aldrich | L8384 | 100 µg/ml linoleïc acid/ bovine serum albumin (BSA) |
Triiodo-L-thyronine* | Sigma-Aldrich | T6397 | 0.03 µM Triiodo-L-thyronine |
96-wells plate | Greiner bio-one | 655-095 | |
Binocular microscope | Leica | MZ-75 | |
CO2 independent (CO2-i) | Life Technologies | 18045054 | |
DMEM | Life Technologies | 41966029 | |
Forceps n°5 Dumont | Bionic | 11254-20 | |
Gelatin from porcin skin type A | Sigma-Aldrich | G2500 | |
GeneChip | Affymetrix | U74v2 | |
Gentamicin solution | Life Technologies | 15710049 | |
Hydrocortison* | Sigma-Aldrich | H0888 | 0.55 µM hydrocortison |
Insulin* (I) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.86 µM insulin (I) |
Papain | Worthington-biochem | WOLS03124 | |
Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P-6407 | |
Progesterone* | Sigma-Aldrich | P7556 | 2.0 µM progesterone |
Prostaglandin* | Sigma-Aldrich | P5172 | 0.28 µM prostaglandin |
Putrescine* | Sigma-Aldrich | P5780 | 182 µM putrescine |
Scalpel Albion | EMS | 72000 | |
Scissor | Moria | 15396-00 | |
Sodium Pyruvate* | Sigma-Aldrich | S8636 | 1 mM sodium pyruvate |
Sodium Selenite* (S) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.29 µM Na2SeO3 (S) |
Taurine* | Sigma-Aldrich | T8691 | 3 mM taurine |
Transferrin* (T) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.07 µM transferrin (T) |
Vibratome apparatus | Leica | VT1000-S | |
* Supplements |