ビブラトームセクショニングマウス網膜は、感光体文化を準備する

注：手順は大学ピエール·マリー·キュリー（CE5 / 2009/048）から倫理委員会ダーウィンによって承認されたゼラチン溶液、楽器、ビブラトーム、文化メディアと培養プレートの1.準備少なくとも1日の実験の前に20％のゼラチン溶液を準備します。 ボンネットの下では、CO 2の独立した培地を含む500ミリリットル瓶（CO 2 -i）にゲンタマイシン[10 mg / mlの]の500μlを添加する。 別のビーカー中で、15分間絶えず撹拌しながら加熱ブロック上で95℃で20 CO2-I（ ステップ1.1.1）からの溶液と熱を加える。溶液はさらなる使用のために準備ができていることを示す黄色に色の変化を観察する。 黄色の溶液を得、45分間95℃で増加攪拌および加熱しながら4ゼラチンgの上記で調製した溶液に徐々に悪い（ ステップ1.1.2）を秤量する。ゼラチン溶液は、下で冷却することを許可する約5分間のフード。 気泡を導入することなく、直径35mmの培養皿にゼラチン溶液4mlを注ぐ。 30分間21℃で料理をしてください。プラスチックフィルムで皿をカバーし、そして逆さま料理を断る。必要に応じて、使用前に最大2ヶ月間、4℃で料理を保管。 4％ゼラチン溶液を準備します。 ボンネットの下では、加熱ブロックに42℃でCO 2 -i滅菌プラスチック容器中での媒体、及び熱の25ミリリットルを追加します。加熱ブロックから培地を除去し、徐々に熱い中、撹拌にゼラチンの1グラムを追加します。素早く加熱ブロック（42℃）でコンテナを返し、処理中にそれを暖かく保つ。 設定アップビブラトーム装置： 4℃で保存し、20％ゼラチン溶液を含む皿を外し。メスでゼラチンをカット。ゼラチンスライスをフリップとsのドロップを使用しビブラトームの黒い支持ディスクに貼り付けのスーパーグルー。 半分にカミソリの刃をブレークし、ビブラトーム保持容器に半分を挿入します。ビブラトーム装置上に黒のサポートディスクを挿入します。右側に黒いノブをオンにします。ビブラトームの頭の上に保持レセプタクルを修正。ゼラチンブロックをカバーするためにビブラトーム槽にCO 2 -i媒体の十分な量を加える。 ビブラトームに切り替えて、ゼラチンブロックの3100μmのスライスをカット。さらに使用するためのゼラチンブロックしてください。 培養液の40ミリリットルを準備します。 ボンネットの下にウシ胎児血清（FCS）の10％ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を準備します。リン酸緩衝生理食塩水（PBS）pH7.4のを使用して、1mg / mlのポリ-D-リジンを調製する。 96ウェルプレートにコートしたウェルの底部をポリ-D-リジンを2μg/ cm 2で加える。 5％CO 2インキュベーター内で37℃で45分間静置します。インキュベーション後、PBSを除去し、200μlと交換/ウェルのDMEMおよび使用する前に、5％CO 2インキュベーター中、37℃で再び配置します。 網膜全体の2解剖マウスを脱核： 欧州指令63分の2010に従ってマウスを生け贄に捧げる：頸椎脱臼により。湾曲した-はさみで頭をカットし、消毒剤で目を消毒した後に100ミリメートルの直径のペトリ皿に入れてください。 非常に慎重に湾曲したグリップを使用して、それを区画することにより視神経を切り離した後に目を削除します。その後、21℃で滅菌したCO 2 -i培地を含む35ミリメートルペトリ皿に両眼を置く。 網膜を削除する： 眼の地球儀にハサミを導入することができるように18 G針の助けを借りて、目の四肢のレベルで穴を作る。穴の内側ストレートはさみを紹介し、慎重に毛様体を除去するための眼球のすべての周囲にアイリス下の強膜をカット。 <li>角膜とレンズを取り外し、強膜に網膜の連続で目の房を保つ。 2細かいグリップを、網膜を損傷することなく、後部室内に位置して硝子体を除去する。網膜の平坦化を可能にするために4ラジアルカット（網膜/強膜）を実行します。 眼球を好転と「オレンジ」としてそれをはがします。強膜と網膜色素上皮（RPE）から網膜を切り離します。まだ細かい曲面ハサミで非常に慎重に視神経のレベルで添付の網膜を切り離します。 2細かいグリップと網膜の中心に向かって周囲から残りの硝子を外します。すべての硝子体が網膜の平坦化を可能にする完全に除去されていることを確認してください。 プラスチックピペットの先端をカットし、プラスチックピペットとCO 2 -i培地を含む直径35mmのペトリ皿に網膜を転送する。 フラットmounte 3.シールゼラチンブロックの上にD網膜フラットマウント型網膜のシールを可能にするために（ゼラチンブロックは無料です）ビブラトームタンクからのCO 2 -i培地30ml – 20を削除します。 プラスチックピペットを用いてガラススライドに網膜を転送し、感光体がゼラチンスライスを下に向けた状態でゼラチンスライスに転送する前に、CO 2 -i媒体のドロップを追加。 優しく網膜とゼラチンブロックと同時に反対側の温かいゼラチンを排出する間のブロックの片側に4％のゼラチンを温め注入することにより、ゼラチンブロックに網膜を取り付けます。 パスツールピペットで吸引し、4％のゼラチン。合計シーリングを可能にするために10分間待ちます。完全にブロックし、ブレードを浸漬することがCO 2 -iメディアを追加します。 4.網膜をセクショニング注：このステップは、他の網膜細胞なし視細胞の層を得るために重要である（ 図1）。 ゼラチンブロックの上から順に、網膜に到達するために100μmの連続切片をカット。内層の120μmのセクション – その後、100を切った。用途に応じて、この層は廃棄してもよいし、液体窒素中で保存した。ビブラトームの速度が内側の層または光受容体層の切片中に（1または2で）非常に遅いことを確認してください。 内側と外側の網膜の間のインタフェースに対応する網膜の中間15μmのセクションを実行します。顕微鏡下でこのセクションを確認します。血管が存在しないことは、網膜の外側に達したことを示す。 ゼラチンと外側の網膜の200ミクロン（光受容体層）をカットし、それをCO 2 -i培地3mlで満たされた直径35mmの皿に移す。すべての網膜のすべての光受容体層部分が得られるまで氷の上に保管してください。 5.解離光受容細胞 （ディッシュを取る複数の）光受容体層（複数可）を含有し、10分間37℃のインキュベーター中でそれ（それら）を置く。 鉗子を使用すると、静かにゼラチンから光受容体層を分離し、リンゲル液の3ミリリットルで満たされた新しい皿にそれを転送する。各光受容体層の製造のために、この段階（5.2）を繰り返します。 5ミリリットルのポリプロピレン、滅菌チューブに、5％CO 2インキュベーター内で37℃で、それを30分間インキュベート活性剤溶液の25μL（60μMのβメルカプトエタノール; 5.5 mMのL-システイン1.1 mMのEDTA）とパパインの2台をインキュベート。パパインの活性化は、37℃で達成される。このインキュベーションの間、2ミリメートル2枚（ 小さ ​​すぎない ）に光受容体層をカットし、5ミリリットルチューブにこれらの作品を移す。 重力沈降に続くソリューションリンゲル液の1.5ミリリットルで二回網膜をすすぐ。検体とチューブから残りのすべてのリンゲル液を除去します。 活性化したパパインとミックスを含むチューブにリンゲル液の475を添加する。網膜を含むチューブにこのソリューションを追加します。 5％CO 2インキュベーター内で37℃で20分間網膜にチューブをインキュベートします。 DMEM、10％FCSを1 ml添加することにより反応を停止する。死細胞からDNAを消化するためにデオキシリボヌクレアーゼの25 U I（DNアーゼI）を追加します。注意深くた1mlピペットを用いて細胞懸濁液を均質化する。 RTで6分間50×gでスピン。 血清の痕跡を除去し、細胞ペレットに（特定reagents_equipmentの表を参照してください）​​サプリメントを含むDMEM培地を追加し、慎重に1ミリリットルピペットで細胞懸濁液を再懸濁し、上清を捨てる。 RTで6分間50×gでスピン。この工程（5.7）をもう一度繰り返します。 6培養視細胞 PN8でのマウスの光受容体層は、この技術を使用して約1から1500000の細胞が含まれています。 1における光受容体細胞を播種×10 5細胞/培地および培養を5％CO 2インキュベーター内で37℃で5日間、細胞と培養プレート中cm 2である 。 5日目に、免疫化学及び抗体サプライヤーが提供してウエスタンブロット法の研究は、次の方法に進みます。 注：文化と予備試験を停止する手順は、参照21に記載されている。