Vibratome باجتزاء شبكية العين الفأر لإعداد الثقافات مبصرة
Summary
الشبكية العصبية على فأرة الحاسوب الذين تتراوح أعمارهم بين 8 أيام هي على رأس 4٪ كتلة الجيلاتين. بعد عزل طبقة مبصرة (200 ميكرون) من خلال vibratome، هي المصنفة مبصرات بعد التفكك الميكانيكية والأنزيمية للثقافة. طبقة مستقبلة للضوء يمكن استخدامها لالجزيئية، التحاليل البيوكيميائية أو الزرع.
Abstract
شبكية العين هي جزء من الجهاز العصبي المركزي الذي نظم الهندسة المعمارية، مع الخلايا العصبية في طبقات من خلايا مستقبلة للضوء، سواء قضبان ومخاريط في اتصال مع ظهارة الصباغية الشبكية في الجزء الأكثر البعيد على الشبكية النظر في اتجاه الضوء، و خلايا العقدة في المسافة أكثر الداني. هذه العمارة تسمح للعزل طبقة مبصرة من قبل vibratome باجتزاء. الشبكية العصبية تشريح على فأرة الحاسوب الذين تتراوح أعمارهم بين 8 أيام هي مسطحة جزءا لا يتجزأ من 4٪ الجيلاتين على رأس شريحة من 20٪ الجيلاتين طبقة مبصرة أسفل. باستخدام vibratome وشفرة حلاقة ذو حدين، هو مقطوع شبكية العين الداخلية سميكة 100 ميكرون. يحتوي هذا القسم على خلايا العقدة والطبقة الداخلية مع اسيما الخلايا القطبين. يتم تجاهل قسم سيط من 15 ميكرون قبل أن يتم استردادها 200 ميكرون من شبكية العين الخارجية التي تحتوي على المستقبلات الضوئية. تتم إزالة الجيلاتين عن طريق التسخين عند 37 درجة مئوية. قطعة من الطبقة الخارجية هي incubaتيد في 500 ميكرولتر من محلول رينغر مع 2 وحدات من غراء تفعيلها لمدة 20 دقيقة عند 37 ° C. توقف رد الفعل من خلال إضافة 500 ميكرولتر 10٪ مصل العجل الجنين (FCS) في Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM)، يضاف بعد ذلك 25 وحدة من الدناز I قبل الطرد المركزي في RT، وغسلها عدة مرات لإزالة المصل ومعلق الخلايا في 500 ميكرولتر من DMEM والمصنف في 1 × 10 5 خلية / سم 2. وتزرع الخلايا إلى 5 أيام في المختبر، وسجل الجدوى الخاصة بهم باستخدام الحية / الفحص ميت. يتم تحديد نقاء الثقافة لأول مرة عن طريق الملاحظة المجهرية أثناء التجربة. ثم يتم التحقق من صحة الطهارة من البذر وتحديد الخلايا على شريحة نسيجية وتحليلها باستخدام بولكلونل الأرنب مكافحة SAG، علامة مبصرة والفأر وحيدة النسيلة المضادة للRHO، علامة محددة قضيب مبصرة. بدلا من ذلك، طبقة مبصرة (97٪ قضبان) يمكن استخدامها لتحليل الجينات أو البروتين التعبير وللزرع.
Introduction
شبكية العين هي جزء لا يتجزأ من النظام العصبي المركزي والتي لديها بنية الحفظ بين الفقاريات. ويتم تنظيم الخلايا العصبية للشبكية العصبية في طبقات، مع الأكثر بعدا عن الضوء الساقط، وطبقة مبصرة على اتصال وثيق مع ظهارة الصباغية الشبكية (RPE) في الجزء الخلفي من العين. قضيب ومخروط photorecptors هي خلايا حساسة الخفيفة التي تعتمد على جزيئات الحساسة أوبسين لالتقاط الفوتون. يتم تضمين هذه الجزيئات على الأغشية القرص هيكل الخلوي، وتقع على الجزء الخارجي من مستقبلة للضوء الذي يشير في اتجاه RPE 1. ويتم تجديد هذا الهيكل، والتي غالبا ما تتأثر في حالات الإنحطاط مبصرة في وقت مبكر جدا، بمعدل 10٪ كل يوم. ما يسمى الطبقة الداخلية تحتوي معظم الخلايا العصبية الأخرى التي حساب إشارة وردت من المستقبلات الضوئية، والقطبين، عديم الاستطالات والخلايا الأفقية وكذلك خلايا العقدة. هذه الأخيرة مع محاور لهاتشكيل شعاع وهو العصب البصري. هذه الطبقات هي الحفظ بحيث علماء الأحياء ويستخدم هذا المصطلح النازحين خلايا عديم الاستطالات عندما يتم العثور على الخلايا خارج الطبقة الداخلية ضفيري 2. ويتم توزيع طبقات من الخلايا العصبية داخل المحرك من الخلايا الدبقية شعاعي مولر. خلايا المستقبلات الضوئية بين القطبين تصل إلى خلايا العقدة. فهي تقع بين طبقة ضفيري الخارجية وطبقة ضفيري الداخلية. الخلايا العقدية تشكل طبقة ضفيري الداخلية في اتصال مع خلايا القطبين. تتم تسمية الخلايا كخلايا amacrin جمعية الموجود في الطبقة الداخلية ضفيري بين الخلايا القطبين والخلايا العقدية. طبقة ضفيري الخارجي يحتوي على خلايا الأفقية. هذا الترتيب الفريد من طبقات الخلايا العصبية في الجهاز العصبي المركزي يسمح عزل طبقة مبصرة من طبقة الخلايا الداخلية تشريح شبكية العين مسطحة شنت باستخدام vibratome من قبل.
في الأصل، تم استخدام هذه التقنية لعزل خلايا مستقبلة للضوء لترانsplantation في عين الماوس RD1، وهذا نموذج من التهاب الشبكية الصباغي البشري (RP) 3. الماوس RD1 يحمل طفرة المتنحية في الجينات Pde6b الذي يشفر للقضيب محددة فسفودايستراز بيتا فرعية. الطفرات المتنحية من هذه النتيجة الجينات في RP في البشر (4). بعد أن تحولت مبصرات قضيب، والمريض يفقد الرؤية الليلية، ومبصرات مخروطية من المستغرب، والتي لا تعبر عن الجين المتحور، تتحول كخطوة ثانية. لأن يطلب من المخاريط للرؤية اللون والبصر، والمرضى بالعمى تدريجيا وعلاج فعال لهذا المرض لم تضع حتى الان. عن طريق تطعيم طبقة مستقبلة للضوء من النوع البري الماوس انحطاط مخروط من الفأرة المضيف تأخر 3،5. قضبان خسر في نموذج التنكسية قضيب مخروط لا يمكن الاستعاضة عن زرع لأن الاتصال متشابك بين قضبان وخلايا القطبين لا يمكن الحصول عليها في مرحلة معينة من صتطوير etinal، والتي تمثلت في ظهور المختبر الوطني المرجعي التعبير 6. هو عرض طبقة من خلايا مستقبلة للضوء عن طريق الجراحة في الفضاء شبه الشبكية الشبكية RD1 قضيب أقل، وبين RPE والشبكية الخارجية الموافق 3٪ فقط من المستقبلات الضوئية المتبقية، المخاريط. بعد أسبوعين من الجراحة، و 40٪ من المخاريط من الحيوان المزروعة مع طبقة مبصرة العادية نجا بالمقارنة مع الحيوان المزروعة مع طبقة طبيعية من الخلايا الداخلية الشبكية، أو للحيوان الشام التي تديرها. تضاريس بقاء مخروط،-موزعة على كامل سطح الشبكية تحور تقع في موقف الأنسجة المطعمة يشير إلى أن التأثير الوقائي يرجع إلى جزيء إنتشاري 7.
وبعد ذلك، استخدمنا نظام المشاركة في الثقافة وكذلك وسائل الإعلام ثقافة مشروطة للتحقق من صحة حقيقة أن تأثير وقائي يعتمد على إفراز بروتين عن طريق قضبان 8،9. ونحن نفترض أن هذا البروتين سوف EXPRإسيد بشكل مستمر وتحديدا من قبل قضبان وأن وفاتهم خلال المرحلة الأولى من المرض سوف يؤدي التنكس مخروط الثانوي بحلول فقدان إشارة وقائية من قضبان في غير الخلية بطريقة مستقلة 10. ونظرا لأهمية مخروط بوساطة الرؤية المركزية في الرئيسيات هذا البروتين المفترض سيكون أداة علاجية ذات الصلة للغاية لRP. ان الحفاظ على المخاريط في RP منع نظريا ما مجموعه 1.5 مليون مريض في جميع أنحاء العالم ليصبح أعمى 11. وقد استخدمنا منهج فحص محتوى عالية ونموذجا ثقافة التخصيب مخروط لتحديد [كدنا ترميز رود المستمدة من المخروط الجدوى عامل (RdCVF) من مكتبة [كدنا الشبكية 12. RdCVF هو نتاج تقسم من الجينات التي NXNL1، هو المثير للاهتمام مثلي لترميز الجين للبروتينات thioredoxin المشاركة في الأكسدة التوازن (13). المنتج تقسم الثاني من هذا الجين، RdCVFL هو انزيم يحمي هدفها، البروتين جامعة تل ابيب ضد الأكسدة دamage 14. إدارة RdCVF يمنع الضمور الثانوي من المخاريط وفقدان وظيفتها البصرية في المتنحية، والنموذج السائد للRP 12،15. وهذا يدل على اثنين من الجوانب الهامة لهذه الاستراتيجية العلاجية المبتكرة 16. أولا، يمكن تطبيقه في معظم الحالات RP بطريقة الجينات مستقل. ثانيا، يرتبط يتعارض مع عامل المنافسة بقاء CNTF، RdCVF مع الحفاظ على وظيفة البصرية 17. غياب تأثير وظيفي قد يفسر سبب غياب فائدة سريرية من إدارة CNTF للمرضى RP 18. هو على الأرجح واحدة من إشارة بقاء هامة بين قضبان ومخاريط لأن مستعمل الإنقاذ مخروط في المختبر عن طريق RdCVF immunodepletion 12 RdCVF. وبالإضافة إلى ذلك، تعطل جدوى مخروط الجينات المستمدة قضيب يؤدي إلى خلل وظيفي مبصرة والقابلية للالاكسدة 19.
استخدامطبقة مستقبلة للضوء هي في أصل تحديد RdCVF وإشارة الأكسدة جديدة تشارك في أمراض الاعصاب 20. توضح هذه المخطوطة البروتوكول المستخدم لعزل والخلايا الثقافة من طبقة مبصرة لتوصيف نشاط RdCVF. يمكن الحفاظ على المستقبلات الضوئية في الثقافة لمدة 5 إلى 7 أيام 21. ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية لدراسة التعبير عن جينات محددة مستقبلة للضوء.
Protocol
Representative Results
Discussion
شبكية العين هي جهاز نموذج في علم الأحياء. دراسة الشبكية أدت إلى 6 اكتشافات كبيرة في علم الأحياء. وهو في الأصل من الورم الأول RB1 القامع الجين. ويكشف الارتباط الجزيئي بين تحركات التيروزين المستقبلة وتحركات MAP من خلال التفاعل مع ابن sevenless. وشارك في اكتشاف PAX6، أول الجين التحكم الرئيسية لالتشكل الجهاز. وهو في مركز الجمعية الوراثية للعامل تكملة H (CFH) مع الضمور البقعي المرتبط بالعمر (AMD)، وأول جين قابلية المرض التي حددها الشاشة الجينوم جمعية اسعة (GWAS). وأخيرا، أدى ذلك إلى أول العلاج الجيني لمرض فقد البصر الخلقية، أول التصحيحية محاكمة العلاج الجيني في الإنسان من أي رثت المرض. والحفاظ على هيكل هذا الجهاز في معظم أنواع الفقاريات. وقد شجع إمكانية الحصول عليها للتلاعب في الجسم الحي في وقت مبكر يوم الجينوم التحقيقات وظيفية على هذا جزءا لا يتجزأ من المائةراؤول الجهاز العصبي.
نعرض هنا كيفية فصل طبقة مبصرة من الطبقة الداخلية للشبكية عن طريق vibratome باجتزاء. هذه الخطوة أمر بالغ الأهمية للحصول على الثقافات مبصرة نقية. بروتوكول تشريح لدينا يجعل التلوث من الخلايا RPE المستبعد جدا.
واحدة من التحديات الكبرى هو تسطيح للشبكية ما هو ضروري لقسم صحيح الداخلي وشبكية العين الخارجي. وباجتزاء من شبكية العين هو الأفضل على شبكية العين مع القطر الصغير مثل تلك من القوارض وهذا القطر هو وجود قيود على تقنية مع المواد المتاحة حاليا.
فإنه من المستحسن قبل البدء في تجربة ذات مغزى من الناحية البيولوجية، وممارسة على عينة من شبكية العين. نحن لتوضيح الطريقة التي تم الحصول عليها من نتائج ممثلة خلايا مستقبلة للضوء مثقف، وذلك باستخدام مواد لإجراء دراسة التعبير عن كلا من mRNAs والبروتينات. ويمكن أيضا أن يؤديها دراسات التعبير بدلا من ذلك على التقطيعةنانوثانية التي حصلت عليها ملقط ليزر، ولكن يتم تنفيذ الثقافات أفضل باستخدام vibratome باجتزاء. نحن يمكن أن تستخدم تقنية الليزر تسليخ مجهري مع استراتيجية كاملة مختلفة. ولكن، لجمع طبقة مستقبلة للضوء مع جهاز تسليخ مجهري للثقافة، فإنه سيكون من الضروري تجنب تثبيتي، وهذا من شأنه تعقيد المنهجية الحالية بشكل كبير.
نحن نعمل على تطوير بروتوكول يهدف إلى دراسة حركية الجينات والبروتينات التعبير في vibratome أقسام أثناء انحطاط خلايا مستقبلة للضوء في نماذج من التهاب الشبكية الصباغي. ونحن نعتقد أن وصف تفصيلي للبروتوكول مفيدا الباحثين في مجال علم الأحياء في شبكية العين، وعلى الأخص للدراسات البروتين وmetabolomic.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Igal Gery and David Hicks for anti-SAG antibodies. Ram Fridlich for reading the manuscript.
Materials
| Name of Material / Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Cytidine 5′-diphosphocholin* | Sigma-Aldrich | C0256 | 4.7 µM Cytidine 5′-diphosphocholin |
| Cytidine 5′-diphosphoethanolamine* | Sigma-Aldrich | C0456 | 2.7 µM Cytidine 5′-diphosphoethanolamine |
| Linoleïc acid/ bovine serum albumin (BSA)* | Sigma-Aldrich | L8384 | 100 µg/ml linoleïc acid/ bovine serum albumin (BSA) |
| Triiodo-L-thyronine* | Sigma-Aldrich | T6397 | 0.03 µM Triiodo-L-thyronine |
| 96-wells plate | Greiner bio-one | 655-095 | |
| Binocular microscope | Leica | MZ-75 | |
| CO2 independent (CO2-i) | Life Technologies | 18045054 | |
| DMEM | Life Technologies | 41966029 | |
| Forceps n°5 Dumont | Bionic | 11254-20 | |
| Gelatin from porcin skin type A | Sigma-Aldrich | G2500 | |
| GeneChip | Affymetrix | U74v2 | |
| Gentamicin solution | Life Technologies | 15710049 | |
| Hydrocortison* | Sigma-Aldrich | H0888 | 0.55 µM hydrocortison |
| Insulin* (I) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.86 µM insulin (I) |
| Papain | Worthington-biochem | WOLS03124 | |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P-6407 | |
| Progesterone* | Sigma-Aldrich | P7556 | 2.0 µM progesterone |
| Prostaglandin* | Sigma-Aldrich | P5172 | 0.28 µM prostaglandin |
| Putrescine* | Sigma-Aldrich | P5780 | 182 µM putrescine |
| Scalpel Albion | EMS | 72000 | |
| Scissor | Moria | 15396-00 | |
| Sodium Pyruvate* | Sigma-Aldrich | S8636 | 1 mM sodium pyruvate |
| Sodium Selenite* (S) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.29 µM Na2SeO3 (S) |
| Taurine* | Sigma-Aldrich | T8691 | 3 mM taurine |
| Transferrin* (T) | Sigma-Aldrich | I1884 (ITS) | 0.07 µM transferrin (T) |
| Vibratome apparatus | Leica | VT1000-S | |
| * Supplements |
Referências
- Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. The Organization of the Retina and Visual System. Webvision. , (2014).
- Perez De Sevilla Muller, L., Shelley, J., Weiler, R. Displaced amacrine cells of the mouse retina. J Comp Neurol. 505 (2), 177-189 (2007).
- Mohand-Said, S., et al. Photoreceptor transplants increase host cone survival in the retinal degeneration (rd) mouse. Ophthalmic Res. 29 (5), 290-297 (1997).
- . RetNet, the Retinal Information Network Available from: https://sph.uth.edu/retnet (2014)
- Mohand-Said, S., Hicks, D., Dreyfus, H., Sahel, J. A. Selective transplantation of rods delays cone loss in a retinitis pigmentosa model. Arch Ophthalmol. 118 (6), 807-811 (2000).
- MacLaren, R. E., et al. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. Nature. 444 (7116), 203-207 (2006).
- Yang, Y., et al. Transplantation of photoreceptor and total neural retina preserves cone function in P23H rhodopsin transgenic rat. PLoS One. 5 (10), (2010).
- Mohand-Said, S., et al. Normal retina releases a diffusible factor stimulating cone survival in the retinal degeneration mouse. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (14), 8357-8362 (1998).
- Fintz, A. C., et al. Partial characterization of retina-derived cone neuroprotection in two culture models of photoreceptor degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (2), 818-825 (2003).
- Cronin, T., Leveillard, T., Sahel, J. A. Retinal degenerations: from cell signaling to cell therapy; pre-clinical and clinical issues. Curr Gene Ther. 7 (2), 121-129 (2007).
- Wright, A. F. A searchlight through the fog. Nat Genet. 17 (2), 132-134 (1997).
- Leveillard, T., et al. Identification and characterization of rod-derived cone viability factor. Nat Genet. 36 (7), 755-759 (2004).
- Lillig, C. H., Holmgren, A. Thioredoxin and related molecules–from biology to health and disease. Antioxid Redox Signal. 9 (1), 25-47 (2007).
- Fridlich, R., et al. The thioredoxin-like protein rod-derived cone viability factor (RdCVFL) interacts with TAU and inhibits its phosphorylation in the retina. Mol Cell Proteomics. 8 (6), 1206-1218 (2009).
- Yang, Y., et al. Functional cone rescue by RdCVF protein in a dominant model of retinitis pigmentosa. Mol Ther. 17 (5), 787-795 (2009).
- Bennett, J. Strategies for delivery of rod-derived cone viability factor. Retina. 25 (8 Suppl), S47 (2005).
- Komaromy, A. M., et al. Transient photoreceptor deconstruction by CNTF enhances rAAV-mediated cone functional rescue in late stage CNGB3-achromatopsia. Mol Ther. 21 (6), 1131-1141 (2013).
- Birch, D. G., Weleber, R. G., Duncan, J. L., Jaffe, G. J., Tao, W. Randomized trial of ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for retinitis pigmentosa. Am J Ophthalmol. 156 (2), 283-292 (2013).
- Cronin, T., et al. The disruption of the rod-derived cone viability gene leads to photoreceptor dysfunction and susceptibility to oxidative stress. Cell Death Differ. 17 (7), 1199-1210 (2010).
- Leveillard, T., Sahel, J. A. Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling. Sci Transl Med. 2 (26), 26ps16 (2010).
- Fontaine, V., Hicks, D., Dreyfus, H. Changes in ganglioside composition of photoreceptors during postnatal maturation of the rat retina. Glycobiology. 8 (2), 183-190 (1998).
- Fontaine, V., Kinkl, N., Sahel, J., Dreyfus, H., Hicks, D. Survival of purified rat photoreceptors in vitro is stimulated directly by fibroblast growth factor-2. J Neurosci. 18 (23), 9662-9672 (1998).
- Reichman, S., et al. The homeobox gene CHX10/VSX2 regulates RdCVF promoter activity in the inner retina. Hum Mol Genet. 19 (2), 250-261 (2010).
- Sandu, C., Hicks, D., Felder-Schmittbuhl, M. P. Rat photoreceptor circadian oscillator strongly relies on lighting conditions. Eur J Neurosci. 34 (3), 507-516 (2011).
- Dorrell, M. I., Aguilar, E., Weber, C., Friedlander, M. Global gene expression analysis of the developing postnatal mouse retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (3), 1009-1019 (2004).
- Brooks, M. J., Rajasimha, H. K., Roger, J. E., Swaroop, A. Next-generation sequencing facilitates quantitative analysis of wild-type and Nrl(-/-) retinal transcriptomes. Mol Vis. 17, 3034-3054 (2011).
- Delyfer, M. N., et al. Transcriptomic analysis of human retinal surgical specimens using jouRNAI. J Vis Exp. (78), (2013).
- Ying, S., et al. A CAT reporter construct containing 277bp GNAT2 promoter and 214bp IRBP enhancer is specifically expressed by cone photoreceptor cells in transgenic mice. Curr Eye Res. 17 (8), 777-782 (1998).
