JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neurociência

Vibratome Sectioning Mouse Retina te Fotoreceptor culturen Bereid

Published: December 22, 2014
doi:
10.3791/51954
, , , , ,
1Department of Genetics,UMR_S 968, Institut de la Vision, 2Department of Visual Information,UMR_S 968, Institut de la Vision, 3Exploratory Team,UMR_S 968, Institut de la Vision, 4Sorbonne Universités, Paris 06,UMR_S 968, Institut de la Vision, 5INSERM, U968,Institut de la Vision, 6CNRS, UMR_7210,Institut de la Vision

Summary

Neurale retina van een muis 8 dagen oud is op een 4% gelatine blok. Na isolatie van de fotoreceptor laag (200 pm) door vibratome, zijn de fotoreceptoren gezaaid na mechanische en enzymatische dissociatie voor cultuur. De fotoreceptor laag kan worden gebruikt voor moleculaire, biochemische analyses of transplantatie.

Abstract

Het netvlies is een deel van het centrale zenuwstelsel die organiseert architectuur met neuronen in lagen van de fotoreceptoren, zowel staafjes en kegeltjes in contact met het retinale pigmentepitheel in het verste gedeelte van het netvlies gezien richting licht, en de ganglion cellen in de meest proximale afstand. Deze architectuur maakt het isolement van de fotoreceptor laag door vibratome snijden. De ontlede neurale retina van een muis 8 dagen oud plat ingebed in 4% gelatine op een plak van 20% gelatine fotoreceptor laag naar beneden. Met behulp van een vibratome en een tweesnijdend scheermesje, wordt de 100 micrometer dikke innerlijke netvlies coupes. Dit deel bevat de ganglioncellen en de binnenste laag met name de bipolaire cellen. Een intermediaire sectie van 15 urn wordt verwijderd vóór 200 urn van de buitenste retina bevat de fotoreceptoren gewonnen. De gelatine wordt verwijderd door verwarming bij 37 ° C. Stukken van buitenste laag zijn incubated in 500 pi van Ringer's oplossing met 2 eenheden geactiveerde papaïne gedurende 20 min bij 37 ° C. De reactie wordt gestopt door toevoeging van 500 pi 10% foetaal kalfsserum (FCS) in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), vervolgens 25 eenheden DNAse I vóór centrifugatie meerdere malen toegevoegd bij kamertemperatuur, gewassen met serum te verwijderen en de cellen worden geresuspendeerd in 500 ul DMEM en geënt bij 1 x 10 5 cellen / cm2. De cellen worden gekweekt tot 5 dagen in vitro en hun levensvatbaarheid gescoord met behulp van live / dead assay. De zuiverheid van de kweek wordt eerst bepaald door microscopische waarneming tijdens het experiment. De zuiverheid wordt vervolgens gevalideerd door zaaien en de vaststelling van cellen op een histologische glijbaan en analyseren met behulp van een konijn polyklonale anti-SAG, een foto-marker en muis monoklonaal anti-Rho, een staaf fotoreceptor specifieke marker. Alternatief kan de fotoreceptor laag (97% staafjes) worden gebruikt voor gen- of eiwitexpressie analyse en voor transplantatie.

Introduction

Het netvlies is een integraal onderdeel van het centrale zenuwstelsel die een geconserveerde architectuur bij vertebraten heeft. De neuronen van de neurale retina zijn georganiseerd in lagen, met de verst van het invallende licht, de fotoreceptor laag in nauw contact met het retinale pigmentepitheel (RPE) achter in het oog. Staafjes en kegeltjes photorecptors zijn lichtgevoelige cellen die afhankelijk zijn van opsin gevoelige moleculen voor foton capture. Deze moleculen zijn ingesloten op schijf membranen van een cellulaire structuur, op het buitenste segment van de fotoreceptor die wijst in de richting van de RPE 1. Deze structuur, die meestal heel vroeg in gevallen van fotoreceptor degeneraties wordt beïnvloed, wordt vernieuwd tegen het tarief van 10% per dag. De zogenaamde binnenlaag bevat de meeste andere neuronen die het ontvangen van de fotoreceptoren, bipolaire, amacrine en horizontale cellen alsmede de ganglioncellen signaal berekenen. Deze laatste met hun axonenvormen een balk die de oogzenuw. Deze gelaagdheid is zo geconserveerd dat biologen hebben gebruikt de term verplaatste amacrine cellen wanneer de cellen worden gevonden buiten de binnenste plexiform laag 2. Lagen van neuronen verdeeld in een armatuur radiale Müller gliacellen. Bipolaire cellen koppelen fotoreceptoren naar ganglioncellen. Ze liggen tussen de externe plexiform laag en de binnenste plexiform laag. De ganglioncellen vormen de binnenste plexiform laag in verband met de bipolaire cellen. De amacrin cellen worden genoemd als vereniging cellen in het binnenste plexiform laag tussen de bipolaire cellen en ganglioncellen. De buitenste plexiform laag bevat horizontale cellen. Deze unieke opstelling van neuronale lagen van het centrale zenuwstelsel maakt de isolatie van de fotoreceptor laag van de binnenste cellaag van het doorsnijden van de platte gemonteerd netvlies met een vibratome.

Oorspronkelijk werd deze techniek gebruikt om fotoreceptoren voor tran isolerensplantation in het oog van de RD1 muis, een model van menselijke retinitis pigmentosa (RP) 3. De RD1 muis draagt ​​een recessieve mutatie in het PDE6B gen dat codeert voor de staaf-specifieke fosfodiësterase beta-subeenheid. Recessieve mutaties van dit gen resultaat in RP bij de mens 4. Na staaf fotoreceptoren gedegenereerd, verliest de patiënt nachtzicht, en verrassend kegel fotoreceptoren, die niet uitdrukken het gemuteerde gen, ontaarden in een tweede fase. Doordat de kegels zijn vereist voor kleurenzien en gezichtsscherpte, patiënten progressief blind en een effectieve behandeling voor de ziekte is nog niet ontwikkeld. Door enten fotoreceptor laag van een wildtype muis van de conus degeneratie van de ontvangende muis vertraagd 3,5. De staven verloren in de staaf-kegel degeneratieve model kon niet worden vervangen door een transplantatie omdat de synaptische verbinding tussen staven en bipolaire cellen alleen kan worden bereikt in een specifiek stadium van retinal ontwikkeling, gekenmerkt door het begin van Nrl expressie 6. De laag fotoreceptoren wordt geïntroduceerd door chirurgie in de sub- retinale ruimte van de staafvormige minder RD1 netvlies, tussen de RPE en de buitenste retina overeenkomt met slechts 3% van de resterende fotoreceptoren, de kegels. Twee weken na de operatie, 40% van de kegels van het dier getransplanteerd met een normale fotoreceptor laag overleefde in vergelijking met de dieren getransplanteerd met een normale laag binnenste retinale cellen of de schijn-geopereerde dieren. De topografie van kegel overleving, uitgespreide over het gehele oppervlak van de gemuteerde netvlies zich ter plaatse van het geënte weefsel geeft aan dat het beschermende effect door een diffundeerbare molecule 7.

Vervolgens gebruikten we een co-kweeksysteem en geconditioneerde kweekmedia op het feit dat de beschermende werking berust op de uitscheiding van een eiwit door stangen 8,9 valideren. Onze hypothese is dat dit eiwit wordt exprgineel continu bepaald van staven en dat de dood tijdens de eerste fase van de ziekte secundaire cone degeneratie veroorzaken door het verlies van een beschermende signaal van staven in een niet-cel autonoom 10. Vanwege het belang van de kegel gemedieerde centrale visie in primaten deze vermeende eiwit zal een zeer relevant therapeutisch hulpmiddel voor RP zijn. Het behoud van de kegels in RP zou in theorie voorkomen dat een totaal van 1,5 miljoen patiënten wereldwijd te blind 11 geworden. We hebben een hoog gehalte screening aanpak en een kegel-verrijkte cultuur-model gebruikt om een cDNA dat codeert voor Rod-afgeleide Cone Viability Factor (RdCVF) van een retinale cDNA-bank 12 te identificeren. RdCVF is het gesplitste product van de NXNL1 gen dat, interessant homoloog is aan het gen voor thioredoxine eiwitten betrokken bij redox homeostase 13. Het tweede gesplitste product van het gen, RdCVFL is een enzym dat het doelwit, het tau-eiwit tegen oxidatieve d beschermtAmage 14. Toediening van RdCVF voorkomt dat de secundaire degeneratie van kegels en het verlies van hun visuele functie in een recessief en dominant model van RP 12,15. Dit toont twee belangrijke aspecten van deze vernieuwende therapeutische strategie 16. Ten eerste kan het in de meeste gevallen RP worden toegepast in een gen-onafhankelijke wijze. Ten tweede wordt in tegenstelling tot de concurrerende factor CNTF, RdCVF survival in verband met het behoud van de visuele functie 17. De afwezigheid van functioneel effect kan wegens het ontbreken van klinische voordeel van de toediening van CNTF RP 18 patiënten verklaren. RdCVF is waarschijnlijk een van de belangrijkste overlevingssignaal van staafjes en kegeltjes sinds kegel redding in vitro wordt geremd door RdCVF immunodepletie 12. Bovendien, de verstoring van de stang afgeleide levensvatbaarheid conus gen leidt tot disfunctie en gevoeligheid fotogeleider oxidatieve stress 19.

Het gebruik vanfotoreceptor laag is aan de oorsprong van de identificatie van RdCVF en van een roman redox signaal betrokken bij neurodegeneratieve ziekten 20. Dit manuscript beschrijft het protocol voor de isolatie en kweek cellen van de fotoreceptor laag om de activiteit van RdCVF karakteriseren. De fotoreceptoren kunnen in kweek worden gehandhaafd gedurende 5 tot 7 dagen 21. Deze techniek kan ook worden gebruikt om de expressie van specifieke genen te bestuderen fotoreceptor.

Protocol

OPMERKING: De procedure werd goedgekeurd door de ethische commissie van Darwin van de Universiteit Pierre en Marie Curie (CE5 / 2009/048) 1. Voorbereiding van de gelatine-oplossing, Instrumenten, Vibratome, Cultuur Media en Cultuur Plate Bereid een 20% gelatine oplossing ten minste één dag voor het experiment. Onder de motorkap, voeg 500 ul gentamycine [10 mg / ml] om een fles van 500 ml met CO2 onafhankelijk medium (CO2 -i). In een apart bekerglas, voeg 20 ml CO2-I (uit stap 1.1.1) en verwarmen bij 95 ° C op een verwarmingsblok met constant roeren gedurende 15 min. Observeer een kleurverandering naar geel, wat aangeeft dat de oplossing is klaar voor verder gebruik. Weeg 4 g gelatine en geleidelijk arm naar boven bereide oplossing (stap 1.1.2) bij verhoogde roeren en verwarmen bij 95 ° C gedurende 45 min, om een gele kleur oplossing te verkrijgen. Laat de gelatine oplossing afkoelen onderde kap ongeveer 5 minuten. Giet 4 ml van de gelatine-oplossing in een 35 mm cultuur diameter gerechten zonder dat er luchtbellen. Houd de schotel bij 21 ° C gedurende 30 min. Bedek de borden met plastic folie en zet de gerechten zijn kop. Eventueel slaan gerechten bij 4 ° C gedurende maximaal 2 maanden voor gebruik. Bereid een 4% gelatine oplossing. Onder de kap 25 ml CO2 -i medium in een steriele plastic container, en warmte bij 42 ° C op een verwarmingsblok. Verwijder het medium uit het verwarmingsblok en geleidelijk aan 1 g gelatine aan het warme medium en roer. Snel naar de container op de verwarming blok (42 ° C) en warm te houden tijdens het proces. Opzetten van de vibratome apparaat: Verwijder de vaat met 20% gelatine-oplossing bewaard bij 4 ° C. Snijd de gelatine met een scalpel. Flip de gelatine slice en plak het op de zwarte steun schijf van de vibratome behulp van een druppel super lijm. Breek een scheermesje in twee helften, en steek de ene helft in de vibratome houden bakje. Plaats de zwarte steun schijf op de vibratome apparaat. Zet de zwarte knop aan de rechterkant. Fix de holding bakje op de kop van de vibratome. Voeg een voldoende hoeveelheid CO 2 -i medium in de vibratome tank naar de gelatine blok te dekken. Schakel de vibratome en snijd drie 100 micrometer plakjes gelatine blok. Houd de gelatine blok voor verder gebruik. Bereid 40 ml kweekmedium: Bereid Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) met 10% foetaal kalfsserum (FCS) onder de motorkap. Bereid 1 mg / ml Poly-D-lysine met fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) pH 7,4. In een 96-well plaat, voeg 2 ug / cm 2 van Poly-D-Lysine het bekleden van de bodem van de putjes. Incubeer de plaat gedurende 45 min bij 37 ° C in 5% CO2 incubator. Na incubatie verwijderd en vervangen door PBS 200 ui/ Goed DMEM en plaats opnieuw bij 37 ° C in 5% CO2 incubator voor gebruik. 2. Dissectie van Gehele Retina Ophelderen van de muis: Offeren de muis volgens de Europese richtlijn 2010/63: door cervicale dislocatie. Snijd de kop met gebogen-schaar en plaats het in een diameter van 100 mm petrischaal na het oog te hebben ontsmet met een ontsmettingsmiddel. Verwijder het oog na de oogzenuw te hebben losgemaakt door het snijden het heel voorzichtig met een gebogen greep. Plaats vervolgens beide ogen in een 35 mm petrischaal met steriele CO 2 -i medium bij 21 ° C. Het verwijderen van het netvlies: Maak een gat ter hoogte van het oog ledemaat met behulp van een 18 G naald kunnen de schaar introduceren in de oogbol. Breng rechte schaar in het gat en knip de sclera onder de iris op de omtrek van de oogbol te ciliaire lichaam. <li> Verwijder het hoornvlies en de lens en houd de achterste kamer van het oog met het netvlies aangrenzend aan de sclera. Met twee fijne grepen, verwijder het glasvocht zich in de achterste kamer zonder beschadiging van het netvlies. Voeren vier radiale bezuinigingen (retina / sclera) naar afvlakking van het netvlies te staan. Opleving van de oogbol en pel het als een "oranje". Los van het netvlies van de sclera en retinale pigmentepitheel (RPE). Maak de retina nog bevestigd ter hoogte van de optische zenuw voorzichtig met fijne gebogen schaar. Maak de resterende glasvocht van de omtrek naar het midden van het netvlies met twee fijne handgrepen. Zorg ervoor dat al het glasvocht volledig is verwijderd om de afvlakking van het netvlies staan. Snijd het uiteinde van een plastic pipet en breng de retina een 35 mm petrischaal met CO 2 -i product met de plastic pipet. 3. Afdichting van Flat-Mounted Retina op Gelatine Block Verwijder 20 – 30 ml van de CO 2 -i medium uit de vibratome tank (de gelatine blok is gratis) om de afdichting van platte-gemonteerde netvlies mogelijk te maken. Transfer het netvlies naar een glasplaatje met behulp van een plastic pipet en een daling van de CO voeg 2 -i medium alvorens naar de gelatine slice met de fotoreceptoren naar beneden op de gelatine slice. Bevestig het netvlies aan de gelatine blok door voorzichtig injecteren verwarmd 4% gelatine aan één zijde van het blok tussen de retina en de gelatine blok gelijktijdig uitstoten warme gelatine aan de andere kant. Zuig 4% gelatine met een pasteur pipet. Wacht 10 minuten aan totale afdichten. Voeg CO 2 -i medium om de blok en het mes volledig onder te dompelen. 4. Snijden de Retina OPMERKING: Deze stap is essentieel voor een laag fotoreceptorcellen verkrijgen zonder de andere retinale cellen (Figuur 1). Vanaf de top van de gelatine blok, gesneden 100 pm seriecoupes het netvlies. Snijd vervolgens 100-120 urn van de binnenlaag. Afhankelijk van de toepassing kan deze laag worden weggegooid of opgeslagen in vloeibare stikstof. Zorg ervoor dat de snelheid van de vibratome is erg traag (1 of 2) tijdens het snijden van de binnenste laag of fotoreceptoren lagen. Voer intermediair 15 urn van de retina overeenkomt met de interface tussen de binnenste en de buitenste retina. Observeer deze sectie onder een microscoop. De afwezigheid van bloedvaten blijkt dat de buitenste retina bereikt. Snij 200 urn van de buitenste retina (de fotoreceptor laag) met gelatine en overbrengen naar een 35 mm schaal diameter gevuld met 3 ml van CO 2 -i medium. Houd het op ijs tot alle fotoreceptor laag secties van alle netvliezen worden verkregen. 5. Dissociatie lichtgevoelige cellen Neem de schotel (es) die de fotoreceptor laag (lagen) en zet het (ze) in een incubator bij 37 ° C gedurende 10 min. Behulp van een tang voorzichtig scheiden de fotoreceptor laag van de gelatine en breng deze in een nieuwe schaal gevuld met 3 ml oplossing van Ringer. Herhaal deze stap (5.2) voor elke lichtgevoelige laag voorbereiding. Incubeer 2 eenheden van papaïne met 25 ul activator-oplossing (1,1 mM EDTA, 5,5 mM L-cysteïne, 60 uM β-mercaptoethanol) in een 5 ml polypropyleen steriele buis en incubeer het 30 minuten bij 37 ° C in 5% CO2 incubator . De activering van papaïne wordt bereikt bij 37 ° C. Tijdens deze incubatie, snijd de lichtgevoelige laag in 2 mm 2 stuks (niet te klein) en breng deze stukjes in een 5 ml buizen. Tweemaal Spoel het netvlies 1,5 ml oplossing van Ringer-oplossing, gevolgd door zwaartekracht sedimentatie. Verwijder alle resterende Ringer-oplossing uit de buis met het monster. Voeg 475 ul van Ringer-oplossing voor de buis met geactiveerde papaïne en mix. Voeg deze oplossing aan de buis met het netvlies. Incubeer de buis met het netvlies gedurende 20 min bij 37 ° C in 5% CO2 incubator. Stop de reactie door toevoeging van 1 ml 10% FCS in DMEM. Voeg 25 U van desoxyribonuclease I (DNAse I) gedigereerd DNA uit cellen dood. Homogeniseer de celsuspensie voorzichtig met een 1 ml-pipet. Spin bij 50 xg gedurende 6 min bij RT. Verwijder het supernatant om sporen van het serum te verwijderen en voeg DMEM medium met supplementen (zie tabel van specifieke reagents_equipment) naar de cel-pellet en resuspendeer voorzichtig de celsuspensie met een pipet 1 ml. Spin bij 50 xg gedurende 6 min bij RT. Herhaal deze stap (5.7) eens te meer. 6 Het kweken lichtgevoelige cellen De fotoreceptor laag van een muis PN8 bevat ongeveer 1-1500000 cellen met deze techniek. Zaad van de lichtgevoelige cellen in 1x 10 5 cellen / cm2 in een kweekplaat met kweekmedium en kweek van de cellen gedurende 5 dagen bij 37 ° C in 5% CO2 incubator. Op dag 5, overgaan tot immunochemie en western blotting studie volgt die door de leveranciers het antilichaam. OPMERKING: Stappen om de cultuur te stoppen en de voorafgaande proeven worden beschreven in referentie 21.

Representative Results

Naast transplantatie werden de fotoreceptor lagen ook gebruikt om cell signaling bestuderen door zaaien cellen voor het maken fotogeleider kweken 12,22. Bovendien worden ze gebruikt om genexpressie en circadiane ritme 23,24 bestuderen. We hebben de cel fotoreceptor laag uit een wildtype muis gebruikt postnatale dag 8 fotoreceptor kweken in afwezigheid van FCS bereiden en onderhouden de cellen gedurende 5 dagen bij 37 ° C in een incubator met 5% CO2 (Figuur 1E ). De cellen werden vervolgens gefixeerd met 4% paraformadehyde en vervolgens voortgegaan immunocytochemische analyse met die door het antilichaam leveranciers hetzij muizen monoklonaal anti-RHO (1: 250, Millipore Mab5316) of konijn polyklonaal anti-SAG (1: 200, een royale gave van Igal Gery en David Hicks). We gebruikten anti-RHO en anti-SAG (hoewel thixotropiebevorderende label kegeltjes en staafjes) vanwege het feit dat anti-SAG een eerdere merker, dan anti-RHO. Het aandeel van CELls positief voor het anti-RHO antilichaam lager dan die positief voor anti-SAG-antilichamen (Figuur 2). Dit kan worden verklaard door het feit dat SAG, de stang arrestin wordt ook uitgedrukt door kegels die 3% van fotoreceptoren maken de geïsoleerde laag, of alternatief door het feit dat tijdens postnatale maturatie van de retina, de expressie van SAG dat voorafgaat Rho 25,26. De fotoreceptor laag werd ook gebruikt om de expressie van genen controleren aan fotoreceptoren van het wildtype retina en de hersenen van dieren 35 dagen RNA werden bereid middels CsCl ultracentrifugatie 27 en gehybridiseerd met muis DNA chip Array jaar. De boodschappers voor rhodopsine (Rho), S-arrestin (Sag) en kegel-transducine (Gnat2) worden specifiek in de retina uitgedrukt ten opzichte van de hersenen (Figuur 3A). De uitdrukking is prominent aanwezig in de fotoreceptor laag (PR) dan in de hele netvlies, die omvatde binnenste retinale laag blijkt dat deze genen inderdaad door fotoreceptoren worden uitgedrukt. Voor Gnat2, de relatieve expressie ten opzichte van Rho en Sag blijkt dat wordt uitgedrukt door kegels opgenomen in het geïsoleerde fotoreceptor laag. De expressie van recoverin (Rcvrn) in de fotoreceptor laag in vergelijking met de gehele retina wordt verhoogd (Figuur 3B). De fotoreceptor laag werd ook gebruikt om de expressie van RHO en GNAT2 met Western blotting na die door de leveranciers antilichaam monitoren en te vergelijken met de binnenste retinale laag (figuur 4). Let op de afwezigheid van RHO en GNAT2 28, de markers van de staafjes en kegeltjes in respectievelijk het hele netvlies en in het netvlies van RD1 muis op postnatale dag 35. Figuur 1. Schematische weergave van de vibratome snijden van muis netvlies. (A) Installatie van de flat-gemonteerde netvlies met de fotoreceptor naar beneden op de gelatine slice. (B) Sectie van de binnenste netvlies met de vibratome mes. (C) Sectie van de buitenste retina toegevoegde gelatine. (D) Controle van de aanwezigheid van fotoreceptor aan de rand van het fragment van netvlies na de isolatie van fotoreceptor laag. Schaalbalk gebruikt voor groene fluorescentie wordt gebruikt van een wit licht microscoop. De fotoreceptoren zijn in de rand van het beeld. (E) Gekweekte fotoreceptorcellen (na vijf dagen). (F) Hogere vergroting paneel E. Figuur 2. Differentiële expressie van RHO en SAG in de muis fotoreceptoren cultuur. (A) Kleuring van kernen (blauw), (B) SAG kleuring (groen), (C) RHO kleuring (rood). (D) Samengevoegd afbeelding. Omdat kleuring van SAG eerder dan RHO kleuring wordt uitgedrukt, worden slechts twee cellen dubbel gelabeld SAG en RHO (zie *). Schaalbalk:. 23 micrometer Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. Figuur 3. Vergelijking van de expressie van drie genen in de hersenen en het gehele netvlies en fotoreceptoren van het wildtype dieren vijfendertig dagen oud. (A) Rhodopsin (Rho), S-arrestine (Sag) en kegel-transducine (Gnat2). (B) Calbindin (Calb1) en Recoverin (Rcvrn). De gegevens worden weergegeven als relatieve expressie. De relatieve expressie is een expressie waardeverkregen van microarray data na normaliszation met de software Robuuste multi-array-Average (RMA) beschikbaar in de kennisdatabase KBaSS (http://kbass.institut-vision.org/KBaSS/). Figuur 4. Expressie van RHO en GNAT2 in de buitenste retina van een wild-type netvlies aan postnatale dag 35. Afwezigheid van hun expressie in de binnenste netvlies en in het netvlies van het RD1 muis op postnatale dag 35. ACTB, beta actine. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken. <!– Repeat of the materials table Naam van het product / Apparatuur Vennootschap Catalogusnummer Opmerkingen / Omschrijving Cytidine-5'diphosphocholin * Sigma-Aldrich C0256 4.7 uM Cytidine 5'-diphosphocholin Cytidine-5'diphosphoethanolamine * Sigma-Aldrich C0456 2.7 uM Cytidine 5'-diphosphoethanolamine Linolzuur / bovine serum albumine (BSA) * Sigma-Aldrich L8384 100 ug / ml linolzuur / bovine serum albumine (BSA) Trijood-L-thyronine * Sigma-Aldrich T6397 0,03 uM trijood-L-thyronine 96-wells plaat Greiner Bio-One 655-095 Binoculaire microscoop Leica MZ-75 CO 2 onafhankelijke (CO 2- i) Leven Technologies 18045054 DMEM Life Technologies 41966029 Tang n ° 5 Dumont Bionic 11.254-20 Gelatine van het type varkensbedrijf huid A Sigma-Aldrich G2500 GeneChip Affymetrix U74v2 Gentamicin oplossing Life Technologies 15710049 Hydrocortison * Sigma-Aldrich H0888 0,55 uM hydrocortison Insuline * (I) Sigma-Aldrich I1884 (ITS) 0.86 uM insuline (I) Papaïne Worthington-biochem WOLS03124 Poly-D-Lysine Sigma-Aldrich P-6407 Progesteron * Sigma-Aldrich P7556 2,0 uM progesteron Prostaglandine * Sigma-Aldrich P5172 0,28 uM prostaglandine Putrescine * Sigma-Aldrich P5780 182 uM putrescine Scalpel Albion EMS 72000 Scissor Moria 15.396-00 Natriumpyruvaat * Sigma-Aldrich S8636 1 mM natriumpyruvaat Natriumseleniet * (S) Sigma-Aldrich I1884 (ITS) 0.29 uM Na 2 SeO 3 (S) Taurine * Sigma-Aldrich T8691 3 mM taurine <td> Transferrine * (T) Sigma-Aldrich I1884 (ITS) 0,07 uM transferrine (T) Vibratome apparaten Leica VT1000-S * Supplementen Tabel 1: Specifiek materiaal en apparatuur is gebruikt. ->

Discussion

Het netvlies is een model orgaan biologie. Studie van het netvlies heeft geleid tot 6 grote ontdekkingen in de biologie. Het ligt aan de oorsprong van de eerste tumor suppressor gen RB1. Het onthult de moleculaire verbinding tussen de receptor tyrosine kinases en de MAP kinases door de interactie met de Zoon van sevenless. Hij was betrokken bij de ontdekking van PAX6, de eerste master control gen voor orgel morfogenese. Het is in het centrum van de genetische associatie van complement factor H (CFH) met leeftijdsgebonden maculaire degeneratie (AMD), de eerste ziektegevoeligheid gen geïdentificeerd door genoomwijde associatie scherm (GWAS). Tenslotte leidde tot de eerste succesvolle gentherapie voor Leber congenitale amaurosis, de eerste corrigerende gentherapie studie bij menselijke van een erfelijke ziekte. De structuur van dit orgaan is geconserveerd in de meeste gewervelde dieren. De toegankelijkheid voor manipulatie in vivo heeft begin aangemoedigd op functional genomics onderzoek op deze integraal onderdeel van het central zenuwstelsel.

We laten hier zien hoe de fotoreceptor laag te scheiden van de binnenlaag van het netvlies vibratome snijden. Deze stap is essentieel voor pure fotoreceptor kweken verkrijgen. Onze dissectie protocol maakt de besmetting door RPE cellen zeer onwaarschijnlijk.

Eén van de belangrijkste uitdagingen is de afvlakking van de retina die nodig is om punt juist de binnenste en de buitenste retina. Het snijden van het netvlies is beste op netvlies met kleine diameter als die van knaagdieren en deze diameter is een beperking van de techniek huidige beschikbare materiaal.

Het is raadzaam voordat een biologisch betekenisvol experiment te oefenen op een monster van het netvlies. We illustreren de wijze representatieve resultaten verkregen uit gekweekte fotoreceptorcellen, waarin het materiaal gebruikt om expressie studie van zowel mRNA en proteïnes. Expressie studies kunnen ook worden uitgevoerd op sections verkregen door lasermicrodissectie, maar de culturen zijn het best uitgevoerd met behulp van vibratome snijden. We konden gebruiken de techniek van microdissection laser met een compleet andere strategie. Maar om de fotoreceptor laag met de microdissectie inrichting voor cultuur verzamelen, zou moeten worden fixeermiddel vermijden en zou de huidige methode aanzienlijk compliceren.

We zijn het ontwikkelen van een protocol gericht op het bestuderen van de kinetiek van gen- en eiwitexpressie in vibratoomcoupes tijdens de degeneratie van fotoreceptoren in modellen van retinitis pigmentosa. Wij geloven dat de gedetailleerde beschrijving van het protocol bruikbaar voor onderzoekers op het gebied van retinale biologie zal zijn en in het bijzonder voor proteomics en metabolomics studies.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Igal Gery and David Hicks for anti-SAG antibodies. Ram Fridlich for reading the manuscript.

Materials

Name of Material / Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Cytidine 5′-diphosphocholin* Sigma-Aldrich C0256 4.7 µM Cytidine 5′-diphosphocholin
Cytidine 5′-diphosphoethanolamine* Sigma-Aldrich C0456 2.7 µM Cytidine 5′-diphosphoethanolamine
Linoleïc acid/ bovine serum albumin (BSA)* Sigma-Aldrich L8384 100 µg/ml linoleïc acid/ bovine serum albumin (BSA)
Triiodo-L-thyronine* Sigma-Aldrich T6397 0.03 µM Triiodo-L-thyronine
96-wells plate Greiner bio-one 655-095
Binocular microscope Leica MZ-75
CO2 independent (CO2-i) Life Technologies 18045054
DMEM Life Technologies 41966029
Forceps n°5 Dumont Bionic 11254-20
Gelatin from porcin skin type A Sigma-Aldrich G2500
GeneChip  Affymetrix U74v2
Gentamicin solution Life Technologies 15710049
Hydrocortison* Sigma-Aldrich H0888 0.55 µM hydrocortison
Insulin* (I) Sigma-Aldrich I1884 (ITS) 0.86 µM insulin (I)
Papain Worthington-biochem WOLS03124
Poly-D-Lysine Sigma-Aldrich P-6407
Progesterone* Sigma-Aldrich P7556  2.0 µM progesterone
Prostaglandin* Sigma-Aldrich P5172 0.28 µM prostaglandin
Putrescine* Sigma-Aldrich P5780  182 µM putrescine
Scalpel Albion EMS 72000
Scissor  Moria 15396-00
Sodium Pyruvate* Sigma-Aldrich S8636 1 mM sodium pyruvate
Sodium Selenite* (S) Sigma-Aldrich I1884 (ITS) 0.29 µM Na2SeO3   (S)
Taurine* Sigma-Aldrich T8691 3 mM taurine
Transferrin* (T) Sigma-Aldrich I1884 (ITS) 0.07 µM transferrin (T)
Vibratome apparatus Leica VT1000-S
* Supplements
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Kolb, H., Nelson, R., Fernandez, E., Jones, B. The Organization of the Retina and Visual System. Webvision. , (2014).
  2. Perez De Sevilla Muller, L., Shelley, J., Weiler, R. Displaced amacrine cells of the mouse retina. J Comp Neurol. 505 (2), 177-189 (2007).
  3. Mohand-Said, S., et al. Photoreceptor transplants increase host cone survival in the retinal degeneration (rd) mouse. Ophthalmic Res. 29 (5), 290-297 (1997).
  4. . RetNet, the Retinal Information Network Available from: https://sph.uth.edu/retnet (2014)
  5. Mohand-Said, S., Hicks, D., Dreyfus, H., Sahel, J. A. Selective transplantation of rods delays cone loss in a retinitis pigmentosa model. Arch Ophthalmol. 118 (6), 807-811 (2000).
  6. MacLaren, R. E., et al. Retinal repair by transplantation of photoreceptor precursors. Nature. 444 (7116), 203-207 (2006).
  7. Yang, Y., et al. Transplantation of photoreceptor and total neural retina preserves cone function in P23H rhodopsin transgenic rat. PLoS One. 5 (10), (2010).
  8. Mohand-Said, S., et al. Normal retina releases a diffusible factor stimulating cone survival in the retinal degeneration mouse. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (14), 8357-8362 (1998).
  9. Fintz, A. C., et al. Partial characterization of retina-derived cone neuroprotection in two culture models of photoreceptor degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (2), 818-825 (2003).
  10. Cronin, T., Leveillard, T., Sahel, J. A. Retinal degenerations: from cell signaling to cell therapy; pre-clinical and clinical issues. Curr Gene Ther. 7 (2), 121-129 (2007).
  11. Wright, A. F. A searchlight through the fog. Nat Genet. 17 (2), 132-134 (1997).
  12. Leveillard, T., et al. Identification and characterization of rod-derived cone viability factor. Nat Genet. 36 (7), 755-759 (2004).
  13. Lillig, C. H., Holmgren, A. Thioredoxin and related molecules–from biology to health and disease. Antioxid Redox Signal. 9 (1), 25-47 (2007).
  14. Fridlich, R., et al. The thioredoxin-like protein rod-derived cone viability factor (RdCVFL) interacts with TAU and inhibits its phosphorylation in the retina. Mol Cell Proteomics. 8 (6), 1206-1218 (2009).
  15. Yang, Y., et al. Functional cone rescue by RdCVF protein in a dominant model of retinitis pigmentosa. Mol Ther. 17 (5), 787-795 (2009).
  16. Bennett, J. Strategies for delivery of rod-derived cone viability factor. Retina. 25 (8 Suppl), S47 (2005).
  17. Komaromy, A. M., et al. Transient photoreceptor deconstruction by CNTF enhances rAAV-mediated cone functional rescue in late stage CNGB3-achromatopsia. Mol Ther. 21 (6), 1131-1141 (2013).
  18. Birch, D. G., Weleber, R. G., Duncan, J. L., Jaffe, G. J., Tao, W. Randomized trial of ciliary neurotrophic factor delivered by encapsulated cell intraocular implants for retinitis pigmentosa. Am J Ophthalmol. 156 (2), 283-292 (2013).
  19. Cronin, T., et al. The disruption of the rod-derived cone viability gene leads to photoreceptor dysfunction and susceptibility to oxidative stress. Cell Death Differ. 17 (7), 1199-1210 (2010).
  20. Leveillard, T., Sahel, J. A. Rod-derived cone viability factor for treating blinding diseases: from clinic to redox signaling. Sci Transl Med. 2 (26), 26ps16 (2010).
  21. Fontaine, V., Hicks, D., Dreyfus, H. Changes in ganglioside composition of photoreceptors during postnatal maturation of the rat retina. Glycobiology. 8 (2), 183-190 (1998).
  22. Fontaine, V., Kinkl, N., Sahel, J., Dreyfus, H., Hicks, D. Survival of purified rat photoreceptors in vitro is stimulated directly by fibroblast growth factor-2. J Neurosci. 18 (23), 9662-9672 (1998).
  23. Reichman, S., et al. The homeobox gene CHX10/VSX2 regulates RdCVF promoter activity in the inner retina. Hum Mol Genet. 19 (2), 250-261 (2010).
  24. Sandu, C., Hicks, D., Felder-Schmittbuhl, M. P. Rat photoreceptor circadian oscillator strongly relies on lighting conditions. Eur J Neurosci. 34 (3), 507-516 (2011).
  25. Dorrell, M. I., Aguilar, E., Weber, C., Friedlander, M. Global gene expression analysis of the developing postnatal mouse retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (3), 1009-1019 (2004).
  26. Brooks, M. J., Rajasimha, H. K., Roger, J. E., Swaroop, A. Next-generation sequencing facilitates quantitative analysis of wild-type and Nrl(-/-) retinal transcriptomes. Mol Vis. 17, 3034-3054 (2011).
  27. Delyfer, M. N., et al. Transcriptomic analysis of human retinal surgical specimens using jouRNAI. J Vis Exp. (78), (2013).
  28. Ying, S., et al. A CAT reporter construct containing 277bp GNAT2 promoter and 214bp IRBP enhancer is specifically expressed by cone photoreceptor cells in transgenic mice. Curr Eye Res. 17 (8), 777-782 (1998).

Tags

VibratomeRetinaPhotoreceptorCultureMouseGelatinCentrifugationPapainDNAseDMEMFCSSAGRHORodCone

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Clérin, E., Yang, Y., Forster, V., Fontaine, V., Sahel, J., Léveillard, T. Vibratome Sectioning Mouse Retina to Prepare Photoreceptor Cultures. J. Vis. Exp. (94), e51954, doi:10.3791/51954 (2014).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image