1. Фиксация проб и смолы вложение Образцы свежей ткани и клетки фиксируют, по крайней мере 2 часа в 2% параформальдегида, и 2,5% глутарового альдегида в 0,1 М фосфатного буфера при рН 7,4. Размер выборки не должна превышать 0,150 мм в толщину для обеспечения адекватного проникновения или фиксатора, и не должны быть оставлены на исправление более 12 часов. Место образцов в 20 мл флаконы сцинтилляционные стекла и промойте их в три раза, 5 минут каждая, в буфере 0,1 какодилатном. Пятно с 1,5% (м / о) ферроцианида калия и 1% (м / о) осмия в 0,1 М какодилатном буфере (0,1 М, рН 7,4) в течение 30 минут. Пятно с 1,0% (м / о) осмия в буфер 0,1 М какодилатном течение 30 минут. Полоскание один раз с двойным дистиллированной воде в течение 3 минут. Пятно с 1% (м / о) уранилацетата в бидистиллированной воде в течение 30 минут. Промыть разделы течение 5 минут в дистиллированной воде, а затем обезвоживают в градуированных серии спирта, 2 минут каждое изменение (1 х 50%, 1 х 70%, 1 х 90%, 1 х 95%, 2 х 100%). Добавить в возрастающих концентрациях Durcupan смолы, смешанной с этанолом, 30 минут каждое изменение, начиная с 50% Durcupan в этаноле, затем следуют: 70%, 90%, 95%, а затем 100%. Замените свежие Durcupan и агитировать медленно в течение 4 часов. Место разделах, используя деревянные палочки коктейль, на стекле микроскопа слайды покрытые плесенью разделяющий агент, и места в 65 ° С духовке в течение 24 часов. 2. Подготовка проб для FIB / SEM Отдельные смолы слой, содержащий образцы, с места между двумя предметными стеклами стекла микроскопа и тщательно промыть, чтобы удалить плесень разделительное средство. Использование микроскопа проходящего света с низким целям власти, или рассечение микроскопом в проходящем освещении, для определения области интересов в рамках кусочек смолы. Вырезать небольшой (3 мм х 3 мм) квадрат вокруг интересующей нас области использования лезвие и придерживаться этого в начало пустой блок смолы с акриловым клеем (рис. 1). Подождите 5 минут, когда клей затвердеет, а затем приступить к следующему шагу. Зажим блока в держатель ulramicrotome и, используя прилагаемый стереомикроскопа, обрезка по всему региону, представляющие интерес с лезвием пока лишь небольшая пирамида материал остается. Дальнейшая отделка блок, с использованием стекла нож фиксируется в ультрамикротоме, так что область интереса может быть точно расположены относительно размеров поверхности блока (рис. 1). Вырезать один край блока, близко к области интереса, так что перпендикулярно шаг прорезается образца (рис. 1 и 2). Этот шаг формы изображения лица (рис. 2). Удалить блок из ультрамикротоме и сфотографировать области интересов в рамках блока, используя проходящем свете микроскопа. Вырезать отделаны квартале от оставшейся смолы заглушки. Это делается с помощью видел ювелирного и гарантирует, что только небольшой блок размещается внутри FIB / SEM. Общая высота этого блока не должна быть более 5 мм. Клей для блоков алюминия заглушки с углеродом пасты обеспечение того, чтобы стороны для включения в образ находится на внешней кромке (рис. 1). После высыхания клея, флаг блока с тонким слоем золота (> 20 нм; Крессингтон вакуумного испарения системы). 3. Изображений в FIB / SEM На малом увеличении, а с использованием вторичных электронов изображения (5 кВ, 0,5 nAmp), ориентироваться блок так, чтобы выбранной области интереса и стороны блока для включения в образ стоит перед оператором (рис. 2 в, г). Восток блок так, чтобы лицо для включения в образ лежит параллельно фрезерные луча. Это означает, что пучок электронов ориентированы на 54 ° к этой грани (рис. 2 б). Использование ионного тока пучка от 13 – 27 nAmps на 30 кВ удалить узкой полосы смолы с передней области для включения в образ. Переключение в режим отраженных изображений, чтобы посмотреть в лицо фрезерованные, который перекрывает области интереса. Использование светлый образ ссылкой микроскопии (приняты на шаг 16) и образ фрезерованные лицо найти точные области на блок для фрезерного и образ (рис. 2). Депозит защитный слой (примерно 1 микрон) углерода (или металла), с помощью системы закачки газа в микроскоп, на поверхности блока, прежде интересующей области (рис. 2). Использование тока 700 picoAmps, мелко мельница области блока, в котором окончательные изображения будут приняты. Оставьте фрезерные луч полностью мельница изображения лицо, пока не фрезерные артефакты можно увидеть на лице. Полный мельницу лицо проверяется путем наблюдения изменения в каждый последующий изображения по всему полю зрения. Недостаточная фрезерные также может рассматриваться как белые полосы или «шторы» появляются Vertically в изображении. Оставьте микроскоп для не менее 2 часов для любых тепловых изменений, чтобы рассеять. Это снижает риск того, что блок лицо будет дрейфовать во время съемки, в результате чего разрегулированные изображений. Выберите микроскопом параметры для работы с изображениями лица серийно. Убедитесь, что электронный пучок имеет напряжение, которое является достаточно низким, чтобы только изображение очень небольшой глубине материала в блоке лицо. Это также должно быть гораздо мельче, чем толщина лица должны быть удалены. Типичные параметры для работы с изображениями в напряжении от 1,2 – 2,0 кВ с пиксельными размерами от 4 – 20 нм. Пиксель время выдержки должно быть сохранено около 10 μsecs так, чтобы общее время на мельницу лицо и приобрести одного изображения сохраняется менее 2 минут (рис. 3). 4. Секреты успеха Шаг 1) Убедитесь, образцы толщиной не более 150 мкм. Это даст возможность адекватного проникновения различных пятен и смолы в материал. Это может быть достигнуто путем срезов образцов с vibratome сразу после фиксации. Такая толщина подходит для тканей мозга. Другие ткани должны быть проверены для обеспечения адекватной фиксации и окрашивания. Шаг 3) образцы должны быть свободно распространены по всей решение, и не слипаются вместе, в одной части флакона в то время как этот вторичный фиксатор вводится. Это позволит обеспечить максимальное проникновение образца и уменьшить образец становится искаженной в этот процесс фиксации. Это достигается за счет мягко закрученного образцов в флакона сразу же после раствор добавляют. Шаг 15) Убедитесь, что область интереса находится непосредственно под (<30 мкм) поверхности блока. Это позволит сократить количество фрезерных пучком ионов в фазе захвата изображений. Шаг 22) время сканирования ионного пучка должна быть adequte для того, чтобы все лицо визуализации полностью фрезерованные. Недостаточная фрезерные будут показаны как белые полосы, или «шторы» появляются вертикально вниз изображения лица. Шаг 26) окончательное фрезерованные лицо должно быть больше, чем лицо, что изображено. Это происходит потому, фрезерованные смолы выбрасывается из блока и redeposits на поверхности блока в непосредственной близости. Это переотложения может посягать на изображение поля зрения, и избежать, фрезерные гораздо большую площадь, чем образ. Для визуализации окно, которое составляет 20 мкм в ширину, фрезерованные кварталу превышает 30 микрон в ширину. Шаг 29) Очень важно, чтобы параметры электронного пучка таковы, что изображение создается электронами, которые возникают из только первые несколько нанометров от поверхности блока. Это acheved путем минимизации напряжения до уровня ниже 2 кВ и обеспечения того, чтобы не электроны проникают слишком далеко. Это также помогло с помощью сетки напряжение на детекторе, так что только электрон с высоких энергиях вклад в окончательное изображение. Как правило, сетки напряжение 1,3 кВ используется для визуализации напряжением 1,5 кВ. 5. Представитель Результаты: Рисунок 1. Подготовка смолы блока.) Смола встроенных корональных раздел (80 микрон) с помощью взрослого мозга крысы рассматривать в steromicroscope. Изображение наглядно показывает различные участки мозга, которые могут быть вырезаны из раздела (б) с помощью лезвие скальпеля. Здесь, 1 мм, квадрат от коры снимается и (с) застряли в пустой блок смолы. Г) смолы блок затем отделан стеклом нож устанавливается в ультрамикротоме, и как только блок был сокращен до только оставить область интереса (е), шаг, вырезанные перпендикулярно передней поверхности встроенные материала. е) Весь этот регион обрезается затем разрезается от остальной части смолы и установлен на алюминиевой заглушкой готовы к металлическим покрытием и изображений в сканирующего электронного микроскопа. Рисунок 2. Подготовка блока лицо FIB / SEM изображения.) И б) показать иллюстрации блока и край, который измельчают для создания изображения лица (указывается с черным двуглавым стрелкой). Положение ионного пучка (белый) показан параллельно изображение лица и электронного пучка (серый) показан удар лицом при 54 ° до ионного пучка. В) показан вид блока принимать с электронным пучком и полученную с использованием вторичных электронов. Вдоль этой стороне блока темные области (на рисунке показана пунктирной белой коробке) показывает, часть лица, которая была грубо молотый (показано с двойной головкойред черная стрелка), чтобы выявить основные образца. г) Когда эта область изображается только с помощью отраженных электронов встроенный ткани могут быть видны. Здесь, по всей ширине ткани встроенный раздел обозначается двуглавого белая стрелка. Шкала бар с) составляет 100 мкм. Рисунок 3. Изображений объем мозговой ткани с изотропными вокселей.) Обратный контрастность отраженных образ кварталу показывающий ультраструктуру в области головного мозга крыс. Все мембраны видны, а также крупных макромолекулярных структур. Б) в общей сложности 1600 изображений были собраны в 5 нм расстояния в результате чего изображение стек с изотропными вокселей. В) Этот стек могут быть отображены в любой плоскости, с таким же разрешением. Это изображение показывает одну синаптической связи, что изображено в плоскости ху и плоскости YZ.