聚焦离子束铣削和脑组织的扫描电子显微镜

1。样品的固定和树脂包埋新鲜的组织和细胞的样品至少2个小时是固定的，在2％多聚甲醛和2.5％，0.1 M磷酸缓冲液pH值在7.4戊二醛。样本大小应不超过0.150毫米的厚度，以便有足够的渗透或固定液，不应该超过12小时修复左。 放置在20毫升玻璃闪烁瓶样品和冲洗三次，每次5分钟，在0.1M cacodylate缓冲区。 1.5％（W / V）在0.1 M的cacodylate缓冲区为30分钟（0.1M，pH值7.4）亚铁氰化钾和1％（W / V）的四氧化锇染色。 在0.1M cacodylate缓冲区的1.0％（W / V）30分钟的四氧化锇染色。 3分钟，用双蒸水冲洗一次。 1％（W / V）30分钟，双蒸水醋酸铀染色。 5分钟双蒸水冲洗的部分，然后脱水梯度酒精系列，每个变化（1 × 50％× 70％，1 × 90％× 95，1％，2 × 100％）2分钟。 嵌入在用乙醇Durcupan树脂混合30分钟，每一个变化，50％的乙醇Durcupan开始浓度的增加，然后依次为：70％，90％，95％和100％。 更换新鲜Durcupan和搅拌4小时慢慢。 放置节，使用鸡尾酒​​枝木，与模具分离剂涂在玻璃显微镜幻灯片，并在65个地点° C的烘箱24小时。 2。 FIB / SEM样品准备单独的树脂层，包含的样本，从两者之间的玻璃显微镜幻灯片，并彻底清洗，以消除任何模具分离剂。 使用一个透射光显微镜，具有低功耗的目标或传输照明显微镜解剖，找出感兴趣的区域内的树脂片。 切一小（3毫米x 3毫米）周围地区使用刀片的利益方，并坚持这一空白树脂与丙烯酸酯胶块（图1）。胶变硬，等待5分钟，然后进行下一步。 块和钳入ulramicrotome持有人，使用附加的体视显微镜，修剪周围地区用刀片的兴趣，直到材料仍然只是一个小金字塔。 进一步削减块，使用玻璃刀固定到ultramicrotome，使感兴趣的区域，可以精确地尊重位于块的表面（图1）的尺寸。剪切块的一个边缘，邻近地区的利益，使垂直第一步是通过削减样品（图1和2）。这一步形成的成像面（图2）。 删除从ultramicrotome和照片的块内的利息区域块，使用透射光显微镜。 切修剪街区之遥，从剩余的树脂存根。这是通过使用一个珠宝商的锯和保证，只有一小块放在里面的FIB / SEM。这个区块的总高度不应超过5毫米。 胶块，​​碳糊铝存根，确保成像面的最外边缘（图1）。 在已经干涸的胶水，外套用薄金层（> 20纳米; Cressington真空蒸发系统）的块。 3。 FIB / SEM成像在低倍率，使用二次电子成像（5千伏，0.5 NAMP），定位块，使选择的地区的利益和侧块进行成像和正面临着经营者（图2 C，D）。 东方在于使面部成像块铣削束平行。这将意味着在54 °面对这种情况（图2 B），电子束导向。 使用离子束电流13 – 30千伏27 NAMPS从前面的成像区域中删除的树脂的窄带。 切换到反向散射成像模式查看碾磨面覆盖在感兴趣的区域。 使用光学显微镜的参考图像（第16步）和碾磨面对的形象被碾碎和成像（图2），定位块的确切地区。 存款的碳（或金属）的保护层（约1微米厚），感兴趣的区域（图2），使用显微镜的气体喷射系统，到块的表面，上面。 使用目前的700 picoAmps，精细磨块区域内的最终图像将采取。 离开铣削束完全磨，直到没有铣削工件可以在脸上看到的形象面对。面对的一个完整的轧机检查通过观察每一个横跨整个视野的后续形象变化。不足铣也可以看作是白色条纹或出现Vertica的“窗帘”LLY中的形象。 保留任何消散的温度变化至少2小时的显微镜。这降低了风险，块面漂移在成像过程中，造成对齐图像。 面对连续成像显微镜参数选择。确保电子束的电压足够低，唯一的形象在块面的材料的深度很浅。这也应该比要删除的面厚度较浅。成像的典型参数电压介于1.2 – 2.0千伏之间的像素大小的4 – 20纳米。像素停留时间的需求将保持约10个这样的总时间磨脸，并获得一个图像保持低于2分钟（图3）μsecs。 4。成功的秘诀 步骤1）确保样本不超过150微米的厚度。这将使足够渗透到不同的污渍和树脂材料 。 这样就可以实现由一个vibratome切片后立即固定样本。这个厚度是适合于脑组织 。 其他组织需要进行测试，以确保有足够的固定和染色。 步骤3），样品必须自由地分布在整个解决方案，而不是一起成群在一个小瓶的一部分，而这一次要固定液介绍。 这将确保最大穿透样品，并减少样品，成为这个固定过程中扭曲。 这是通过轻轻摇动小瓶样品后，立即解决的办法是添加。 第15步）确保感兴趣的区域，位于下方（<30微米）的块面。这将减少离子束铣削量，在图像采集阶段 。 第22步）的离子束扫描时间需要adequte，以确保整个成像面对的是完全碾磨。不足铣床将显示为白色条纹，或垂直向下成像面出现“窗帘”。 步骤26）最后碾磨面对必须大于成像面。这是因为在附近的块面块和redeposits弹出铣削树脂 。 这再沉积可以侵犯到成像领域的观点，并避免铣得多大面积比成像。对于成像的窗口，是宽20微米，精块面是大于30微米，宽 。 步骤29），这是关键，从出现的第一个块的表面几纳米的电子所产生的图像是由电子束参数等。 这acheved最小的电压低于2千伏和保证，没有电子穿透太远。这也是帮助探测器上使用的电网电压，因此，只有具有最高能量的电子有助于最终图像。 通常情况下，1.3千伏电网的张力是用于一个1.5千伏的成像电压。 5。代表性的成果： 图1）树脂制备树脂块。嵌入steromicroscope查看通过一个成年大鼠脑冠状切面（80微米厚）。图像清楚地显示不同的大脑部分使用手术刀刀片（二）可以从削减地区。在这里，从1平方毫米的皮层被删除，（三）坚持一个空白树脂块D）树脂块，然后与装在一个ultramicrotome玻璃刀修剪，一旦区块已减少到只有离开感兴趣的区域（E），一步步被切断嵌入式材料的前表面垂直。F）修剪这整个地区，然后从其余的树脂削减，并安装到一的铝金属涂层的存根，在成像扫描电子显微镜。 图2。准备FIB / SEM成像的块面。a）和b）显示块和边缘研磨创建的成像面（与黑色的双箭头表示）中的插图。离子束（白）的位置是平行的成像面，并显示54 °打脸的离子束，电子束（灰色）。C）与电子束块二次电子成像。沿着这一侧块较暗的区域（虚线白盒表示）显示部分已大致碾磨面对（双头显示ED黑色箭头），以揭示底层样品。D）当本地区只用背散射电子成像包埋组织中可以看出。在这里，全宽包埋组织部分，是一个双头白色箭头指示。规模在 C栏）为100微米。 图3。成像与各向同性体素脑组织量A）反背散射图像块的对比显示大鼠脑区域内面对的超微结构。所有的膜是可见的，以及大型的大分子结构。B）共1600图像收集在5 nm的图像堆栈 C）本协议栈可在任何平面成像同一决议的各向同性体素的间距。此图像显示了在xy平面和yz平面成像的单突触连接。