1. Esempio di fissazione e di inclusione in resina I campioni di tessuto fresco e le cellule sono fissati per almeno 2 ore nel 2% paraformaldeide e glutaraldeide al 2,5% in tampone fosfato 0,1 M a pH di 7,4. La dimensione del campione non deve superare i 0,150 millimetri di spessore per consentire la penetrazione adeguata o fissativo, e non deve essere lasciato in correzione per più di 12 ore. Mettere i campioni in fiale da 20 ml scintillazione vetro e sciacquarli per tre volte, 5 minuti ciascuno, in tampone 0,1 M cacodilato. Macchia con 1,5% (w / v) di tetrossido di osmio ferrocianuro di potassio e 1% (w / v) in tampone 0,1 M cacodilato (0,1 M, pH 7,4) per 30 minuti. Macchia con tetrossido di osmio 1,0% (w / v) in tampone 0,1 M cacodilato per 30 minuti. Sciacquare subito con acqua bidistillata per 3 minuti. Macchia con 1% (w / v) di acetato di uranile in camera doppia acqua distillata per 30 minuti. Sciacquare sezioni per 5 minuti in acqua bidistillata, disidratano e poi in serie alcool classificato, 2 minuti a ogni cambio (1 x 50%, 1 x 70%, 1 x 90%, 1 x 95%, 2 x 100%). Incorpora in concentrazioni crescenti di resina Durcupan mescolata con l'etanolo, 30 minuti ogni cambiamento, partendo da 50% Durcupan in etanolo, seguito da: 70%, 90%, 95%, e poi 100%. Sostituire con Durcupan fresco e agitare lentamente per 4 ore. Sezioni luogo, utilizzando stuzzicadenti di legno, su vetro microscopi vetrini rivestiti con l'agente di separazione dello stampo, e mettere in forno a 65 ° C per 24 ore. 2. Preparazione del campione per il FIB / SEM Separare lo strato di resina, contenenti i campioni, da tra i due vetrini e microscopio lavare accuratamente per rimuovere qualsiasi forma di separazione agente. Utilizzando un microscopio a luce trasmessa con gli obiettivi di bassa potenza, o dissezione microscopio con illuminazione trasmessa, per identificare la regione di interesse all'interno della fetta di resina. Tagliare un piccolo (3 mm x 3 mm) quadrati attorno alla regione di interesse con una lama di rasoio e questo bastone alla cima del blocco di resina bianca con colla acrilica (Figura 1). Attendere 5 minuti per la colla per indurire, e poi procedere con il passo successivo. Bloccare il blocco nel supporto del ulramicrotome e, utilizzando lo stereomicroscopio collegato, ritagliare intorno alla regione di interesse con una lama di rasoio fino a solo una piccola piramide di resti materiali. Ulteriori tagliare il blocco, con un coltello di vetro fisso nella ultramicrotomo, in modo che la regione di interesse può essere localizzato con precisione rispetto alle dimensioni della superficie del blocco (Figura 1). Tagliare un bordo del blocco, vicino alla regione di interesse, in modo che un passo perpendicolare viene tagliato attraverso il campione (Figura 1 e 2). Questa fase costituisce il volto di imaging (Figura 2). Rimuovere il blocco dal ultramicrotomo e fotografare la regione di interesse all'interno del blocco, utilizzando un microscopio a luce trasmessa. Tagliare il blocco tagliato fuori il mozzicone resina rimanenti. Questo viene fatto utilizzando visto una gioielleria ed assicura che solo un piccolo blocco è collocato all'interno del FIB / SEM. L'altezza totale di questo blocco non deve essere superiore a 5 mm. Incollare il blocco di uno stub in alluminio con pasta di carbonio garantire che il lato da acquisire è sul bordo più esterno (Figura 1). Dopo che la colla si è asciugata, rivestire il blocco con un sottile strato di oro (> 20 nm; sistema di aspirazione Cressington evaporazione). 3. Imaging nella FIB / SEM Con un ingrandimento basso, e con elettroni secondari di imaging (5 kV, 0,5 nAmp), orientare il blocco in modo che la regione di interesse e scelto il lato del blocco di essere ripreso sia rivolto verso l'operatore (Figura 2 c, d). Orientare il blocco in modo che la faccia ad essere ripreso è parallelo al fascio di fresatura. Ciò significa che il fascio di elettroni è orientato a 54 ° a questa faccia (Figura 2 b). L'utilizzo di un fascio di ioni di corrente 13-27 nAmps a 30 kV rimuovere una stretta banda di resina dalla parte anteriore della regione da acquisire. Passa alla modalità di imaging retrodiffusi per vedere il volto fresato che sovrasta la regione di interesse. Utilizzando la microscopia a luce immagine di riferimento (presa a passo 16) e l'immagine del volto fresato individuare l'area esatta sul blocco da fresare e ripreso (Figura 2). Depositare uno strato protettivo (circa 1 micron di spessore) di carbonio (o metallo), utilizzando il sistema di iniezione di gas del microscopio, sulla superficie del blocco, al di sopra della regione di interesse (Figura 2). Utilizzando una corrente di 700 picoAmps, mulino finemente la regione del blocco all'interno del quale le immagini finale sarà presa. Lascia il raggio di fresatura a questo mulino completamente volto immagine fino a quando non gli artefatti di fresatura può essere visto sul viso. Un mulino completa del viso è controllato da osservare i cambiamenti in ogni immagine successiva attraverso l'intero campo visivo. Fresatura inadeguato può anche visto come striature bianche o 'tende' apparire Vertically nell'immagine. Lasciare il microscopio per almeno 2 ore per tutte le modifiche termica da smaltire. Questo riduce il rischio che la faccia blocco andrà alla deriva durante l'imaging, con conseguente immagini disallineate. Selezionare i parametri microscopio per l'imaging del viso in serie. Assicurarsi che il fascio di elettroni ha una tensione che è abbastanza basso per l'immagine solo una profondità di materiale a fronte del blocco. Questo dovrebbe anche essere molto meno profonda di quanto lo spessore della faccia da rimuovere. I parametri tipici per l'imaging sono tensioni tra 1,2-2,0 kV con dimensioni in pixel di tra 4 – 20 nm. Il pixel sosta bisogno di tempo per essere mantenuta intorno al 10 μsecs in modo che il tempo totale per macinare il viso e acquisire una sola immagine viene mantenuta sotto i 2 minuti (Figura 3). 4. Segreti del successo Passo 1) Assicurarsi che i campioni non sono più spessi 150 micron. Ciò consentirà un'adeguata penetrazione delle macchie diverse e resina nel materiale. Ciò può essere ottenuto sezionando i campioni con un vibratome subito dopo la fissazione. Questo spessore è appropriato per il tessuto cerebrale. Altri tessuti devono essere testati per garantire adeguato di fissazione e colorazione. Fase 3) I campioni devono essere liberamente distribuiti in tutta la soluzione, e non raggruppate in una parte del flaconcino mentre questo fissativo secondario è introdotto. Questo garantirà la massima penetrazione del campione e di ridurre il campione diventa distorto durante questo processo di fissazione. Questo risultato è ottenuto rimestando delicatamente i campioni all'interno della fiala immediatamente dopo la soluzione è aggiunto. Punto 15) Assicurarsi che la regione di interesse si trova immediatamente sotto (<30 micron) la superficie del blocco. Ciò consentirà di ridurre la quantità di fresatura dal fascio di ioni durante la fase di acquisizione delle immagini. Punto 22) Il tempo di scansione del fascio di ioni deve essere adequte per assicurare che il volto di imaging intero è completamente fresato. Fresatura inadeguata verrà mostrato come striature bianche, o 'tende' che appaiono in verticale lungo il viso di imaging. Punto 26) La faccia finale fresato deve essere più grande il volto che è immaginato. Questo perché la resina fresato viene espulso dal blocco e redeposits sulla superficie del blocco nelle immediate vicinanze. Questo rideposizione può sconfinare in campo dell'imaging di vista, ed è evitata mediante fresatura una zona molto più ampia di quella immaginata. Per una finestra di imaging che è di 20 micron di larghezza, il volto blocco fresato è maggiore di 30 micron di larghezza. Punto 29) E 'fondamentale che i parametri di fascio di elettroni sono tali che l'immagine è generata da elettroni che emergono da solo il nanometri prime della superficie del blocco. Questo è un acheved riducendo al minimo la tensione al di sotto del 2 kV e assicurando che nessun elettrone penetrare troppo in là. Questo è anche aiutato con una tensione di griglia sul rivelatore in modo che solo l'elettrone con le più alte energie contribuire all'immagine finale. Tipicamente, una tensione di 1,3 kV griglia viene utilizzato per una tensione di imaging di 1,5 kV. 5. Rappresentante dei risultati: Figura 1. Preparazione del blocco di resina. A) in resina incorporata sezione coronale (80 micron di spessore) con un cervello di ratto adulto visualizzati in un steromicroscope. L'immagine mostra chiaramente le differenti regioni del cervello che può essere tagliato dalla sezione (b) utilizzando un bisturi. Qui, un 1 mm quadrati dalla corteccia viene rimossa e (c) attaccato ad un blocco di resina bianca. D) Il blocco di resina viene poi tagliato con un coltello di vetro montato in un ultramicrotomo, e una volta che il blocco è stato ridotto a lasciare solo il regione di interesse (e), un passo è tagliata perpendicolarmente alla superficie anteriore del materiale incorporato. f) Tutta questa regione assettato è poi tagliato dal resto della resina e montato su un perno in alluminio pronto per il rivestimento di metallo e di imaging nella microscopio elettronico a scansione. Figura 2. Preparazione del viso blocco per FIB / SEM imaging. A) e b) mostrano le illustrazioni del blocco e il bordo che viene macinato per creare il volto di imaging (indicata con il nero doppia freccia). La posizione del fascio di ioni (bianco) viene mostrata in parallelo alla faccia di imaging, e il fascio di elettroni (grigio) è indicata colpire la faccia a 54 ° rispetto al fascio di ioni. C) mostra una visione del blocco prese con il fascio di elettroni e ripreso con gli elettroni secondari. Lungo questo lato del blocco di una regione più scura (indicata con la scatola bianca punteggiata) mostra una parte del viso che è stato di circa lavorato (mostrato con doppia testatandr freccia nera) per rivelare il campione di fondo. d) Quando questa regione è ripreso solo con gli elettroni retrodiffusi il tessuto incorporato può essere visto. Qui, l'intera larghezza della sezione di tessuto incorporato è indicato con una doppia freccia a due punte bianche. Barra di scala in c) è di 100 micron. Figura 3. Imaging il volume del tessuto cerebrale con voxel isotropico. A) l'immagine invertita retrodiffusi contrasto del blocco che mostra il volto ultrastruttura all'interno di una regione del cervello di ratto. Tutte le membrane sono visibili così come le strutture macromolecolari di grandi dimensioni. B) Un totale di 1600 immagini sono state raccolte in 5 spaziatura nm con un conseguente serie di immagini con voxel isotropico. C) Questa pila può essere ripreso in qualsiasi aereo con la stessa risoluzione. Questa immagine mostra singola connessione sinaptica che è ripreso nel piano xy e il piano yz.