Summary

Verwendung von Ex-vivo-Live-Bildgebung zur Untersuchung von Zellteilungen und -bewegungen während der Zahnerneuerung von Mäusen

Published: October 27, 2023
doi:

Summary

Die Ex-vivo-Live-Bildgebung ist eine leistungsfähige Technik zur Untersuchung der dynamischen Prozesse zellulärer Bewegungen und Interaktionen in lebendem Gewebe. Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die Zwei-Photonen-Mikroskopie implementiert, um dentale Epithelzellen in kultivierten ganzen erwachsenen Mausschneidezähnen live zu verfolgen.

Abstract

Der kontinuierlich wachsende Maus-Schneidezahn entwickelt sich zu einem sehr handhabbaren Modellsystem, um die Regulation adulter epithelialer und mesenchymaler Stammzellen und die Zahnregeneration zu untersuchen. Diese Vorläuferpopulationen teilen, bewegen und differenzieren sich aktiv, um die Gewebehomöostase aufrechtzuerhalten und verlorene Zellen regenerieren. Herkömmliche Analysen mit fixierten Gewebeschnitten konnten jedoch die dynamischen Prozesse zellulärer Bewegungen und Interaktionen nicht erfassen, was unsere Fähigkeit, ihre Regulationsmechanismen zu untersuchen, einschränkte. In dieser Arbeit wird ein Protokoll beschrieben, um ganze Mausschneidezähne in einem Explantatkultursystem zu erhalten und dentale Epithelzellen mit Hilfe von Multiphotonen-Zeitraffermikroskopie live zu verfolgen. Diese Technik ergänzt unseren bestehenden Werkzeugkasten für die zahnmedizinische Forschung und ermöglicht es Forschern, raumzeitliche Informationen über das Verhalten und die Organisation von Zellen in einem lebenden Gewebe zu gewinnen. Wir gehen davon aus, dass diese Methodik den Forschern helfen wird, die Mechanismen weiter zu erforschen, die die dynamischen zellulären Prozesse steuern, die sowohl während der Zahnerneuerung als auch der Zahnregeneration stattfinden.

Introduction

In den letzten zwei Jahrzehnten hat sich der Schneidezahn der Maus zu einer unschätzbaren Plattform für die Erforschung der Prinzipien der Regulation adulter Stammzellen und der Zahnregeneration entwickelt 1,2. Der Schneidezahn der Maus wächst kontinuierlich und erneuert sich während des gesamten Lebens des Tieres. Dies geschieht durch die Erhaltung sowohl epithelialer als auch mesenchymaler Stammzellen, die sich selbst erneuern und in verschiedene Zelltypen des Zahns differenzieren können 1,2. Während aus dentalen Epithelstammzellen Ameloblasten entstehen, die die Schmelzmatrix absondern, entstehen aus dentalen mesenchymalen Stammzellen Odontoblasten, Zementoblasten und Fibroblasten, die Dentin, Zement bzw. Parodontalband bilden 3,4,5,6. Diese konstante Zufuhr neuer Zellen hält die Gewebehomöostase aufrecht und ermöglicht den Ersatz alter Zellen, die durch Kauverschleiß oder Verletzungen verloren gehen 7,8. Die Aufklärung der zellulären und molekularen Mechanismen, die den Erhalt und die Differenzierung von dentalen Stammzellen regulieren, ist daher von zentraler Bedeutung für das Verständnis der Zahnregeneration, einem Bereich von wachsendem Interesse.

Anatomisch gesehen ist ein großer Teil des Schneidezahns der erwachsenen Maus vom Kieferknochen umhüllt. Während die Schneidekante des Zahns freiliegt, passt das apikale Ende des Schneidezahns in eine Alveole und ist über parodontale Bänder und Bindegewebe fest mit dem umgebenden Knochen verbunden (Abbildung 1A,B). Das apikale Ende des Schneidezahns ist auch die Wachstumsregion des Zahns und erhält Zahnstamm- und Vorläuferzellen sowohl in der Epithelschicht als auch in der mesenchymalen Pulpa 9,10,11,12,13. Insbesondere werden dentale Epithelstammzellen am knolligen Ende des Epithels gehalten, der sogenannten apikalen Knospe, die auch als labiale zervikale Schleife bezeichnet wird (Abbildung 1C). Ähnlich wie im Darmepithel und in der Epidermis wird die Epithelerneuerung im Schneidezahn in erster Linie durch aktiv zyklische Stammzellen und ihre hochproliferativen Zwischennachkommen, die sogenannten transitverstärkenden Zellen 14,15,16,17, unterstützt, die sich beide im inneren Teil der Zervixschlinge befinden. Ob das Schneideepithel während der Regeneration ruhende Stammzellen enthält und verwertet, muss jedoch noch geklärt werden. Im Gegensatz dazu wurden sowohl aktive als auch ruhende mesenchymale Stammzellen in der apikalen Pulpa identifiziert, und die ruhenden Stammzellen fungieren als Reservepopulation, die während der Verletzungsreparatur aktiviert wird13,18.

Viele der Entdeckungen über die Biologie der Erneuerung und Regeneration der Schneidezähne von Mäusen sind das Ergebnis histologischer Untersuchungen, bei denen Proben an bestimmten zeitlichen Punkten entnommen, fixiert, verarbeitet und dann entlang einer bestimmten Ebene in mikrometerdünne Scheiben geschnitten werden. Durch die detaillierte Analyse histologischer Schnitte aus verschiedenen Mausmodellen, die eine Rückverfolgung der Abstammungslinie oder genetische Störungen ermöglichen, haben die Wissenschaftler die Zelllinien verschiedener Vorläuferpopulationen sowie die genetischen und Signalwege identifiziert, die die Homöostase der Schneidezähne und die Reparatur von Verletzungen steuern 19,20,21. Die statischen zweidimensionalen (2D) Bilder von nicht-vitalen Zellen in Schnitten können jedoch nicht das gesamte Spektrum zellulärer Verhaltensweisen und räumlicher Organisationen in lebendem Gewebe erfassen, wie z. B. Zellformveränderungen, Bewegungen und zelluläre Kinetik. Das Erkennen und Messen dieser schnellen zellulären Veränderungen, die in einer Zeitskala auftreten, die durch Gewebeschnitte nicht aufgelöst werden kann, erfordert eine andere Strategie. Darüber hinaus ist die Erfassung solcher Informationen auch entscheidend, um zu verstehen, wie Zahnzellen miteinander interagieren, auf verschiedene Signalreize reagieren und sich selbst organisieren, um Gewebestrukturen und -funktionen aufrechtzuerhalten.

Das Aufkommen der vierdimensionalen (4D) Tiefengewebebildgebung mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie22, einer Technologie, die drei räumliche Dimensionen mit zeitlicher Auflösung integriert, überwindet die inhärenten Einschränkungen der histologischen Analyse, indem sie eine raumzeitliche Untersuchung von kultivierten Gewebeexplantaten, Organoiden oder sogar Geweben in situ ermöglicht 23,24,25,26 . Zum Beispiel hat die 4D-Live-Bildgebung des sich entwickelnden Zahnepithels die raumzeitlichen Muster von Zellteilungen und -migrationen enthüllt, die das Gewebewachstum, die Bildung von Signalzentren und die Morphogenese des dentalen Epithels koordinieren 27,28,29,30,31,32. Im Schneidezahn der erwachsenen Maus wurde die 4D-Bildgebung kürzlich angepasst, um das zelluläre Verhalten während der Reparatur von Zahnepithelverletzungen zu untersuchen. Live-Bildgebung zeigte, dass Stratum-Intermedium-Zellen in der suprabasalen Schicht direkt in Ameloblasten in der Basalschicht umgewandelt werden können, um das geschädigte Epithel zu regenerieren, was das traditionelle Paradigma der Reparatur von Epithelverletzungen in Frage stellt15.

Hier beschreiben wir die Dissektion, Kultivierung und Bildgebung des adulten Mausschneidezahns, wobei wir uns auf Epithelzellen in der labialen Zervixschleife konzentrieren (Abbildung 1). Diese Technik bewahrt die Vitalität der Zahnzellen für mehr als 12 Stunden und ermöglicht das Live-Tracking von fluoreszenzmarkierten Zellen mit Einzelzellauflösung. Dieser Ansatz ermöglicht die Untersuchung von Zellbewegungen und -migrationen sowie dynamische Veränderungen der Zellform und Teilungsorientierung unter normalen Kulturbedingungen oder in Reaktionen auf genetische, physikalische und chemische Störungen.

Protocol

Alle Mäuse wurden in pathogenfreien Tiereinrichtungen an der University of California Los Angeles (UCLA) oder der Hebrew University of Jerusalem (HUJI) gehalten. Alle Experimente mit Mäusen wurden gemäß den Vorschriften und Protokollen durchgeführt, die vom jeweiligen Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt wurden (ARC-2019-013; UCLA) oder (MD-23-17184-3; HUJI). Ein allgemeiner Ablauf der Versuchsschritte ist in Abbildung 2A dargestellt. In der Materialtabe…

Representative Results

Die apikale Region des adulten Mausschneidezahns ist vom Unterkiefer umhüllt (Abbildung 1) und daher nicht direkt zugänglich, um die Vorläuferzellen, die sich in der Wachstumsregion befinden, zu visualisieren und live zu verfolgen. Daher haben wir eine Methode entwickelt, um den gesamten Schneidezahn aus dem Kieferknochen zu extrahieren und in einem Explantatkultursystem für die Zwei-Photonen-Zeitraffermikroskopie zu erhalten (Abbildung 2). Hier beschreiben …

Discussion

Die Bildgebung von Live-Gewebe ist eine wichtige Technik, die es uns ermöglicht, die dynamischen Prozesse und Verhaltensweisen von Zellen zu untersuchen, wenn sie in ihrer Nischenumgebung gehalten werden41. Im Idealfall wird die Live-Bildgebung in vivo mit hoher raumzeitlicher Auflösung durchgeführt. Die In-vivo-Bildgebung von Säugetierorganen kann jedoch aufgrund der Unzugänglichkeit des Gewebes, der optischen Undurchsichtigkeit und der Schwierigkeit, das Tier oder das Orga…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken dem UCLA Advanced Light Microscopy/Spectroscopy Laboratory und dem Leica Microsystems Center of Excellence am California NanoSystems Institute (RRID:SCR_022789) für die Bereitstellung von Zwei-Photonen-Mikroskopie. AS wurde durch ISF 604-21 der Israel Science Foundation unterstützt. JH wurde von R03DE030205 und R01DE030471 des NIH/NIDCR unterstützt. AS und JH wurden auch durch Zuschüsse 2021007 der United States-Israel Binational Science Foundation (BSF) unterstützt.

Materials

24 well, flat bottom tissue culture plate Olympus plastics 25-107
25x HC IRAPO motCORR water dipping objective Leica 11507704
Ascorbic acid (Vitamin C) Acros Organics 352685000
D-(+)-Glucose bioxtra  Sigma Aldrich G7528
Delta T system  Bioptechs 0420-4 Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup
Dissection microscope- LEICA S9E Leica LED300 SLI
DMEM/F12 Thermo Scientific 11039047 Basal media without phenol red
Feather surgical blade (#15) Feather 72044-15
Fine forceps F.S.T 11252-23
Glutamax  Thermo Scientific 35050-061 Glutamine substitute
Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective  Leica n/a
low-melting agarose NuSieve 50080
non-essential amino acids (100x) Thermo Scientific 11140-050
penicillin–streptomycin Thermo Scientific 15140122 10,000 U/mL 
Petri dish Gen Clone 32-107G 90 mm 
Rat serum Valley Biomedical AS3061SC Processed for live imaging
Razor blade #9 VWR 55411-050
Scalpel handle F.S.T 10003-12
Scissors F.S.T 37133
serrated forceps F.S.T 11000-13
spring scissors F.S.T 91500-09

References

  1. Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
  2. Jing, J., et al. Rodent incisor as a model to study mesenchymal stem cells in tissue homeostasis and repair. Frontiers in Dental Medicine. 3, 1068494 (2022).
  3. Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and Fgf signaling. Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
  4. Warshawsky, H., Smith, C. E. Morphological classification of rat incisor ameloblasts. The Anatomical Record. 179 (4), 423-445 (1974).
  5. Lekic, P., McCulloch, C. A. Periodontal ligament cell population: the central role of fibroblasts in creating a unique tissue. The Anatomical Record. 245 (2), 327-341 (1996).
  6. Takahashi, A., et al. Autocrine regulation of mesenchymal progenitor cell fates orchestrates tooth eruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (2), 575-580 (2019).
  7. Ness, A. R. Eruption rates of impeded and unimpeded mandibular incisors of the adult laboratory mouse. Archives of Oral Biology. 10 (3), 439-451 (1965).
  8. Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
  9. Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).
  10. Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
  11. Biehs, B., et al. BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nature Cell Biology. 15, 846-852 (2013).
  12. Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
  13. Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
  14. Li, L., Clevers, H. Coexistence of quiescent and active adult stem cells in mammals. Science. 327 (5965), 542-545 (2010).
  15. Sharir, A., et al. A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage. Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).
  16. Hu, J. K. -. H., et al. An FAK-YAP-mTOR signaling axis regulates stem cell-based tissue renewal in mice. Cell Stem Cell. 21 (1), 91-106 (2017).
  17. Yu, F., Li, F., Zheng, L., Ye, L. Epigenetic controls of Sonic hedgehog guarantee fidelity of epithelial adult stem cells trajectory in regeneration. Science Advances. 8 (29), (2022).
  18. An, Z., et al. A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors. Nature Communications. 9 (1), 378 (2018).
  19. Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
  20. Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development. 147 (2), (2020).
  21. Krivanek, J., Buchtova, M., Fried, K., Adameyko, I. Plasticity of dental cell types in development, regeneration, and evolution. Journal of Dental Research. 102 (6), 589-598 (2023).
  22. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  23. Cetera, M., Leybova, L., Joyce, B., Devenport, D. Counter-rotational cell flows drive morphological and cell fate asymmetries in mammalian hair follicles. Nature Cell Biology. 20 (5), 541-552 (2018).
  24. Held, M., Santeramo, I., Wilm, B., Murray, P., Lévy, R. Ex vivo live cell tracking in kidney organoids using light sheet fluorescence microscopy. PLoS ONE. 13 (7), 0199918 (2018).
  25. Mesa, K. R., et al. Homeostatic epidermal stem cell self-renewal is driven by local differentiation. Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).
  26. Mogollón, I., Ahtiainen, L. Live tissue imaging sheds light on cell level events during ectodermal organ development. Frontiers in Physiology. 11, 818 (2020).
  27. Prochazka, J., et al. Migration of founder epithelial cells drives proper molar tooth positioning and morphogenesis. Developmental Cell. 35 (6), 713-724 (2015).
  28. Morita, R., et al. Coordination of cellular dynamics contributes to tooth epithelium deformations. PLOS ONE. 11 (9), 0161336 (2016).
  29. Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
  30. Panousopoulou, E., Green, J. B. A. Invagination of ectodermal placodes is driven by cell intercalation-mediated contraction of the suprabasal tissue canopy. PLoS biology. 14 (3), 1002405 (2016).
  31. Mogollón, I., Moustakas-Verho, J. E., Niittykoski, M., Ahtiainen, L. The initiation knot is a signaling center required for molar tooth development. Development. 148 (9), (2021).
  32. Kim, R., et al. Early perturbation of Wnt signaling reveals patterning and invagination-evagination control points in molar tooth development. Development. 148 (14), 199685 (2021).
  33. Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments JoVE. (90), e51969 (2014).
  34. Katsuragi, Y., et al. Bcl11b transcription factor plays a role in the maintenance of the ameloblast-progenitors in mouse adult maxillary incisors. Mechanisms of Development. 130 (9-10), 482-492 (2013).
  35. Dassule, H. R., Lewis, P., Bei, M., Maas, R., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127 (22), 4775-4785 (2000).
  36. Belteki, G., et al. Conditional and inducible transgene expression in mice through the combinatorial use of Cre-mediated recombination and tetracycline induction. Nucleic Acids Research. 33 (5), 51 (2005).
  37. Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
  38. Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
  39. Kimura, H., Cook, P. R. Kinetics of core histones in living human cells. The Journal of Cell Biology. 153 (7), 1341-1354 (2001).
  40. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology: CB. 8 (7), 377-385 (1998).
  41. Huang, Q., et al. The frontier of live tissue imaging across space and time. Cell Stem Cell. 28 (4), 603-622 (2021).
  42. Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. 34 (11), 1137-1144 (2016).
  43. Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
  44. Li, S., et al. Overview of the reporter genes and reporter mouse models. Animal Models and Experimental. 1 (1), 29-35 (2018).
  45. Mort, R. L., et al. Fucci2a: a bicistronic cell cycle reporter that allows Cre mediated tissue specific expression in mice. Cell Cycle. 13 (17), 2681-2696 (2014).
  46. Krivanek, J., et al. Dental cell type atlas reveals stem and differentiated cell types in mouse and human teeth. Nature Communications. 11 (1), 4816 (2020).
  47. Dailey, M. E., Marrs, G. S., Kurpius, D. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harbor protocols. 2011 (4), (2011).
  48. Gorczyca, W., Bruno, S., Darzynkiewicz, R., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. DNA strand breaks occurring during apoptosis – their early insitu detection by the terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays and prevention by serine protease inhibitors. International Journal of Oncology. 1 (6), 639-648 (1992).
  49. Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
  50. Wale, P. L., Gardner, D. K. Time-lapse analysis of mouse embryo development in oxygen gradients. Reproductive Biomedicine Online. 21 (3), 402-410 (2010).
  51. Tse, H. M., Gardner, G., Dominguez-Bendala, J., Fraker, C. A. The importance of proper oxygenation in 3D culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 634403 (2021).
  52. Spinelli, J. B., et al. Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain. Science. 374 (6572), 1227-1237 (2021).
  53. Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex-vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current Protocols in Cytometry. , (2012).
  54. Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
  55. McCoy, R. J., O’Brien, F. J. Influence of shear stress in perfusion bioreactor cultures for the development of three-dimensional bone tissue constructs: a review. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (6), 587-601 (2010).
  56. Chen, K. D., et al. Mechanotransduction in response to shear stress. Roles of receptor tyrosine kinases, integrins, and Shc. The Journal of Biological Chemistry. 274 (26), 18393-18400 (1999).
  57. Seddiqi, H., et al. Inlet flow rate of perfusion bioreactors affects fluid flow dynamics, but not oxygen concentration in 3D-printed scaffolds for bone tissue engineering: Computational analysis and experimental validation. Computers in Biology and Medicine. 124, 103826 (2020).

Play Video

Cite This Article
Sundari Thooyamani, A., Shahin, E., Takano, S., Sharir, A., Hu, J. K. Using Ex Vivo Live Imaging to Investigate Cell Divisions and Movements During Mouse Dental Renewal. J. Vis. Exp. (200), e66020, doi:10.3791/66020 (2023).

View Video