Uso de imágenes en vivo ex vivo para investigar las divisiones celulares y los movimientos durante la renovación dental del ratón

En las últimas dos décadas, el incisivo de ratón se ha convertido en una plataforma inestimable para investigar los principios de la regulación de las células madre adultas y la regeneración dental ^1,2. El incisivo del ratón crece continuamente y se renueva a lo largo de la vida del animal. Lo hace mediante el mantenimiento de células madre epiteliales y mesenquimales, que pueden autorrenovarse y diferenciarse en diferentes tipos de células del diente ^1,2. Mientras que las células madre epiteliales dentales dan lugar a los ameloblastos, que secretan la matriz del esmalte, las células madre mesenquimales dentales dan lugar a odontoblastos, cementoblastos y fibroblastos, que forman la dentina, el cemento y el ligamento periodontal, respectivamente 3,4,5,6. Este suministro constante de nuevas células mantiene la homeostasis tisular y permite la reposición de células viejas que se pierden debido al desgaste masticatorio o a las lesiones ^7,8. Por lo tanto, dilucidar los mecanismos celulares y moleculares que regulan el mantenimiento y la diferenciación de las células madre dentales es fundamental para comprender la regeneración dental, un área de creciente interés.

Anatómicamente, una gran parte del incisivo del ratón adulto está encerrada en la mandíbula. Mientras el borde incisal del diente está expuesto, el extremo apical del incisivo encaja dentro de un alvéolo y está firmemente unido al hueso circundante a través de los ligamentos periodontales y los tejidos conectivos (Figura 1A, B). El extremo apical del incisivo es también la región de crecimiento del diente y mantiene las células madre y progenitoras dentales tanto en la capa epitelial como en la pulpa mesenquimal 9,10,11,12,13. Específicamente, las células madre epiteliales dentales se mantienen en el extremo bulboso del epitelio, conocido como yema apical, también conocida como asa cervical labial (Figura 1C). Al igual que el epitelio intestinal y la epidermis, la renovación epitelial en el incisivo se apoya principalmente en el ciclo activo de las células madre y sus descendientes intermedios altamente proliferativos, llamados células amplificadoras de tránsito 14,15,16,17, ambas residiendo en la parte interna del asa cervical. Sin embargo, aún no se ha determinado si el epitelio incisivo contiene y utiliza células madre quiescentes durante la regeneración. Por el contrario, se han identificado células madre mesenquimales dentales activas y quiescentes en la pulpa apical, y las células madre quiescentes funcionan como una población de reserva que se activa durante la reparación de la lesión^13,18.

Muchos de los descubrimientos sobre la biología de la renovación y regeneración de los incisivos del ratón han sido el resultado de investigaciones histológicas, en las que las muestras se obtienen en distintas coyunturas temporales, se fijan, se procesan y luego se seccionan en rodajas de una micra de espesor a lo largo de un plano particular. A través de un análisis detallado de secciones histológicas de diferentes modelos de ratón que permiten el rastreo de linajes o perturbaciones genéticas, los científicos han identificado los linajes celulares de diferentes poblaciones de progenitores, así como las vías genéticas y de señalización que controlan la homeostasis de los incisivos y la reparación de lesiones 19,20,21. Sin embargo, las imágenes estáticas bidimensionales (2D) de células no vitales en secciones no pueden capturar el espectro completo de comportamientos celulares y organizaciones espaciales en el tejido vivo, como los cambios en la forma de las células, los movimientos y la cinética celular. Detectar y medir estos cambios celulares rápidos, que ocurren en una escala de tiempo que no se puede resolver a través del corte de tejidos, requiere una estrategia diferente. Además, la adquisición de dicha información también es fundamental para comprender cómo las células dentales interactúan entre sí, reaccionan a diferentes estímulos de señalización y se autoorganizan para mantener las estructuras y funciones de los tejidos.

El advenimiento de la obtención de imágenes de tejidos profundos en cuatro dimensiones (4D) mediante microscopía de dos fotones²², una tecnología que integra tres dimensiones espaciales con resolución temporal, supera las limitaciones inherentes al análisis histológico al permitir el examen espaciotemporal de explantes de tejidos cultivados, organoides o incluso tejidos in situ 23,24,25,26 . Por ejemplo, las imágenes en vivo en 4D del epitelio dental en desarrollo han revelado los patrones espacio-temporales de las divisiones celulares y las migraciones que coordinan el crecimiento del tejido, la formación del centro de señalización y la morfogénesis epitelial dental 27,28,29,30,31,32. En el incisivo de ratón adulto, las imágenes 4D se han adaptado recientemente para estudiar los comportamientos celulares durante la reparación de lesiones epiteliales dentales. Las imágenes en vivo revelaron que las células del estrato intermedio en la capa suprabasal pueden convertirse directamente en ameloblastos en la capa basal para regenerar el epitelio dañado, desafiando el paradigma tradicional de reparación de lesiones epiteliales¹⁵.

Aquí, describimos la disección, el cultivo y la obtención de imágenes del incisivo de ratón adulto, centrándonos en las células epiteliales del asa cervical labial (Figura 1). Esta técnica preserva la vitalidad de las células dentales durante más de 12 h y permite el seguimiento en vivo de las células marcadas con fluorescencia a una resolución de una sola célula. Este enfoque permite investigar el movimiento y la migración celular, así como los cambios dinámicos en la forma celular y la orientación de la división en condiciones normales de cultivo, o en respuestas a perturbaciones genéticas, físicas y químicas.