שימוש בהדמיה חיה של Ex Vivo כדי לחקור חלוקות תאים ותנועות במהלך חידוש שיניים של עכבר

במהלך שני העשורים האחרונים, החותכת לעכבר התפתחה כפלטפורמה רבת ערך לחקר עקרונות ויסות תאי גזע בוגרים והתחדשות שיניים ^1,2. החותכת לעכבר גדלה ברציפות ומתחדשת לאורך כל חיי החיה. הוא עושה זאת על ידי שמירה על תאי גזע אפיתל ומזנכימליים, אשר יכולים לחדש את עצמם ולהתמיין לסוגי תאים שונים של השן ^1,2. בעוד שתאי גזע אפיתליאליים דנטליים מולידים אמלובלסטים, המפרישים את מטריצת האמייל, תאי גזע מזנכימליים דנטליים מולידים אודונטובלסטים, צמנטובלסטים ופיברובלסטים, היוצרים דנטין, צמנטום ורצועה חניכית, בהתאמה 3,4,5,6. אספקה קבועה זו של תאים חדשים שומרת על הומאוסטזיס רקמות ומאפשרת החלפה של תאים ישנים שאבדו עקב שחיקה או פציעות ^7,8. הבהרת המנגנונים התאיים והמולקולריים המווסתים את התחזוקה וההתמיינות של תאי גזע דנטליים היא אפוא מרכזית להבנת התחדשות השיניים, תחום בעל עניין הולך וגובר.

מבחינה אנטומית, חלק גדול מהחותכת של העכבר הבוגר עטוף בעצם הלסת. בזמן שהקצה החתך של השן חשוף, הקצה האפי של החותכת נכנס לתוך שקע ומחובר היטב לעצם שמסביב דרך רצועות חניכיים ורקמות חיבור (איור 1A,B). הקצה האפי של החותך הוא גם אזור הצמיחה של השן ושומר על תאי גזע ואב דנטליים הן בשכבת האפיתל והן במוך השן 9,10,11,12,13. באופן ספציפי, תאי גזע אפיתליאליים דנטליים נשמרים בקצה הבולבוסי של האפיתל, הידוע בשם ניצן אפיקלי, המכונה גם לולאה צווארית שפתיים (איור 1C). בדומה לאפיתל המעי ולאפידרמיס, חידוש האפיתל בחותכת נתמך בעיקר על ידי מחזור פעיל של תאי גזע וצאצאיהם המתווכים המתרבים מאוד, הנקראים תאים מגבירי מעבר 14,15,16,17, שניהם שוכנים בחלק הפנימי של לולאת צוואר הרחם. עם זאת, עדיין לא ברור אם אפיתל החותך מכיל ומשתמש בתאי גזע שקטים במהלך ההתחדשות. לעומת זאת, במוך השן זוהו תאי גזע מזנכימליים דנטליים פעילים ושקטים כאחד, ותאי הגזע השקטים מתפקדים כאוכלוסיית מילואים המופעלת במהלך תיקון פציעה^13,18.

רבות מהתגליות על הביולוגיה של ההתחדשות וההתחדשות של החותכות בעכבר נבעו מחקירות היסטולוגיות, שבהן הדגימות מתקבלות בצמתים זמניים נפרדים, מקובעות, מעובדות ואז נחתכות לפרוסות דקות מיקרון לאורך מישור מסוים. באמצעות ניתוח מפורט של קטעים היסטולוגיים ממודלים שונים של עכברים המאפשרים מעקב אחר שושלות או הפרעות גנטיות, מדענים זיהו את שושלות התאים של אוכלוסיות אבות שונות, כמו גם את המסלולים הגנטיים והאיתות השולטים בהומאוסטזיס חותך ותיקון פציעות ^19,20,21. עם זאת, התמונות הדו-ממדיות (דו-ממדיות) הסטטיות של תאים לא חיוניים במקטעים אינן יכולות ללכוד את הספקטרום המלא של התנהגויות תאיות וארגונים מרחביים ברקמה חיה, כגון שינויים בצורת התא, תנועות וקינטיקה תאית. זיהוי ומדידה של שינויים תאיים מהירים אלה, המתרחשים בקנה מידה של ציר זמן שאינו ניתן לפתרון באמצעות חתך רקמות, דורשים אסטרטגיה שונה. יתר על כן, רכישת מידע כזה היא גם קריטית להבנת האופן שבו תאים דנטליים מתקשרים זה עם זה, מגיבים לגירויי איתות שונים ומתארגנים בעצמם כדי לשמור על מבנים ותפקודים של רקמות.

הופעתו של דימות רקמות עמוק ארבע-ממדי (4D) באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני²², טכנולוגיה המשלבת שלושה ממדים מרחביים עם רזולוציה טמפורלית, מתגברת על המגבלות המובנות של ניתוח היסטולוגי בכך שהיא מאפשרת בדיקה מרחבית-זמנית של צמחי רקמה בתרבית, אורגנואידים או אפילו רקמות באתרן 23,24,25,26 . לדוגמה, הדמיה חיה 4D של אפיתל השן המתפתח חשפה את הדפוסים המרחביים-זמניים של חלוקות תאים ונדידה המתאמים צמיחת רקמות, היווצרות מרכזי איתות ומורפוגנזה אפיתל דנטלי 27,28,29,30,31,32. בחותך עכבר בוגר, הותאמה לאחרונה הדמיה 4D לחקר התנהגויות תאיות במהלך תיקון פגיעה באפיתל דנטלי. הדמיה חיה גילתה כי תאים בין-בינוניים בשכבה העל-בסיסית יכולים להיות מומרים ישירות לאמלובלסטים בשכבת הבסיס כדי לחדש את האפיתל הפגוע, מה שמאתגר את הפרדיגמה המסורתית של תיקון פגיעה אפיתל¹⁵.

כאן אנו מתארים את הדיסקציה, ההתרבות וההדמיה של חותך העכבר הבוגר, תוך התמקדות בתאי אפיתל בלולאה הצווארית העבתית (איור 1). טכניקה זו משמרת את חיוניות תאי השיניים למשך יותר מ-12 שעות ומאפשרת מעקב חי אחר תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי ברזולוציה של תא יחיד. גישה זו מאפשרת לחקור את תנועת התא ונדידתו, כמו גם שינויים דינמיים בצורת התא ובכיוון החלוקה בתנאי תרבית רגילים, או בתגובות להפרעות גנטיות, פיזיקליות וכימיות.