استخدام التصوير الحي خارج الجسم الحي للتحقيق في انقسامات الخلايا وحركاتها أثناء تجديد أسنان الفأر
Summary
التصوير الحي خارج الجسم الحي هو تقنية قوية لدراسة العمليات الديناميكية للحركات الخلوية والتفاعلات في الأنسجة الحية. هنا ، نقدم بروتوكولا ينفذ الفحص المجهري ثنائي الفوتون لتتبع الخلايا الظهارية السنية الحية في قواطع الفئران البالغة المستزرعة.
Abstract
تظهر قاطعة الفأر المتنامية باستمرار كنظام نموذجي قابل للتتبع للغاية للتحقيق في تنظيم الخلايا الجذعية الظهارية والوسيطة البالغة وتجديد الأسنان. تنقسم هذه المجموعات السلفية وتتحرك وتتمايز بنشاط للحفاظ على توازن الأنسجة وتجديد الخلايا المفقودة بطريقة سريعة الاستجابة. ومع ذلك ، فإن التحليلات التقليدية باستخدام أقسام الأنسجة الثابتة لا يمكن أن تلتقط العمليات الديناميكية للحركات والتفاعلات الخلوية ، مما يحد من قدرتنا على دراسة لوائحها. تصف هذه الورقة بروتوكولا للحفاظ على قواطع الفئران الكاملة في نظام زراعة النباتات والخلايا الظهارية السنية الحية باستخدام المجهر متعدد الفوتونات. تضيف هذه التقنية إلى مجموعة أدواتنا الحالية لأبحاث الأسنان وتسمح للمحققين بالحصول على معلومات زمانية مكانية حول سلوكيات الخلايا ومنظماتها في الأنسجة الحية. نتوقع أن تساعد هذه المنهجية الباحثين على استكشاف الآليات التي تتحكم في العمليات الخلوية الديناميكية التي تحدث أثناء تجديد الأسنان وتجديدها.
Introduction
على مدى العقدين الماضيين ، برزت قاطعة الماوس كمنصة لا تقدر بثمن للتحقيق في مبادئ تنظيم الخلايا الجذعية البالغة وتجديد الأسنان 1,2. تنمو قاطعة الفأر باستمرار وتجدد نفسها طوال حياة. يقوم بذلك عن طريق الحفاظ على كل من الخلايا الجذعية الظهارية والوسيطة ، والتي يمكن أن تتجدد ذاتيا وتتمايز إلى أنواع مختلفة من خلايا السن 1,2. في حين أن الخلايا الجذعية الظهارية السنية تؤدي إلى ظهور الأرومات المينائية ، التي تفرز مصفوفة المينا ، فإن الخلايا الجذعية الوسيطة السنية تؤدي إلى ظهور الأرومات السنية ، والأرومات الأسمنتية ، والخلايا الليفية ، والتي تشكل العاج ، والملاط ، والرباط اللثوي ، على التوالي3،4،5،6. يحافظ هذا الإمداد المستمر للخلايا الجديدة على توازن الأنسجة ويسمح باستبدال الخلايا القديمة المفقودة بسبب تآكل المضغ أو الإصابات 7,8. لذلك فإن توضيح الآليات الخلوية والجزيئية التي تنظم صيانة وتمايز الخلايا الجذعية السنية أمر أساسي لفهم تجديد الأسنان ، وهو مجال يحظى باهتمام متزايد.
تشريحيا ، يتم تغليف جزء كبير من قاطعة الفأر البالغة في عظم الفك. أثناء تعرض الحافة القاطعة للسن ، فإن الطرف القمي للقواطع يتناسب مع التجويف ويتم ربطه بقوة بالعظم المحيط من خلال أربطة اللثة والأنسجة الضامة (الشكل 1 أ ، ب). النهاية القمية للقواطع هي أيضا منطقة نمو السن وتحافظ على جذع الأسنان والخلايا السلفية في كل من الطبقة الظهارية ولب اللحمة المتوسطة9،10،11،12،13. على وجه التحديد ، يتم الحفاظ على الخلايا الجذعية الطلائية السنية في الطرف المنتفخ من الظهارة ، والمعروفة باسم البرعم القمي ، والتي يشار إليها أيضا باسم حلقة عنق الرحم الشفوية (الشكل 1C). على غرار ظهارة الأمعاء والبشرة ، يتم دعم التجديد الظهاري في القاطعة بشكل أساسي من خلال تدوير الخلايا الجذعية بنشاط وأحفادها الوسيطة التكاثرية للغاية ، والتي تسمى خلايا تضخيم العبور14،15،16،17 ، وكلاهما مقيم في الجزء الداخلي من حلقة عنق الرحم. ومع ذلك ، لا يزال يتعين تحديد ما إذا كانت ظهارة القواطع تحتوي على خلايا جذعية هادئة وتستخدمها أثناء التجديد. في المقابل ، تم تحديد كل من الخلايا الجذعية الوسيطة السنية النشطة والهادئة في اللب القمي ، وتعمل الخلايا الجذعية الهادئة كمجموعة احتياطية يتم تنشيطها أثناء إصلاح الإصابة13,18.
نتجت العديد من الاكتشافات حول بيولوجيا تجديد وتجديد قاطعة الفأر عن التحقيقات النسيجية ، حيث يتم الحصول على عينات في منعطفات زمنية متميزة ، وتثبيتها ، ومعالجتها ، ثم تقسيمها إلى شرائح رقيقة ميكرون على طول مستوى معين. من خلال التحليل التفصيلي للأقسام النسيجية من نماذج الفئران المختلفة التي تمكن من تتبع النسب أو الاضطرابات الجينية ، حدد العلماء سلالات الخلايا لمختلف مجموعات السلف ، بالإضافة إلى المسارات الجينية والإشارات التي تتحكم في توازن القواطع وإصلاح الإصابات19،20،21. ومع ذلك ، فإن الصور الثابتة ثنائية الأبعاد (2D) للخلايا غير الحيوية في الأقسام لا يمكنها التقاط مجموعة كاملة من السلوكيات الخلوية والمنظمات المكانية في الأنسجة الحية ، مثل تغيرات شكل الخلية والحركات والحركية الخلوية. يتطلب اكتشاف وقياس هذه التغيرات الخلوية السريعة ، والتي تحدث في نطاق زمني غير قابل للحل من خلال تقسيم الأنسجة ، استراتيجية مختلفة. علاوة على ذلك ، يعد الحصول على مثل هذه المعلومات أمرا بالغ الأهمية أيضا لفهم كيفية تفاعل خلايا الأسنان مع بعضها البعض ، والتفاعل مع محفزات الإشارات المختلفة ، والتنظيم الذاتي للحفاظ على هياكل الأنسجة ووظائفها.
إن ظهور التصوير العميق للأنسجة رباعي الأبعاد (4D) باستخدام المجهر ثنائي الفوتون22 ، وهي تقنية تدمج ثلاثة أبعاد مكانية مع الدقة الزمنية ، يتغلب على القيود المتأصلة في التحليل النسيجي من خلال تمكين الفحص الزماني المكاني لنباتات الأنسجة المستزرعة أو المواد العضوية أو حتى الأنسجة في الموقع23،24،25،26. على سبيل المثال ، كشف التصوير الحي 4D لظهارة الأسنان النامية النقاب عن الأنماط الزمانية المكانية لانقسامات الخلايا والهجرات التي تنسق نمو الأنسجة ، وتشكيل مركز الإشارات ، وتشكل ظهارة الأسنان27،28،29،30،31،32. في قاطعة الفئران البالغة ، تم تكييف التصوير 4D مؤخرا لدراسة السلوكيات الخلوية أثناء إصلاح إصابة الأسنان الظهارية. كشف التصوير الحي أن الخلايا البينية للطبقة في الطبقة فوق القاعدية يمكن تحويلها مباشرة إلى أرومات المينائية في الطبقة القاعدية لتجديد الظهارة التالفة ، مما يتحدى النموذج التقليدي لإصلاح الإصابات الظهارية15.
هنا ، نصف تشريح وزراعة وتصوير قاطعة الفئران البالغة ، مع التركيز على الخلايا الظهارية في حلقة عنق الرحم الشفوية (الشكل 1). تحافظ هذه التقنية على حيوية خلايا الأسنان لأكثر من 12 ساعة وتسمح بالتتبع المباشر للخلايا ذات العلامات الفلورية بدقة خلية واحدة. يسمح هذا النهج بالتحقيق في حركة الخلية وهجرتها بالإضافة إلى التغيرات الديناميكية في شكل الخلية واتجاه الانقسام في ظل ظروف الثقافة العادية ، أو في الاستجابات للاضطرابات الجينية والفيزيائية والكيميائية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يعد تصوير الأنسجة الحية تقنية مهمة تسمح لنا بدراسة العمليات والسلوكيات الديناميكية للخلايا عند الحفاظ عليها في بيئتها المتخصصة41. من الناحية المثالية ، يتم إجراء التصوير المباشر في الجسم الحي بدقة مكانية زمانية عالية. ومع ذلك ، يمكن أن يكون التصوير في الجسم الحي لأع…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نحن نعترف بمختبر الفحص المجهري / الطيفي المتقدم بجامعة كاليفورنيا في لوس أنجلوس ومركز التميز Leica Microsystems في معهد كاليفورنيا للأنظمة النانوية (RRID: SCR_022789) لتوفير مجهر ثنائي الفوتون. تم دعم AS من قبل ISF 604-21 من مؤسسة العلوم الإسرائيلية. تم دعم JH من قبل R03DE030205 و R01DE030471 من المعاهد الوطنية للصحة / NIDCR. كما تم دعم AS و JH من خلال 2021007 المنح من مؤسسة العلوم ثنائية القومية بين الولايات المتحدة وإسرائيل (BSF).
Materials
| 24 well, flat bottom tissue culture plate | Olympus plastics | 25-107 | |
| 25x HC IRAPO motCORR water dipping objective | Leica | 11507704 | |
| Ascorbic acid (Vitamin C) | Acros Organics | 352685000 | |
| D-(+)-Glucose bioxtra | Sigma Aldrich | G7528 | |
| Delta T system | Bioptechs | 0420-4 | Including temperature control, culture dishes, and perfusion setup |
| Dissection microscope- LEICA S9E | Leica | LED300 SLI | |
| DMEM/F12 | Thermo Scientific | 11039047 | Basal media without phenol red |
| Feather surgical blade (#15) | Feather | 72044-15 | |
| Fine forceps | F.S.T | 11252-23 | |
| Glutamax | Thermo Scientific | 35050-061 | Glutamine substitute |
| Leica SP8-DIVE equipped with a 25X HC IRAPO motCORR water dipping objective | Leica | n/a | |
| low-melting agarose | NuSieve | 50080 | |
| non-essential amino acids (100x) | Thermo Scientific | 11140-050 | |
| penicillin–streptomycin | Thermo Scientific | 15140122 | 10,000 U/mL |
| Petri dish | Gen Clone | 32-107G | 90 mm |
| Rat serum | Valley Biomedical | AS3061SC | Processed for live imaging |
| Razor blade #9 | VWR | 55411-050 | |
| Scalpel handle | F.S.T | 10003-12 | |
| Scissors | F.S.T | 37133 | |
| serrated forceps | F.S.T | 11000-13 | |
| spring scissors | F.S.T | 91500-09 |
References
- Yu, T., Volponi, A. A., Babb, R., An, Z., Sharpe, P. T. Stem cells in tooth development, growth, repair, and regeneration. Current Topics in Developmental Biology. 115, 187-212 (2015).
- Jing, J., et al. Rodent incisor as a model to study mesenchymal stem cells in tissue homeostasis and repair. Frontiers in Dental Medicine. 3, 1068494 (2022).
- Harada, H., et al. Localization of putative stem cells in dental epithelium and their association with Notch and Fgf signaling. Journal of Cell Biology. 147 (1), 105-120 (1999).
- Warshawsky, H., Smith, C. E. Morphological classification of rat incisor ameloblasts. The Anatomical Record. 179 (4), 423-445 (1974).
- Lekic, P., McCulloch, C. A. Periodontal ligament cell population: the central role of fibroblasts in creating a unique tissue. The Anatomical Record. 245 (2), 327-341 (1996).
- Takahashi, A., et al. Autocrine regulation of mesenchymal progenitor cell fates orchestrates tooth eruption. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (2), 575-580 (2019).
- Ness, A. R. Eruption rates of impeded and unimpeded mandibular incisors of the adult laboratory mouse. Archives of Oral Biology. 10 (3), 439-451 (1965).
- Smith, C. E., Warshawsky, H. Cellular renewal in the enamel organ and the odontoblast layer of the rat incisor as followed by radioautography using 3H-thymidine. The Anatomical Record. 183 (4), 523-561 (1975).
- Seidel, K., et al. Hedgehog signaling regulates the generation of ameloblast progenitors in the continuously growing mouse incisor. Development. 137 (22), 3753-3761 (2010).
- Juuri, E., et al. Sox2+ stem cells contribute to all epithelial lineages of the tooth via Sfrp5+ progenitors. Developmental Cell. 23 (2), 317-328 (2012).
- Biehs, B., et al. BMI1 represses Ink4a/Arf and Hox genes to regulate stem cells in the rodent incisor. Nature Cell Biology. 15, 846-852 (2013).
- Feng, J., Mantesso, A., De Bari, C., Nishiyama, A., Sharpe, P. T. Dual origin of mesenchymal stem cells contributing to organ growth and repair. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (16), 6503-6508 (2011).
- Zhao, H., et al. Secretion of shh by a neurovascular bundle niche supports mesenchymal stem cell homeostasis in the adult mouse incisor. Cell Stem Cell. 14 (2), 160-173 (2014).
- Li, L., Clevers, H. Coexistence of quiescent and active adult stem cells in mammals. Science. 327 (5965), 542-545 (2010).
- Sharir, A., et al. A large pool of actively cycling progenitors orchestrates self-renewal and injury repair of an ectodermal appendage. Nature Cell Biology. 21 (9), 1102-1112 (2019).
- Hu, J. K. -. H., et al. An FAK-YAP-mTOR signaling axis regulates stem cell-based tissue renewal in mice. Cell Stem Cell. 21 (1), 91-106 (2017).
- Yu, F., Li, F., Zheng, L., Ye, L. Epigenetic controls of Sonic hedgehog guarantee fidelity of epithelial adult stem cells trajectory in regeneration. Science Advances. 8 (29), (2022).
- An, Z., et al. A quiescent cell population replenishes mesenchymal stem cells to drive accelerated growth in mouse incisors. Nature Communications. 9 (1), 378 (2018).
- Balic, A., Thesleff, I. Tissue interactions regulating tooth development and renewal. Current Topics in Developmental Biology. 115, 157-186 (2015).
- Yu, T., Klein, O. D. Molecular and cellular mechanisms of tooth development, homeostasis and repair. Development. 147 (2), (2020).
- Krivanek, J., Buchtova, M., Fried, K., Adameyko, I. Plasticity of dental cell types in development, regeneration, and evolution. Journal of Dental Research. 102 (6), 589-598 (2023).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Cetera, M., Leybova, L., Joyce, B., Devenport, D. Counter-rotational cell flows drive morphological and cell fate asymmetries in mammalian hair follicles. Nature Cell Biology. 20 (5), 541-552 (2018).
- Held, M., Santeramo, I., Wilm, B., Murray, P., Lévy, R. Ex vivo live cell tracking in kidney organoids using light sheet fluorescence microscopy. PLoS ONE. 13 (7), 0199918 (2018).
- Mesa, K. R., et al. Homeostatic epidermal stem cell self-renewal is driven by local differentiation. Cell Stem Cell. 23 (5), 677-686 (2018).
- Mogollón, I., Ahtiainen, L. Live tissue imaging sheds light on cell level events during ectodermal organ development. Frontiers in Physiology. 11, 818 (2020).
- Prochazka, J., et al. Migration of founder epithelial cells drives proper molar tooth positioning and morphogenesis. Developmental Cell. 35 (6), 713-724 (2015).
- Morita, R., et al. Coordination of cellular dynamics contributes to tooth epithelium deformations. PLOS ONE. 11 (9), 0161336 (2016).
- Ahtiainen, L., Uski, I., Thesleff, I., Mikkola, M. L. Early epithelial signaling center governs tooth budding morphogenesis. The Journal of Cell Biology. 214 (6), 753-767 (2016).
- Panousopoulou, E., Green, J. B. A. Invagination of ectodermal placodes is driven by cell intercalation-mediated contraction of the suprabasal tissue canopy. PLoS biology. 14 (3), 1002405 (2016).
- Mogollón, I., Moustakas-Verho, J. E., Niittykoski, M., Ahtiainen, L. The initiation knot is a signaling center required for molar tooth development. Development. 148 (9), (2021).
- Kim, R., et al. Early perturbation of Wnt signaling reveals patterning and invagination-evagination control points in molar tooth development. Development. 148 (14), 199685 (2021).
- Takahashi, M., Makino, S., Kikkawa, T., Osumi, N. Preparation of rat serum suitable for mammalian whole embryo culture. Journal of Visualized Experiments JoVE. (90), e51969 (2014).
- Katsuragi, Y., et al. Bcl11b transcription factor plays a role in the maintenance of the ameloblast-progenitors in mouse adult maxillary incisors. Mechanisms of Development. 130 (9-10), 482-492 (2013).
- Dassule, H. R., Lewis, P., Bei, M., Maas, R., McMahon, A. P. Sonic hedgehog regulates growth and morphogenesis of the tooth. Development. 127 (22), 4775-4785 (2000).
- Belteki, G., et al. Conditional and inducible transgene expression in mice through the combinatorial use of Cre-mediated recombination and tetracycline induction. Nucleic Acids Research. 33 (5), 51 (2005).
- Tumbar, T., et al. Defining the epithelial stem cell niche in skin. Science. 303 (5656), 359-363 (2004).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Kimura, H., Cook, P. R. Kinetics of core histones in living human cells. The Journal of Cell Biology. 153 (7), 1341-1354 (2001).
- Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Current Biology: CB. 8 (7), 377-385 (1998).
- Huang, Q., et al. The frontier of live tissue imaging across space and time. Cell Stem Cell. 28 (4), 603-622 (2021).
- Skylaki, S., Hilsenbeck, O., Schroeder, T. Challenges in long-term imaging and quantification of single-cell dynamics. Nature Biotechnology. 34 (11), 1137-1144 (2016).
- Knoblich, J. A. Mechanisms of asymmetric stem cell division. Cell. 132 (4), 583-597 (2008).
- Li, S., et al. Overview of the reporter genes and reporter mouse models. Animal Models and Experimental. 1 (1), 29-35 (2018).
- Mort, R. L., et al. Fucci2a: a bicistronic cell cycle reporter that allows Cre mediated tissue specific expression in mice. Cell Cycle. 13 (17), 2681-2696 (2014).
- Krivanek, J., et al. Dental cell type atlas reveals stem and differentiated cell types in mouse and human teeth. Nature Communications. 11 (1), 4816 (2020).
- Dailey, M. E., Marrs, G. S., Kurpius, D. Maintaining live cells and tissue slices in the imaging setup. Cold Spring Harbor protocols. 2011 (4), (2011).
- Gorczyca, W., Bruno, S., Darzynkiewicz, R., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. DNA strand breaks occurring during apoptosis – their early insitu detection by the terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays and prevention by serine protease inhibitors. International Journal of Oncology. 1 (6), 639-648 (1992).
- Aguilera-Castrejon, A., et al. Ex utero mouse embryogenesis from pre-gastrulation to late organogenesis. Nature. 593 (7857), 119-124 (2021).
- Wale, P. L., Gardner, D. K. Time-lapse analysis of mouse embryo development in oxygen gradients. Reproductive Biomedicine Online. 21 (3), 402-410 (2010).
- Tse, H. M., Gardner, G., Dominguez-Bendala, J., Fraker, C. A. The importance of proper oxygenation in 3D culture. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 634403 (2021).
- Spinelli, J. B., et al. Fumarate is a terminal electron acceptor in the mammalian electron transport chain. Science. 374 (6572), 1227-1237 (2021).
- Johnson, S., Rabinovitch, P. Ex-vivo imaging of excised tissue using vital dyes and confocal microscopy. Current Protocols in Cytometry. , (2012).
- Combs, C. A., Shroff, H. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Current Protocols in Neuroscience. 79, 1-25 (2017).
- McCoy, R. J., O’Brien, F. J. Influence of shear stress in perfusion bioreactor cultures for the development of three-dimensional bone tissue constructs: a review. Tissue Engineering. Part B, Reviews. 16 (6), 587-601 (2010).
- Chen, K. D., et al. Mechanotransduction in response to shear stress. Roles of receptor tyrosine kinases, integrins, and Shc. The Journal of Biological Chemistry. 274 (26), 18393-18400 (1999).
- Seddiqi, H., et al. Inlet flow rate of perfusion bioreactors affects fluid flow dynamics, but not oxygen concentration in 3D-printed scaffolds for bone tissue engineering: Computational analysis and experimental validation. Computers in Biology and Medicine. 124, 103826 (2020).
