Genetisk kodede calciumindikatorer (GECI) muliggør en robust analyse på populationsniveau af sensorisk neuronsignalering. Her har vi udviklet en ny tilgang, der giver mulighed for in vivo GECI-visualisering af rottetrigeminusganglier neuronaktivitet.
Genetisk kodede calciumindikatorer (GECI’er) muliggør billeddannelsesteknikker til overvågning af ændringer i intracellulært calcium i målrettede cellepopulationer. Deres store signal-støj-forhold gør GECI’er til et kraftfuldt værktøj til at detektere stimulusfremkaldt aktivitet i sensoriske neuroner. GECI’er letter analyse på populationsniveau af stimuluskodning med antallet af neuroner, der kan studeres samtidigt. Denne populationskodning udføres mest hensigtsmæssigt in vivo. Dorsalrodsganglier (DRG), som huser soma af sensoriske neuroner, der inderverer somatiske og viscerale strukturer under nakken, bruges mest til in vivo-billeddannelse , fordi disse strukturer er relativt let tilgængelige. For nylig blev denne teknik brugt i mus til at studere sensoriske neuroner i trigeminusganglion (TG), der inderverer orale og kraniofaciale strukturer. Der er mange grunde til at studere TG ud over DRG, herunder den lange liste over smertesyndromer, der er specifikke for orale og kraniofaciale strukturer, der synes at afspejle ændringer i sensorisk neuronaktivitet, såsom trigeminusneuralgi. Mus bruges mest i undersøgelsen af DRG- og TG-neuroner på grund af tilgængeligheden af genetiske værktøjer. Men med forskelle i størrelse, nem håndtering og potentielt vigtige artsforskelle er der grund til at studere rotter frem for muse-TG-neuroner. Således udviklede vi en tilgang til billeddannelse af rotte-TG-neuroner in vivo. Vi injicerede neonatale hvalpe (p2) intraperitonealt med en AAV-kodning GCaMP6’er, hvilket resulterede i >90% infektion af både TG- og DRG-neuroner. TG blev visualiseret hos den voksne efter kraniotomi og dekortikation, og ændringer i GCaMP6s fluorescens blev overvåget i TG-neuroner efter stimulering af mandibulære og maksillære områder i ansigtet. Vi bekræftede, at stigninger i fluorescens blev stimulusfremkaldt med perifer nerveblok. Selvom denne tilgang har mange potentielle anvendelser, bruger vi den til at karakterisere underpopulationen (e) af TG-neuroner, der er ændret efter perifer nerveskade.
Somatosensation, den neurale kodning af mekaniske, termiske og kemiske stimuli, der påvirker huden eller andre kropslige strukturer, herunder muskler, knogler og indvolde, starter med aktivitet i primære afferente neuroner, der inderverer disse strukturer1. Enkeltenhedsbaserede elektrofysiologiske tilgange har givet et væld af oplysninger om de afferente undertyper, der er involveret i denne proces, samt hvordan deres stimulus-responsegenskaber kan ændre sig over tid 1,2,3. Mens der stadig er stærke beviser til støtte for den mærkede linjeteori, hvilket tyder på, at specifikke sensoriske modaliteter formidles af specifikke subpopulationer af neuroner, antyder mange underpopulationers evne til at reagere på de samme typer mekaniske, termiske og kemiske stimuli, at størstedelen af somatosensoriske stimuli er kodet af flere underpopulationer af neuroner4, 5. Således vil en bedre forståelse af somatosensation kun komme med evnen til at studere aktiviteten af 10’erne, hvis ikke hundredvis, af neuroner samtidigt.
Fremskridt inden for optiske tilgange med den relativt nylige fremkomst af konfokale og efterfølgende multifoton- og digitale billeddannelsesteknikker har lettet evnen til at udføre relativt ikke-invasive analyser på populationsniveau af neuronal aktivitet 6,7. En af de sidste forhindringer i anvendelsen af denne teknologi har været udviklingen af værktøjer til at muliggøre optisk vurdering af neural aktivitet. I betragtning af hastigheden af et handlingspotentiale, der kan starte og slutte på mindre end et millisekund, ville et spændingsfølsomt farvestof med kapacitet til at følge ændringer i membranpotentiale med hastigheden af et handlingspotentiale være det ideelle værktøj til dette formål. Men mens der har været enorme fremskridt på dette område 7,8,9,10, er signal-støj-forholdet for mange af disse farvestoffer stadig ikke helt højt nok til at muliggøre en befolkningsanalyse af hundredvis af neuroner på enkeltcelleniveau. Som en alternativ tilgang har efterforskere vendt sig til at overvåge ændringer i intracellulær Ca2+ koncentration ([Ca2+]i). Begrænsningerne med denne strategi har været klare fra starten og inkluderer det faktum, at en stigning i [Ca2+]i er et indirekte mål for neural aktivitet11; at en stigning i [Ca2+]i kan forekomme uafhængigt af Ca2+ tilstrømning i forbindelse med aktivering af spændingsstyrede Ca2+ kanaler (VGCC’er)12,13; at størrelsen og varigheden af enCa2+-transient kan styres ved processer, der er uafhængige af VGCC-aktivitet 11,12,14; og at tidsforløbet for Ca2+ transienter langt overstiger tidsforløbet for et aktionspotentiale15. Ikke desto mindre er der en række væsentlige fordele forbundet med brugen af Ca2+ som et indirekte mål for neural aktivitet. Ikke mindst signal-støj-forholdet forbundet med de fleste Ca2+ indikatorer, hvilket afspejler både størrelsen af ændringen i intracellulær Ca2+ og det faktum, at signalet stammer fra cytosolens tredimensionelle rum snarere end cellemembranens todimensionelle rum. Med udviklingen af genetisk kodede Ca2+-indikatorer (GECI’er) er det desuden muligt at drage fordel af genetiske strategier til at drive ekspressionen af Ca2+-indikatorerne i specifikke subpopulationer af celler, hvilket letter analyser på populationsniveau i intakte præparater (f.eks. se16).
I betragtning af antallet af genetiske værktøjer, der nu er tilgængelige i mus, bør det ikke være nogen overraskelse, at GECI’er er blevet brugt mest i denne art. Muselinjer med konstitutiv GECI-ekspression i subpopulationer af sensoriske neuroner er blevet udviklet 7,16,17. Med udviklingen af muselinjer, der udtrykker rekombinaser i specifikke celletyper, er det muligt at bruge endnu mere sofistikerede strategier til at kontrollere GECI-ekspression15. Men selvom disse værktøjer er stadig mere kraftfulde, er der en række grunde til, at andre arter, såsom rotter, kan være mere passende til nogle eksperimentelle spørgsmål. Disse omfatter den større størrelse, hvilket letter en række eksperimentelle manipulationer, der er vanskelige, hvis ikke umulige, i den mindre mus; den lette træning af rotter i relativt komplekse adfærdsmæssige opgaver; og i det mindste nogle tegn på, at biofysiske egenskaber og ekspressionsmønstre for flere ionkanaler i rottesensoriske neuroner kan være mere lig den, der observeres i humane sensoriske neuroner, end de samme kanaler i mus i forhold til den menneskelige18.
Mens transduktionen af somatosensoriske stimuli generelt forekommer i de perifere terminaler af primære afferenter, skal handlingspotentialet initieret i periferien passere gennem strukturen, der huser primær afferent somata, kaldet dorsal rod (DRG) eller trigeminale (TG) ganglier, inden de når centralnervesystemet19. Mens der er tegn på, at ikke alle handlingspotentialer, der formerer sig langs en primær afferent axon, vil invadere cellelegemet20, en konsekvens af det faktum, at den primære afferente somata er forbundet med den vigtigste afferente axon via et T-kryds19, synes størstedelen af handlingspotentialer initieret i periferien at invadere soma21. Dette giver tre eksperimentelle fordele ved anvendelse af GECI’er til at vurdere populationskodning i primære afferenter: den store størrelse af cellelegemet i forhold til axonerne øger signalet til støj yderligere, når [Ca2+]i anvendes som et indirekte mål for afferent aktivitet; DRG er generelt let tilgængelige; Og vurdering af aktivitet på et sted, der er rumligt fjernt fra de afferente terminaler, minimerer den potentielle virkning af operationen, der er nødvendig for at udsætte ganglierne på stimulus-responsegenskaberne hos de afferente terminaler. Men fordi TG er placeret under hjernen (eller over paletten), er de langt vanskeligere at få adgang til end DRG. Selvom der er mange ligheder mellem DRG- og TG-neuroner, er der også en voksende liste over forskelle. Dette inkluderer den omtrent somatotopiske organisering af neuroner i TG22, unikke strukturer innerveret, forskellige centrale terminale termineringsmønstre 23,24,25,26 og nu en voksende liste over forskelle i både genekspression27,28 og funktionel receptorekspression29. Derudover, fordi vi er interesserede i identifikation af perifere smertemekanismer, antyder det relativt store antal smertesyndromer, der synes at være unikke for trigeminussystemet (fx migræne, trigeminusneuralgi, brændende mundsyndrom), der synes at involvere afvigende aktivitet i primære afferenter 30,31,32, at TG skal undersøges direkte.
Mens stimulus-respons-egenskaber af TG-neuroner er blevet undersøgt med GECI’er i mus16, fordi årsagerne ovenfor tyder på, at rotten kan være en mere passende art til at løse en række eksperimentelle spørgsmål, var formålet med denne undersøgelse at udvikle en tilgang til at bruge GECI’er til at studere TG-neuroner hos rotten. For at opnå dette brugte vi en viral tilgang til at drive ekspressionen af GECI GCaMP6’erne i det perifere nervesystem. Vi fjernede derefter forhjernen for at give adgang til TG. Endelig blev mekaniske og termiske stimuli påført ansigtet, mens neuronale reaktioner blev vurderet under fluorescerende mikroskopi. Sammen understøtter disse data en rolle for at bruge rotten til at undersøge ændringer i TG under mange stater og udvide værktøjssættet til efterforskere, der er interesseret i sensorisk kodning i trigeminussystemet.
Her demonstrerer vi en hurtig, ikke-invasiv måde at generere en GECI-rotte til billeddannelse af TG. Vi valgte en CAG-promotor til at drive og opretholde høje niveauer af genekspression. Mens tidligere undersøgelser tyder på, at andre AAV-serotyper effektivt kan drive genekspression i DRG-neuroner39, er vores resultater i overensstemmelse med en nylig undersøgelse, der involverer intraperitoneal injektion af AAV hos nyfødte32, hvilket indikerer, at AAV9-serotypen er y…
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Dr. Kathy Albers og Brian Davis for brugen af deres Leica Microscope and Metamorph-program, Charles Warwick for at hjælpe med at bygge vores termiske Peltier-enhed og Dr. Raymond Sekula for at hjælpe med fejlfinding af den kirurgiske forberedelse. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health: F31NS125993 (JYG), T32NS073548 (JYG) og R01NS122784 (MSG og RS).
AAV9-CAG-WPRE-GCaMP6s-SV40 | Addgene | 100844-AAV9 | AAV9-GCaMP6s virus |
ACEpromazine maleate | Covetrus | 11695-0095-5 | 10 mg/mL |
AnaSed (Xylazine) injection | AKORN Animal Health | 23076-35-9 | 20 mg/mL |
CTR5500 Electronics box | Leica | 11 888 820 | Power Supply |
Cutwell burr drill bit | Ransom & Randolph | ¼ round | |
DM 6000 FS | Leica | 11 888 928 | Base Stand |
EL6000 | Leica | EL6000 | Light source with 120 W mercury bulb |
Forceps | FST | 11252-00 | Dumont No. 05 |
Friedman rongeurs | FST | 16000-14 | 2.5 mm cup size |
Friedman-Pearson rongeurs | FST | 16021-14 | 1 mm cup size |
Heating pad (Temperature therapy pad) | STRYKER | 8002-062-022 | |
Ketamine hydrochloride | Covetrus | 1695-0703-1 | 100 mg/mL |
Plan Fluor 20x/0.40 | Leica | MRH00105 | 20x objective, 0.4 NA10.8 mm WD |
Power handle high-temp cautery pen | Bovie | HIT1 | handheld Change-A-Tip cautery pen |
Prime 95B | Photometrics | Prime 95B | CMOS Camera |
Saline | Fisher Scientific | NC0291799 | 0.9% Sterile Saline |
Scalpel blade | Fisher Scientific | 22-079-701 | size 15 disposable blade |
Spatula | BRI | 48-1460 | brain spatula |
Spring scissors | FST | 91500-09 | Student Vannas, 5 mm cutting edge |
Spring scissors | FST | 15012-12 | Noyes, 14 mm cutting edge |
STP6000 Smart touch panel | Leica | 11 501 255 | Control Panel |
Syringe | Hamilton | 80201 | 25 μL Model 1702 Luer Tip syringe |
Water heater | Adroit | HTP-1500 |