In-Vivo Imagerie calcique des neurones sensoriels dans le ganglion trijumeau du rat

La somatosensation, c’est-à-dire l’encodage neuronal des stimuli mécaniques, thermiques et chimiques qui affectent la peau ou d’autres structures corporelles, y compris les muscles, les os et les viscères, commence par l’activité des neurones afférents primaires qui innervent^{ces structures.} Les approches électrophysiologiques basées sur une seule unité ont fourni une mine d’informations sur les sous-types afférents impliqués dans ce processus ainsi que sur la façon dont leurs propriétés stimulus-réponses peuvent changer au fil du temps ^1,2,3. Cependant, bien qu’il reste des preuves solides à l’appui de la théorie des lignes marquées, qui suggère que des modalités sensorielles spécifiques sont véhiculées par une ou plusieurs sous-populations spécifiques de neurones, la capacité de nombreuses sous-populations de neurones à répondre aux mêmes types de stimuli mécaniques, thermiques et chimiques suggère que la majorité des stimuli somatosensoriels sont codés par plusieurs sous-populations de neurones^{4, 5}. Le Ainsi, une meilleure compréhension de la somatosensation ne viendra qu’avec la capacité d’étudier l’activité de 10, voire de centaines, de neurones simultanément.

Les progrès des approches optiques avec l’avènement relativement récent des techniques d’imagerie confocale et, par la suite, multiphotonique et numérique ont facilité la capacité d’effectuer des analyses relativement non invasives de l’activité neuronale à l’échelle de la population ^6,7. L’un des derniers obstacles à l’application de cette technologie a été le développement d’outils permettant l’évaluation optique de l’activité neuronale. Compte tenu de la vitesse d’un potentiel d’action qui peut commencer et se terminer en moins d’une milliseconde, un colorant sensible à la tension ayant la capacité de suivre les changements de potentiel membranaire à la vitesse d’un potentiel d’action serait l’outil idéal à cet effet. Mais bien qu’il y ait eu d’énormes progrès dans ce domaine 7,8,9,10, le rapport signal/bruit pour beaucoup de ces colorants n’est pas encore assez élevé pour permettre une analyse de population de centaines de neurones au niveau d’une seule cellule. Comme approche alternative, les chercheurs se sont tournés vers la surveillance des changements dans la concentration intracellulaire de Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i). Les limites de cette stratégie sont claires dès le départ et comprennent le fait qu’une augmentation de [Ca²⁺]_i est une mesure indirecte de l’activité neuronale¹¹ ; qu’une augmentation de [Ca²⁺]_i peut se produire indépendamment de l’afflux de Ca²⁺ associé à l’activation des canaux Ca²⁺ voltage-dépendants (VGCC)^12,13 ; que l’amplitude et la durée d’un transitoire de Ca²⁺ peuvent être contrôlées par des processus indépendants de l’activité du VGCC 11,12,14 ; et que l’évolution temporelle des transitoires Ca²⁺ dépasse de loin celle d’un potentiel d’action¹⁵. Néanmoins, il existe un certain nombre d’avantages significatifs associés à l’utilisation du Ca²⁺ comme mesure indirecte de l’activité neuronale. Le rapport signal/bruit associé à la plupart des indicateurs de Ca²⁺ n’est pas le moindre, reflétant à la fois l’ampleur du changement de Ca²⁺ intracellulaire et le fait que le signal provient de l’espace tridimensionnel du cytosol plutôt que de l’espace bidimensionnel de la membrane cellulaire. De plus, avec le développement d’indicateurs de Ca²⁺ codés génétiquement (GECI), il est possible de tirer parti de stratégies génétiques pour stimuler l’expression des indicateurs de Ca²⁺ dans des sous-populations spécifiques de cellules, facilitant ainsi les analyses au niveau de la population dans des préparations intactes (voir par exemple, voir¹⁶).

Compte tenu du nombre d’outils génétiques maintenant disponibles chez la souris, il n’est pas surprenant que les GECI aient été les plus largement utilisés chez cette espèce. Des lignées de souris avec une expression constitutive de GECI dans des sous-populations de neurones sensoriels ont été développées ^7,16,17. Avec le développement de lignées de souris exprimant des recombinases dans des types cellulaires spécifiques, il est possible d’utiliser des stratégies encore plus sophistiquées pour contrôler l’expression de GECI¹⁵. Cependant, bien que ces outils soient de plus en plus puissants, il existe un certain nombre de raisons pour lesquelles d’autres espèces, telles que les rats, pourraient être plus appropriées pour certaines questions expérimentales. Il s’agit notamment de la plus grande taille, facilitant un certain nombre de manipulations expérimentales qui sont difficiles, voire impossibles, chez la souris plus petite ; la facilité d’entraîner les rats à des tâches comportementales relativement complexes ; et au moins quelques preuves que les propriétés biophysiques et les modèles d’expression de plusieurs canaux ioniques dans les neurones sensoriels du rat peuvent être plus similaires à ceux observés dans les neurones sensoriels humains que ne le sont les mêmes canaux chez la souris par rapport à l’homme¹⁸.

Alors que la transduction des stimuli somatosensoriels se produit généralement dans les terminaisons périphériques des afférences primaires, le potentiel d’action initié à la périphérie doit passer à travers la structure qui abrite les somates afférents primaires, appelés ganglions de la racine dorsale (DRG) ou du trijumeau (TG) avant d’atteindre le système nerveux central¹⁹. Bien qu’il existe des preuves que tous les potentiels d’action se propageant le long d’un axone afférent primaire n’envahiront pas le corps cellulaire²⁰, conséquence du fait que les somata afférents primaires sont connectés à l’axone afférent principal via une jonction en T¹⁹, la majorité des potentiels d’action initiés à la périphérie semblent envahir le soma²¹. Cela confère trois avantages expérimentaux lors de l’utilisation de GECI pour évaluer le codage de population dans les afférences primaires : la grande taille du corps cellulaire par rapport aux axones augmente encore le rapport signal/bruit lors de l’utilisation de [Ca²⁺]_i comme mesure indirecte de l’activité afférente ; les DRG sont généralement faciles d’accès ; et l’évaluation de l’activité sur un site éloigné dans l’espace des terminaisons afférentes minimise l’impact potentiel de la chirurgie nécessaire pour exposer les ganglions sur les propriétés stimulus-réponse des terminaisons afférentes. Cependant, comme les TG sont situés sous le cerveau (ou au-dessus de la palette), ils sont beaucoup plus difficiles d’accès que les DRG. De plus, bien qu’il existe de nombreuses similitudes entre les neurones DRG et TG, il existe également une liste croissante de différences. Cela inclut l’organisation grossièrement somatotopique des neurones dans le TG²², des structures uniques innervées, différents modèles de terminaison terminale centrale 23,24,25,26, et maintenant une liste croissante de différences dans l’expression des gènes^27,28 et l’expression des récepteurs fonctionnels²⁹. De plus, parce que nous nous intéressons à l’identification des mécanismes périphériques de la douleur, le nombre relativement élevé de syndromes douloureux qui semblent être uniques au système trijumeau (par exemple, migraine, névralgie du trijumeau, syndrome de la bouche brûlante) qui semblent impliquer une activité aberrante dans les afférences primaires 30,31,32, suggère que le TG doit être étudié directement.

Ainsi, bien que les propriétés stimulus-réponse des neurones TG aient été étudiées avec des GECI chez la souris¹⁶, parce que les raisons énumérées ci-dessus suggèrent que le rat pourrait être une espèce plus appropriée pour répondre à une variété de questions expérimentales, le but de la présente étude était de développer une approche pour utiliser les GECI pour étudier les neurones TG chez le rat. Pour y parvenir, nous avons utilisé une approche virale pour piloter l’expression des GECI GCaMP6 dans le système nerveux périphérique. Nous avons ensuite retiré le cerveau antérieur pour permettre l’accès au TG. Enfin, des stimuli mécaniques et thermiques ont été appliqués au visage tandis que les réponses neuronales ont été évaluées par microscopie à fluorescence. Ensemble, ces données soutiennent un rôle dans l’utilisation du rat pour étudier les changements dans le TG dans de nombreux États, élargissant ainsi la boîte à outils pour les chercheurs intéressés par le codage sensoriel dans le système trijumeau.