En vivo Imágenes de calcio de las neuronas sensoriales en el ganglio trigémino de la rata

La somatosensación, la codificación neuronal de estímulos mecánicos, térmicos y químicos que inciden en la piel u otras estructuras corporales, incluidos los músculos, los huesos y las vísceras, comienza con la actividad de las neuronas aferentes primarias que inervan^{estas estructuras}. Los enfoques electrofisiológicos basados en una sola unidad han proporcionado una gran cantidad de información sobre los subtipos aferentes involucrados en este proceso, así como sobre cómo sus propiedades de estímulo-respuesta pueden cambiar con el tiempo ^1,2,3. Sin embargo, aunque sigue habiendo pruebas sólidas que apoyan la teoría de las líneas marcadas, que sugiere que las modalidades sensoriales específicas son transmitidas por subpoblaciones específicas de neuronas, la capacidad de muchas subpoblaciones de neuronas para responder a los mismos tipos de estímulos mecánicos, térmicos y químicos sugiere que la mayoría de los estímulos somatosensoriales están codificados por múltiples subpoblaciones de^{neuronas. 5}. Por lo tanto, una mejor comprensión de la somatosensación solo vendrá con la capacidad de estudiar la actividad de 10, si no cientos, de neuronas simultáneamente.

Los avances en los enfoques ópticos con el advenimiento relativamente reciente de las técnicas de imagen confocal y, posteriormente, multifotónica y digital, han facilitado la capacidad de realizar análisis de^{la actividad} neuronal a nivel poblacional relativamente no invasivos ^6,7. Uno de los últimos obstáculos en la aplicación de esta tecnología ha sido el desarrollo de herramientas que permitan la evaluación óptica de la actividad neuronal. Dada la velocidad de un potencial de acción que puede comenzar y terminar en menos de un milisegundo, un colorante sensible al voltaje con la capacidad de seguir los cambios en el potencial de membrana a la velocidad de un potencial de acción sería la herramienta ideal para este propósito. Pero si bien ha habido un tremendo progreso en esta área 7,8,9,10, la relación señal-ruido para muchos de estos colorantes aún no es lo suficientemente alta como para permitir un análisis poblacional de cientos de neuronas a nivel de una sola célula. Como enfoque alternativo, los investigadores han recurrido a la monitorización de los cambios en la concentración intracelular de Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i). Las limitaciones de esta estrategia han sido claras desde el principio e incluyen el hecho de que un aumento de [Ca²⁺]_i es una medida indirecta de la actividad neuronal¹¹; que puede ocurrir un aumento de [Ca²⁺]_i independientemente de la afluencia de Ca²⁺ asociada con la activación de canales de Ca²⁺ dependientes de voltaje (VGCC)^12,13; que la magnitud y duración de un transitorio de Ca²⁺ puede ser controlada por procesos independientes de la actividad VGCC 11,12,14; y que el curso temporal de los transitorios de Ca²⁺ supera con creces el de un potencial de acción¹⁵. Sin embargo, hay una serie de ventajas significativas asociadas con el uso de Ca²⁺ como medida indirecta de la actividad neuronal. No menos importante es la relación señal-ruido asociada con la mayoría de los indicadores de Ca²⁺, que refleja tanto la magnitud del cambio en el Ca²⁺ intracelular como el hecho de que la señal surge del espacio tridimensional del citosol en lugar del espacio bidimensional de la membrana celular. Además, con el desarrollo de indicadores de Ca²⁺ codificados genéticamente (GECI), es posible aprovechar las estrategias genéticas para impulsar la expresión de los indicadores de Ca²⁺ en subpoblaciones específicas de células, lo que facilita los análisis a nivel poblacional en preparaciones intactas (por ejemplo, ver¹⁶).

Dada la cantidad de herramientas genéticas disponibles en ratones, no debería sorprender que las GECI se hayan utilizado más ampliamente en esta especie. Se han desarrollado líneas de ratón con expresión constitutiva de GECI en subpoblaciones de neuronas sensoriales ^7,16,17. Con el desarrollo de líneas de ratón que expresan recombinasas en tipos celulares específicos, es posible utilizar estrategias aún más sofisticadas para controlar la expresión de GECI¹⁵. Sin embargo, aunque estas herramientas son cada vez más poderosas, hay una serie de razones por las que otras especies, como las ratas, podrían ser más apropiadas para algunas preguntas experimentales. Estos incluyen el tamaño más grande, lo que facilita una serie de manipulaciones experimentales que son difíciles, si no imposibles, en el ratón más pequeño; la facilidad para entrenar a las ratas en tareas conductuales relativamente complejas; y al menos alguna evidencia de que las propiedades biofísicas y los patrones de expresión de varios canales iónicos en las neuronas sensoriales de rata pueden ser más similares a los observados en las neuronas sensoriales humanas que los mismos canales en ratones en relación con los humanos¹⁸.

Mientras que la transducción de estímulos somatosensoriales ocurre generalmente en las terminales periféricas de las aferencias primarias, el potencial de acción iniciado en la periferia debe pasar a través de la estructura que alberga los somas aferentes primarios, denominados ganglios de la raíz dorsal (DRG) o del trigémino (TG) antes de llegar al sistema nervioso central¹⁹. Si bien existe evidencia de que no todos los potenciales de acción que se propagan a lo largo de un axón aferente primario invadirán el cuerpo celular²⁰, como consecuencia del hecho de que los somas aferentes primarios están conectados al axón aferente principal a través de una unión en T¹⁹, la mayoría de los potenciales de acción iniciados en la periferia parecen invadir el soma²¹. Esto confiere tres ventajas experimentales cuando se utilizan GECIs para evaluar la codificación de la población en aferencias primarias: el gran tamaño del cuerpo celular en relación con los axones aumenta aún más la señal a ruido cuando se utiliza [Ca²⁺]_i como medida indirecta de la actividad aferente; los DRG son generalmente de fácil acceso; y la evaluación de la actividad en un sitio que está espacialmente alejado de las terminales aferentes minimiza el impacto potencial de la cirugía necesaria para exponer los ganglios en las propiedades de estímulo-respuesta de las terminales aferentes. Sin embargo, debido a que los TG se encuentran debajo del cerebro (o por encima de la paleta), son mucho más difíciles de acceder que los DRG. Además, si bien hay muchas similitudes entre las neuronas DRG y TG, también hay una lista creciente de diferencias. Esto incluye la organización más o menos somatotópica de las neuronas en el TG²², estructuras únicas inervadas, diferentes patrones de terminación terminal central 23,24,25,26, y ahora una lista creciente de diferencias tanto en la expresión génica^27,28 como en la expresión del receptor funcional²⁹. Además, debido a que estamos interesados en la identificación de los mecanismos periféricos del dolor, el número relativamente grande de síndromes de dolor que parecen ser exclusivos del sistema trigémino (p. ej., migraña, neuralgia del trigémino, síndrome de boca ardiente) que parecen involucrar actividad aberrante en las aferencias primarias 30,31,32, sugiere que el TG necesita ser estudiado directamente.

Por lo tanto, si bien las propiedades de estímulo-respuesta de las neuronas TG se han estudiado con GECI en el ratón¹⁶, debido a que las razones enumeradas anteriormente sugieren que la rata puede ser una especie más apropiada para abordar una variedad de preguntas experimentales, el propósito del presente estudio fue desarrollar un enfoque para usar GECI para estudiar las neuronas TG en la rata. Para lograr esto, utilizamos un enfoque viral para impulsar la expresión de los GECI GCaMP6s en el sistema nervioso periférico. A continuación, extirpamos el prosencéfalo para permitir el acceso al TG. Finalmente, se aplicaron estímulos mecánicos y térmicos en la cara mientras se evaluaban las respuestas neuronales bajo microscopía fluorescente. En conjunto, estos datos respaldan el papel de la utilización de la rata para investigar los cambios en el TG en muchos estados, ampliando el conjunto de herramientas para los investigadores interesados en la codificación sensorial en el sistema trigémino.