Summary

Imaging del calcio nel collicolo superiore del topo

Published: April 21, 2023
doi:

Summary

Questo protocollo descrive in dettaglio la procedura per l’imaging delle risposte del calcio nel collicolo superiore (SC) dei topi svegli, compreso l’imaging dell’attività di un singolo neurone con microscopia a due fotoni, lasciando intatta la corteccia nei topi wild-type, e l’imaging dell’intero SC con microscopia ad ampio campo nei topi mutanti a corteccia parziale.

Abstract

Il collicolo superiore (SC), una struttura del mesencefalo evolutivamente conservata in tutti i vertebrati, è il centro visivo più sofisticato prima dell’emergere della corteccia cerebrale. Riceve input diretti da ~30 tipi di cellule gangliari retiniche (RGC), ognuna delle quali codifica una specifica caratteristica visiva. Rimane incerto se il SC erediti semplicemente le caratteristiche retiniche o se si verifichi un’elaborazione aggiuntiva e potenzialmente de novo nel SC. Per rivelare la codifica neurale delle informazioni visive nel SC, forniamo qui un protocollo dettagliato per registrare otticamente le risposte visive con due metodi complementari nei topi svegli. Un metodo utilizza la microscopia a due fotoni per visualizzare l’attività del calcio a una risoluzione a singola cellula senza ablare la corteccia sovrapposta, mentre l’altro utilizza la microscopia ad ampio campo per visualizzare l’intero SC di un topo mutante la cui corteccia è in gran parte non sviluppata. Questo protocollo descrive in dettaglio questi due metodi, tra cui la preparazione dell’animale, l’iniezione virale, l’impianto della placca testa, l’impianto del tappo, l’acquisizione dei dati e l’analisi dei dati. I risultati rappresentativi mostrano che l’imaging del calcio a due fotoni rivela risposte neuronali evocate visivamente a una risoluzione a singola cellula e l’imaging del calcio ad ampio campo rivela l’attività neurale in tutto il SC. Combinando questi due metodi, si può rivelare la codifica neurale nel SC su scale diverse, e tale combinazione può essere applicata anche ad altre regioni del cervello.

Introduction

Il collicolo superiore (SC) è un importante centro visivo in tutti i vertebrati. Nei mammiferi, riceve input diretti dalla retina e dalla corteccia visiva1. Mentre la registrazione ottica è stata ampiamente applicata alla corteccia 2,3,4,5, la sua applicazione nel SC è ostacolata da scarsi accessi ottici 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18,19. L’obiettivo di questo protocollo è quello di fornire dettagli su due metodi complementari per la registrazione ottica dell’attività neurale nel SC.

L’SC si trova sotto la corteccia e il seno trasverso, il che limita l’accesso ottico ai neuroni collicolari. Un approccio per superare questa limitazione è quello di aspirare la corteccia sovrapposta ed esporre il SC antero-laterale 7,9,10,13,14,19. Tuttavia, poiché il SC riceve input corticali, tale operazione potrebbe influenzare il modo in cui i neuroni SC rispondono agli stimoli visivi. Per ovviare a questa limitazione, descriviamo qui un protocollo alternativo per visualizzare lo strato superficiale del SC posteriore-mediale con un tappo di silicio, lasciando intatta la corteccia 8,11. In particolare, per ottenere una risoluzione a singola cellula, abbiamo applicato la microscopia a due fotoni per visualizzare le risposte del calcio nel SC posteriore-mediale di topi wild-type. Inoltre, per ottenere un’ampia copertura, abbiamo applicato la microscopia ad ampio campo per visualizzare l’intero SC di un topo mutante la cui corteccia posteriore non si è sviluppata20.

I due metodi descritti in questo protocollo sono complementari l’uno all’altro. L’imaging del calcio a due fotoni senza ablazione della corteccia è appropriato per registrare l’attività neurale a risoluzione di una singola cellula con input corticali intatti. L’imaging del calcio ad ampio campo è appropriato per registrare l’attività neurale nell’intero SC sacrificando la risoluzione spaziale.

Protocol

Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite in conformità con le linee guida sul benessere degli animali e approvate dall’IACUC presso l’Istituto cinese per la ricerca sul cervello di Pechino. NOTA: La tempistica per questo protocollo è la seguente: 1) fare la ventosa; 2) iniettare il virus; 3) impiantare la placca portatestina; 4) dopo 3 settimane, impiantare il tappo; 5) Dopo un recupero di ~ 3 giorni e l’assuefazione sul tapis roulant, eseguire l’imaging a due fotoni/ad ampio camp…

Representative Results

Le figure 1A,B mostrano come realizzare rispettivamente la ventosa e i tappi. La Figura 2 mostra come impiantare correttamente la spina. Dopo aver impiantato il tappo, l’SC posteriore-mediale viene esposto, come mostrato nella Figura 2D. La Figura 3 mostra le risposte del calcio dei neuroni SC da un esempio di topo wild-type ripreso utilizzando la microscopia a due fotoni. Il prisma tri…

Discussion

Passaggi critici del protocollo
La fase più critica è la craniotomia nelle fasi 5.2 e 5.3. Innanzitutto, l’osso a 0,5 mm dietro la lambda è spesso e ha vasi sanguigni all’interno, che possono causare sanguinamento durante il processo di perforazione. Deve essere preparata un’adeguata schiuma di gel per fermare l’emorragia. In secondo luogo, c’è una buona probabilità di angioressi quando si rimuove l’osso appena sopra il seno trasverso. Per la risoluzione dei problemi, un approccio alternativo con…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (32271060). Y.-t.L. progettò la ricerca, eseguì l’esperimento, analizzò i dati e scrisse il manoscritto. Z.L. e R.W. eseguirono l’esperimento.

Materials

16x objective Nikon
50-mm lens Computar M5018-MP2
5-mm coverslip Warner instruments CS-5R
bandpass filter Chroma Technology HQ575/250 m-2p
butyl cyanoacrylate Vetbond, World Precision Instruments
camera for monitoring pupil FLIR BFS-U3-04S2M-CS
camera for widefield imaging Basler acA2000-165µm
corona treater Electro-Technic Products BD-20AC
dichroic Chroma Technology T600/200dcrb 
galvanometers Cambridge Technology
glass bead sterilizer RWD RS1502
microdrill RWD 78001
micromanipulator Sutter Instruments QUAD
photomultiplier tube Hamamatsu R3896
rotory encoder USdigital MA3-A10-125-N
self-curing dental adhesive resin cement  SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan
thermostatic heating pad  RWD 69020
Ti:Sapphire laser Spectra-Physics Mai Tai HP DeepSee
translucent silicone adhesive  Kwik-Sil, World Precision Instruments
treadmill Xinglin Biology
Virus Strains
rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Animals
C57BL/6J wild type Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Emx1-Cre The Jackson Laboratory  5628
Pals1flox/wt Christopher A. Walsh Lab
Software
ImageJ NIH Image
Labview National Instruments
MATLAB Mathworks

References

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Cite This Article
Li, Z., Wu, R., Li, Y. Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus. J. Vis. Exp. (194), e65181, doi:10.3791/65181 (2023).

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