Summary

Imagerie calcique dans le colliculus supérieur de souris

Published: April 21, 2023
doi:

Summary

Ce protocole détaille la procédure d’imagerie des réponses calciques dans le colliculus supérieur (SC) des souris éveillées, y compris l’imagerie de l’activité d’un seul neurone avec la microscopie à deux photons tout en laissant le cortex intact chez les souris de type sauvage, et l’imagerie de l’ensemble du SC avec la microscopie à grand champ chez les souris mutantes à cortex partiel.

Abstract

Le colliculus supérieur (SC), une structure du mésencéphale conservée au cours de l’évolution chez tous les vertébrés, est le centre visuel le plus sophistiqué avant l’émergence du cortex cérébral. Il reçoit des entrées directes de ~30 types de cellules ganglionnaires rétiniennes (RGC), chacune codant pour une caractéristique visuelle spécifique. Il reste difficile de savoir si le CS hérite simplement des caractéristiques rétiniennes ou si un traitement supplémentaire et potentiellement de novo se produit dans le CS. Pour révéler le codage neuronal de l’information visuelle dans le SC, nous fournissons ici un protocole détaillé pour enregistrer optiquement les réponses visuelles avec deux méthodes complémentaires chez les souris éveillées. Une méthode utilise la microscopie à deux photons pour imager l’activité du calcium à une seule résolution cellulaire sans ablation du cortex superposé, tandis que l’autre utilise la microscopie à grand champ pour imager l’ensemble du SC d’une souris mutante dont le cortex est en grande partie sous-développé. Ce protocole détaille ces deux méthodes, y compris la préparation des animaux, l’injection virale, l’implantation de la plaque de tête, l’implantation du bouchon, l’acquisition de données et l’analyse des données. Les résultats représentatifs montrent que l’imagerie calcique à deux photons révèle des réponses neuronales évoquées visuellement à une résolution unicellulaire, et que l’imagerie calcique à grand champ révèle une activité neuronale dans l’ensemble du SC. En combinant ces deux méthodes, on peut révéler le codage neuronal dans le CS à différentes échelles, et une telle combinaison peut également être appliquée à d’autres régions du cerveau.

Introduction

Le colliculus supérieur (SC) est un centre visuel important chez tous les vertébrés. Chez les mammifères, il reçoit des entrées directes de la rétine et du cortex visuel1. Alors que l’enregistrement optique a été largement appliqué au cortex 2,3,4,5, son application dans le SC est entravée par de mauvais accès optiques 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 ,18,19. L’objectif de ce protocole est de fournir des détails sur deux méthodes complémentaires d’enregistrement optique de l’activité neuronale dans le CS.

Le SC est situé sous le cortex et le sinus transverse, ce qui limite l’accès optique aux neurones colliculaires. Une approche pour surmonter cette limitation est d’aspirer le cortex superposé et d’exposer le SC antéro-latéral 7,9,10,13,14,19. Cependant, comme le SC reçoit des entrées corticales, une telle opération peut affecter la façon dont les neurones du SC répondent aux stimuli visuels. Pour pallier cette limitation, nous détaillons ici un protocole alternatif permettant d’imager la couche superficielle du SC postérieur-médial avec un bouchon en silicone, tout en laissant le cortex intact 8,11. Plus précisément, pour obtenir une résolution unicellulaire, nous avons appliqué la microscopie à deux photons pour imager les réponses calciques dans le SC postérieur-médial de souris de type sauvage. De plus, pour obtenir une large couverture, nous avons appliqué la microscopie à grand champ pour imager l’ensemble du SC d’une souris mutante dont le cortex postérieur ne s’est pas développé20.

Les deux méthodes décrites dans ce protocole sont complémentaires l’une de l’autre. L’imagerie calcique à deux photons sans ablation du cortex est appropriée pour enregistrer l’activité neuronale à une résolution de cellule unique avec des entrées corticales intactes. L’imagerie calcique à grand champ est appropriée pour enregistrer l’activité neuronale dans l’ensemble du SC tout en sacrifiant la résolution spatiale.

Protocol

Toutes les procédures expérimentales ont été réalisées conformément aux directives sur le bien-être animal et approuvées par l’IACUC de l’Institut chinois de recherche sur le cerveau de Beijing. REMARQUE : L’échéancier de ce protocole est le suivant : 1) faire la ventouse ; 2) injecter le virus ; 3) implanter la plaque de tête ; 4) après 3 semaines, implantez le bouchon ; 5) Après une récupération et une accoutumance de ~3 jours sur le tapis roulant, effectuez une i…

Representative Results

Les figures 1A et B montrent comment fabriquer respectivement la ventouse et les bouchons. La figure 2 montre comment implanter le bouchon avec succès. Après l’implantation du bouchon, le CS postérieur-médial est exposé, comme le montre la figure 2D. La figure 3 montre les réponses calciques des neurones SC d’un exemple de souris de type sauvage imagé à l’aide de la micros…

Discussion

Étapes critiques du protocole
L’étape la plus critique est la craniotomie aux étapes 5.2 et 5.3. Tout d’abord, l’os à 0,5 mm en arrière de la lambda est épais et contient des vaisseaux sanguins, ce qui peut provoquer des saignements pendant le processus de forage. Une mousse de gel adéquate doit être préparée pour arrêter le saignement. Deuxièmement, il y a un bon risque d’angiorrhexie lors de l’ablation de l’os juste au-dessus du sinus transverse. Pour le dépannage, une autre…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ces travaux sont soutenus par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32271060). Y.-t.L. a conçu la recherche, réalisé l’expérience, analysé les données et rédigé le manuscrit. Z.L. et R.W. ont réalisé l’expérience.

Materials

16x objective Nikon
50-mm lens Computar M5018-MP2
5-mm coverslip Warner instruments CS-5R
bandpass filter Chroma Technology HQ575/250 m-2p
butyl cyanoacrylate Vetbond, World Precision Instruments
camera for monitoring pupil FLIR BFS-U3-04S2M-CS
camera for widefield imaging Basler acA2000-165µm
corona treater Electro-Technic Products BD-20AC
dichroic Chroma Technology T600/200dcrb 
galvanometers Cambridge Technology
glass bead sterilizer RWD RS1502
microdrill RWD 78001
micromanipulator Sutter Instruments QUAD
photomultiplier tube Hamamatsu R3896
rotory encoder USdigital MA3-A10-125-N
self-curing dental adhesive resin cement  SuperBond C&B, Sun Medical Co, Ltd. Moriyama, Japan
thermostatic heating pad  RWD 69020
Ti:Sapphire laser Spectra-Physics Mai Tai HP DeepSee
translucent silicone adhesive  Kwik-Sil, World Precision Instruments
treadmill Xinglin Biology
Virus Strains
rAAV2/9-hsyn-Gcamp6m Vector Core at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Animals
C57BL/6J wild type Laboratory Animal Resource Center at Chinese Institute for Brain Research, Beijing
Emx1-Cre The Jackson Laboratory  5628
Pals1flox/wt Christopher A. Walsh Lab
Software
ImageJ NIH Image
Labview National Instruments
MATLAB Mathworks

References

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Cite This Article
Li, Z., Wu, R., Li, Y. Calcium Imaging in Mouse Superior Colliculus. J. Vis. Exp. (194), e65181, doi:10.3791/65181 (2023).

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